一种橡胶树泛素基因启动子proHbUBI3及其克隆与应用

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种橡胶树内源组成型启动子，更具体涉及一种橡胶树泛素基因的启动子prohbubi3，并进一步公开其克隆方法及应用。

背景技术：

巴西橡胶树(heveabrasiliensis)是一种重要的经济作物，是天然橡胶的唯一地商业化来源。橡胶树作为一种多年生异花授粉树种，幼龄期较长，多通过传统的杂交育种进行遗传改良，但由于橡胶树本身生长较为缓慢，导致了常规育种存在效率低、周期长的问题，这严重地阻碍了橡胶树育种的进程。随着生物技术的发展，分子育种技术在橡胶树中的应用加快了橡胶树新品种的培育，并已发展出诸如农杆菌介导或基因枪等多种转化方法将外源基因导入橡胶树基因组用于橡胶树的遗传改良，从而提高橡胶树的产量、增强抗病和耐环境胁迫能力、以及改善胶乳质量等重要性状。

在目前已知的所有植物转基因体系中，启动子是驱动选择标记和目标基因表达的重要元件，它决定着下游基因的表达水平从而影响转基因体系的筛选和再生效率以及最终转基因株系的表现。目前已证实，从花椰菜花叶病毒中分离得到的一种组成型35s启动子(camv35s)是橡胶树稳定和瞬时转化体系中的应用最广泛的组成型启动子，它具有很强的转录活性，能够在转基因植株的整个生命周期内在大多数组织中驱动下游基因的表达。近年来，随着橡胶树基因功能研究以及基因编辑体系的逐渐深入，很多情况下需要在转基因株系中同时过表达多个外源基因以产生目标性状，也需要同时启动报告基因、抗性基因等筛选标记的表达以提高转基因体系的筛选和再生效率。然而，大量研究表明，当在转基因作物中重复使用35s启动子驱动表达多个外源基因时，启动子区域的序列同源性会诱发35s启动子甲基化，从而抑制下游基因的表达(kanazawa等，2007，plantmolecularbiology43,243-260.；muskens等，2000，plantcellreports29,513-522.)。由此可见，缺少可用的内源组成型启动子已成为限制橡胶树多基因转化体系的重要因素。

泛素(ubiquitin)是一类高度保守的小分子蛋白，广泛存在于植物中。据报道，泛素基因的启动子在植物中具有持久且高水平的转录活性，同时具有甲基化程度低、遗传性状稳定等优点。在水稻、大豆等多种作物的遗传转化体系中，内源组成型的泛素基因启动子已得到广泛地鉴定和应用，并代替35s启动子驱动外源基因的表达。目前在橡胶树中，则尚未有内源的组成型泛素基因启动子应用于橡胶树遗传转化体系的报道。因此，如何在橡胶树基因组中筛选得到高度保守的橡胶树泛素基因，对于橡胶树的基因育种技术发展具有积极的意义。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种橡胶树泛素基因启动子prohbubi3，并进一步公开其克隆方法及应用。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种橡胶树泛素基因启动子prohbubi3，所述启动子prohbubi3包括如seqidno：1所示的dna核苷酸序列。

优选的，所述启动子prohbubi3的dna核苷酸序列如seqidno：1所示。

本发明还公开了一种表达载体，含有所述的橡胶树泛素基因启动子prohbubi3。

本发明还公开了一种瞬时表达载体，所述瞬时表达载体为重组质粒prohbubi3-163hgfp。

本发明还公开了一种稳定转化表达载体，所述稳定转化表达载体为重组质粒prohbubi3-hgfp-pc3301。

本发明还公开了一种克隆所述橡胶树泛素基因启动子prohbubi3的方法，包括如下步骤：

(1)以橡胶树泛素基因hbubi3基因为模板，设计如下引物：

prohbubi3-f：gcaagtgctagccaccgaag；

prohbubi3-r：ctgtttagaagaaataaacc；

(2)使用kodfx酶进行pcr扩增；

(3)将扩增产物ta克隆到pmd19-t载体上，转化大肠杆菌dh5α中并挑单克隆测序，即得。

本发明还公开了一种构建所述瞬时表达载体的方法，所述瞬时表达载体prohbubi3-163hgfp的构建方法包括将所述启动子prohbubi3构建到瞬时表达载体pjit163-hgfp中，以替换掉该载体上的2×35s启动子的步骤，具体包括如下步骤：

