慈姑CGAP2基因及其在重瓣花形成中的应用

慈姑cgap2基因及其在重瓣花形成中的应用
【技术领域】
1.本发明涉及植物基因技术领域，特别涉及慈姑cgap2基因及其在重瓣花形成中的应用。


背景技术：

2.慈姑是泽泻科(alismaceae)慈姑属(sagittaria.l)水生植物，目前对于该水生植物的研究并不多，在自然界中重瓣慈姑(sagittaria sagittifolia
‘
flore pleno’)为慈姑属慈姑种的自然变种。重瓣花表型具有花型大、花瓣多的形态特征，极具观赏价值。近年来，随着分子生物学相关技术的迅速发展，许多与重瓣花形成相关的基因被克隆，人们对重瓣花形成的机理有了更深的认识，但是重瓣花的形成是一个非常复杂的过程,重瓣花发育的分子调控机制尚不清楚。慈姑的重瓣花发育调控基因属于花发育模型中a类基因，目前尚未有关于调控慈姑花瓣属性的相关基因报道；实际上，在实际生产中由于慈姑的重瓣花形态：花型大、花瓣多具有极高的观赏价值而备受花艺爱好者的追捧，如果能定向获得重瓣花形态的慈姑植株，将能更好的丰富慈姑的种质资源，提高慈姑植株的观赏性，进一步提高慈姑的附加值。


技术实现要素：

3.鉴于上述内容，有必要对慈姑开花调控基因进行研究，将半重瓣花型慈姑植株定向改造成重瓣花型慈姑植株，提高慈姑的观赏价值，进一步提高慈姑的附加值，可为今后开展慈姑花的发育调控提供新的基因和参考。
4.为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
5.慈姑基因cgap2，所述基因cgap2的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。
6.本发明还包括荧光定量扩增所述慈姑基因cgap2的引物对，所述引物对的核苷酸上游序列如序列表seq id no.2所示，下游序列如序列表seq id no.3所示。
7.本发明还包括过表达载体，所述过表达载体上含有如权利要求1所述cgap2基因。
8.进一步的，所述方法为克隆获得cgap2基因的c dna序列后构建35s启动子驱动cgap2基因的过表达载体pbi121除过表达载体pbi121外，也可选择其他载体来构建含目的基因的过表达载体。
9.本发明还包括宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求3所述的过表达载体。
10.进一步的，所述方法为将所述的过表达载体转入根癌农杆菌中获得。
11.本发明还包括所述慈姑基因cgap2在诱导慈姑的由半重瓣花转化为重瓣花中的应用。
12.本发明还包括所述慈姑基因cgap2在慈姑的半重瓣花和重瓣花的花发育过程中表达分析的应用。
13.本发明还包括一种诱导慈姑花由半重瓣花转化为重瓣花瓣的方法，所述方法为：过表达如权利要求1所述的慈姑基因cgap2；具体包括将权利要求3所述的过表达载体转入
根癌农杆菌中转化半重瓣慈姑花芽分化初期的花序。
14.本发明具有如下有益效果：
15.本发明通过研究分析获得控制慈姑花生长发育的基因cgap2；通过进一步分析发现，该基因与慈姑重瓣花的形成有关，表现为，其在重瓣花型慈姑中的荧光定量表达量要远高于在半重瓣花型的荧光定量表达量，且在在花芽分化初期表达量的差异达到最大；根据上述结论，申请人构建过表达载体，然后利用根癌农杆菌将上述基因转染到半重瓣花型慈姑花芽分化初期的花序中，最终实验结果表明，通过过表达基因cgap2后，半重瓣花型慈姑花表现为花瓣更多、花瓣更大的重瓣花型慈姑花生理特性，从半重瓣花型慈姑花变成重瓣花型慈姑花；由此说明基因cgap2能有效改良半重瓣花型慈姑花的花瓣特性，提高慈姑花的观赏价值，为解析慈姑重瓣花的形成及其发育相关机制具有重要的影响，对于选育更多高品质的重瓣花新品种具有至关重要的理论和实践意义。
【附图说明】
16.图1是本发明实施例2半重瓣慈姑及其重瓣慈姑的cgap2基因荧光定量表达图；a为半重瓣型，b为重瓣型；
17.图2是cgap2基因表达载体的构建原理图；
18.图3是本发明实施例3半重瓣慈姑及其重瓣慈姑的cgap2基因荧光定量表达图；a为清水对照，b为空载对照，c为过表达处理；
19.图4是本发明实施例3半重瓣慈姑过表达cgap2基因后的性状表达图，其中图a为未转染过表达载体的半重瓣慈姑花，b为转染过表达载体后的重瓣慈姑花。
【具体实施方式】
20.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
21.实施例1：
22.慈姑基因cgap2，所述基因cgap2的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。
23.实施例2：
24.实施例1基因cgap2的对慈姑花调控的研究：
25.步骤s1：通过对基因cgap2的荧光定量分析，荧光分析中，使用的引物对为：上游引物序列：5'
‑
aaaccgcaatagcgaccg
‑
3'(序列表seq id no.2)；下游引物序列：5'
‑
ggctgccagaaccaatacctc
‑
3'(序列表seq id no.3)；结果如图1所示，图中，a为半重瓣型，b为重瓣型；横轴的花芽分化初期，中期，盛期，后期。结果显示：慈姑的cgap2基因在重瓣慈姑和半重瓣慈姑不同组织部位、花发育不同时期的表达情况均表现为重瓣慈姑的cgap2基因的表达量均高于半重瓣慈姑；且很明显的，在花芽分化初时期，该基因在两种花型的表达量最大，且重瓣型的表达量高于半重瓣型。
26.这初步表明基因cgap2可能是调控慈姑花瓣形态的基因。
27.实施例3：
28.对上述荧光结果进行转基因验证，方法如下：
29.步骤s1：取慈姑的花芽，提取rna并反转录为cdna；
30.步骤s2：利用常规扩增方法，将上述基因插入载体pbi 121中，其构建方法如图2所示；得到组合载体：pbi 121
‑
cgap2。
31.步骤s3：将构建好的表达载体pbi 121
‑
cgap2转入到根癌农杆菌中，转化半重瓣慈姑花芽分化初期的花序；对转化处理2d后的花序进行表型分析，并进行荧光定量pcr确认该基因的表达情况；以清水、空载(载体pbi 121，不含目的基因cgap2)