(1)设计如下引物分别在prohbubi3序列5’和3’端引入saci和ncoi酶切位点，引物设计如下：

prohbubi3-sf：agcgagctcgcaagtgctagccaccgaag；

prohbubi3-nr：atgccatggctgtttagaagaaataaacc；

(2)同时用saci和ncoi双酶切扩增得到的启动子片段和pjit163-hgfp载体，分别回收1392bp启动子prohbubi3和3671bp载体骨架片段；

(2)使用t4dna连接酶将prohbubi3启动子连接到pjit163-hgfp载体的绿色荧光蛋白基因hgfp上游，即得所需重组质粒prohbubi3-163hgfp。

本发明还公开了一种构建所述稳定转化表达载体的方法，所述稳定转化表达载体prohbubi3-hgfp-pc3301的构建方法包括将所述瞬时表达载体prohbubi3-163hgfp上的prohbubi3::hgfp表达框构建到稳定转化载体pcambia3301上的步骤；具体包括如下步骤：

(1)设计如下引物分别在prohbubi3::hgfp表达框5’和3’端引入saci和psti酶切位点，引物设计如下：

prohbubi3-sf：agcgagctcgcaagtgctagccaccgaag；

camvt-pr：ccctgcagcggtgtgagggaactag；

(2)以所述瞬时表达载体prohbubi3-163hgfp质粒dna为模板，使用kodfx酶进行pcr扩增；纯化回收扩增产物，并同时用saci和psti双酶切扩增得到的prohbubi3::hgfp表达框片段和pcambia3301载体质粒，分别回收2853bpprohbubi3::hgfp表达框和11275bp线性pcambia3301载体骨架片段；

(3)使用t4dna连接酶将prohbubi3::hgfp表达框连接到pcambia3301载体的多克隆位点区，得到所需稳定转化表达载体prohbubi3-hgfp-pc3301。

本发明还公开了一种对橡胶树进行遗传转化的方法，包括将所述瞬时表达载体导入橡胶树原生质体的步骤，或者，将所述稳定转化表达载体导入橡胶树次生体胚的步骤。

本发明还公开了一种所述橡胶树泛素基因启动子prohbubi3，或者，所述表达载体，或者，所述瞬时表达载体，或者，所述稳定转化表达载体在橡胶树分子育种技术领域中的应用。

本发明方案通过核苷酸序列比对在巴西橡胶树基因组中筛选得到高度保守的橡胶树泛素基因，将其命名为hbubi3，该基因在橡胶树不同发育时期的多个组织中均有较高的表达水平，表明其启动子具有高效转录活性，可以驱动下游基因组成型表达。

本发明通过克隆hbubi3基因起始密码子atg上游启动子，首次在巴西橡胶树中获得橡胶树泛素基因启动子prohbubi3，该启动子为橡胶树内源组成型启动子，该启动子在橡胶树不同发育时期的多个组织中均具有高效转录活性，可用于驱动外源基因的表达。

本发明通过将所述启动子prohbubi3构建到植物表达载体的绿色荧光蛋白基因(gfp)上游，分别获得瞬时表达载体和稳定转化表达载体，并分别通过瞬时转化橡胶树原生质体和稳定转化橡胶树胚状体验证了该启动子的活性及其应用于橡胶树遗传转化体系的可行性，在转基因橡胶树原生质体和胚中，prohbubi3启动子均能够高效驱动gfp的表达而发出绿色荧光。这些结果表明，所述启动子prohbubi3具有较强的转录活性，够驱动外源gfp报告基因在橡胶树组织中稳定表达，显示该启动子可应用于橡胶树转基因体系及遗传转化体系，从而实现对橡胶树高效精准的品种改良。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为橡胶树hbubi3基因与水稻osubi10基因编码区核苷酸序列比对；

图2为橡胶树hbubi3基因在不同树龄橡胶树叶片和胶乳中的表达水平(fpkm)；

图3为橡胶树hbubi3基因的结构图；

图4为橡胶树hbubi3基因启动子的克隆电泳图，可见经pcr扩增得到了1380bp的hbubi3基因启动子片段；

图5中(a)为橡胶树瞬时表达载体prohbubi3-163hgfp的结构图，图5中(b)为橡胶树稳定转化载体prohbubi3-hgfp-pc3301结构图；

图6为peg介导的橡胶树原生质体瞬时转化体系中prohbubi3启动子转录活性验证结果；

图7为农杆菌介导的橡胶树体胚稳定转化体系中prohbubi3启动子转录活性验证结果。

具体实施方式

本发明下述实施例中涉及的方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明下述实施例中，使用的瞬时转化载体pjit163-hgfp由中国水稻所王克剑课题组惠赠，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其他用途使用。

实施例1巴西橡胶树泛素基因启动子prohbubi3的获得

以水稻osubi10基因(genebank登录号：xm_015769228.1)的全长cds序列为参考，搜索橡胶树基因组数据库，通过同源比对的方式找到一个同源性大于80％的橡胶树泛素基因(genebank登录号：xm_021784022.1)，将其命名为hbubi3。橡胶树hbubi3基因与水稻osubi10基因编码区核苷酸序列比对如图1所示，结果表明，与水稻osubi10相比，橡胶树hbubi3基因编码区较短且具有极高的序列同源性。

利用我们前期获得的橡胶树叶片和胶乳转录组数据，获取hbubi3基因的表达模式，发现该基因在不同树龄橡胶树品系热研7-33-97和rrim600的叶片和胶乳中均有较高的表达水平(如图2所示)，可见，该基因在橡胶树不同发育时期的多个组织均具有较高的转录活性，进一步表明，该基因的启动子prohbubi3具有较高的转录活性，可用于橡胶树转基因。

进一步分析该基因结构，如图3为橡胶树hbubi3基因的结构图，可见，该基因翻译起始位点atg上游有一段内含子序列区，这与目前所知的大部分泛素基因的结构相一致，表明其具有典型泛素基因启动子的结构特征，同时，其启动子区存在大量的caat-box、tata-box核心元件及myb、myc调控序列。有研究表明，泛素基因的第一个内含子对于促进该基因高水平表达具有重要作用(hernandez-garcia等，2009，plantcellreports,28(5),837-849.)。

因此，设计特异引物克隆hbubi3基因atg上游包含第一个内含子和5’utr在内的启动子区1380bpdna片段：

prohbubi3-f：gcaagtgctagccaccgaag；

prohbubi3-r：ctgtttagaagaaataaacc。

以巴西橡胶树热研7-33-97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育)叶片基因组dna为模板，以上述设计的prohbubi3-f和prohbubi3-r为引物，使用kodfx酶(toyobo)在20μl反应体系中进行pcr扩增，具体的反应程序为：95℃预变性2min，98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环，72℃终延伸5min。

将扩增产物ta克隆到pmd19-t载体上，转化大肠杆菌dh5α中并挑取重组载体单克隆测序，电泳结果如图4所示。可见，经pcr扩增得到了1380bp如seqidno：1所示的橡胶树hbubi3基因启动子dna片段prohbubi3。

实施例2橡胶树瞬时表达载体的构建

本实施例将获得的启动子prohbubi3构建到瞬时表达载体pjit163-hgfp上，以替换掉该载体上的2×35s启动子，具体包括如下步骤：

(1)设计如下引物分别在prohbubi3序列5’和3’端引入saci和ncoi酶切位点，引物设计如下：

prohbubi3-sf：agcgagctcgcaagtgctagccaccgaag；

prohbubi3-nr：atgccatggctgtttagaagaaataaacc；

(2)以橡胶树基因组dna为模板，使用kodfx酶(toyobo)在20μl反应体系中进行pcr扩增，具体反应程序为：95℃预变性2min，98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环，72℃终延伸5min；纯化回收扩增产物，同时用saci和ncoi双酶切扩增得到的启动子片段和pjit163-hgfp载体，分别回收1392bp启动子prohbubi3和3671bp载体骨架片段；

(3)参照说明书，使用t4dna连接酶(neb)将prohbubi3启动子连接到pjit163-hgfp载体的绿色荧光蛋白基因hgfp上游，即得到所需瞬时表达载体prohbubi3-163hgfp，所述载体的结构图如图5中(a)所示。实施例3橡胶树稳定转化表达载体的构建

本实施例将启动子prohbubi3构建到稳定转化表达载体pcambia3301，具体是进一步通过将实施例2中制备的所述瞬时表达载体prohbubi3-163hgfp上的prohbubi3::hgfp表达框构建到所述稳定转化载体pcambia3301上，具体包括如下步骤：

(1)设计引物分别在prohbubi3::hgfp表达框5’和3’端引入saci和psti酶切位点，引物设计如下：

prohbubi3-sf：agcgagctcgcaagtgctagccaccgaag；

camvt-pr：ccctgcagcggtgtgagggaactag。

(2)以制备的prohbubi3-163hgfp质粒dna为模板，使用kodfx酶(toyobo)在20μl反应体系中进行pcr扩增；具体反应程序为：95℃预变性2min，98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸3min，35个循环，72℃终延伸5min；纯化回收扩增产物，同时用saci和psti双酶切扩增得到的prohbubi3::hgfp表达框片段和pcambia3301载体质粒，分别回收2853bpprohbubi3::hgfp表达框和11275bp线性pcambia3301载体骨架片段；

(3)参照说明书，使用t4dna连接酶(neb)将prohbubi3::hgfp表达框连接到pcambia3301载体的多克隆位点区，得到所需稳定转化表达载体prohbubi3-hgfp-pc3301，所述载体的结构图如图5中(b)所示。实施例4瞬时表达载体在橡胶树的转化

本实施例为了验证所述prohbubi3启动子的活性，首先通过peg介导将所述瞬时表达载体prohbubi3-163hgfp转化橡胶树叶肉细胞原生质体，以pjit163-hgfp载体作为阳性对照。

将一个月的橡胶树热研7-33-97组培苗转到26-28℃黑暗条件下培养5-7天，取2g变色期叶片立即于0.6m甘露醇溶液中浸泡10min后用于制备原生质体。原生质体的制备和的转化过程参照yoo等2007，natureprotocols，2:1565-1575.。将转化后的原生质体于26-28℃黑暗条件下培养24小时后，使用荧光显微镜观察gfp信号。

转录活性验证结果如图6所示，可见，所述转prohbubi3-163hgfp质粒的原生质体中具有较高的gfp表达水平，相同视野内的gfp荧光强度与转阳性对照pjit163-hgfp质粒的原生质体类似，这表明在橡胶树原生质体中，prohbubi3启动子与camv35s启动子类似，同样具有较高的转录活性。

实施例5稳定转化表达载体在橡胶树的转化

本实施例通过农杆菌介导prohbubi3-hgfp-pc3301表达载体转化橡胶树次生体胚，具体方法参照hua等(2010,plantbreeding129,202-207)所述方法。使用basta筛选后获得转基因阳性橡胶树胚后使用荧光显微镜观察gfp信号，明确prohbubi3启动子在橡胶树稳定转化中的转录活性。随后，通过gus染色分析35s启动子活性。结果如图7所示，转基因橡胶树胚状体中可以观察到较强gfp荧光信号，同时也能观察到较强的gus染色信号(深色部位)，并且gfp信号位置与gus染色重合。这些结果表明，在稳定转化的橡胶树组织中，与35s启动子驱动的gus相比，prohbubi3启动子同样具有高效转录活性，能够驱动gfp在转基因橡胶树体胚中稳定高效表达。

综上，本发明方案首次在巴西橡胶树中获得橡胶树组成型启动子prohbubi3，该启动子在橡胶树不同发育阶段的多个组织中均具有转录活性。本发明进一步通过分别将所述瞬时表达载体和稳定转化表达载体在橡胶树原生质体和胚状体中验证该启动子的转录活性，结果表明，所述启动子prohbubi3能够驱动外源gfp报告基因在橡胶树组织中稳定表达。因此，该启动子可应用于橡胶树转基因体系，从而实现对橡胶树高效精准的品种改良。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110>申请人中国热带农业科学院橡胶研究所

<120>一种橡胶树泛素基因启动子prohbubi3及其克隆与应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1380

<212>dna

<213>prohbubi3

<400>1

gcaagtgctagccaccgaagacttgaataacgtaacgccgacttcattccaaattaattt60

tcaataattcattgggcattttggtcattttggttggctacaagcgctataagagatccc120

caaccccaaagaaaatcttcacacaaccattcaaagctcagaattcagatctaaacgtaa180

tcaaatttctctcctctctctcaaggtaatcctttctcggttggctactgttcttttccc240

gatttggctattggaaatgattattagttattatttttgtttagattcttagatgattaa300

tctgattacgtgagaatttttactctctagtggtttttgtcgttcgttgattttgatttt360

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aaataaatggtattttctttttgttttgttttttttttttgttattgtttagatagaaag600

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taaaaaaaaaaatactttgaaaaaagatgatttgataattttaatgtataaagaacactt720

ttgttactttctcttcaattcaaattggagagaaaaccccctattttctcttcattttca780

aacaaggaaaagaaaaataacaatttattttctcttgtttattttcttttctctcccttt840

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aattttaacttattgttggcaaatgttcttcctttgttttgtagaagttcagtatatttt1080

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tttattatatttatatcaatttttttactgatctgttgaaattggatttagaacttatac1260

attgatctgccaaaacttgattagaagccccttttttttgtcattatgttctgttgtcaa1320

ggcttttaaacaaacaacaacaacaaagtcattgtgttttggtttatttcttctaaacag1380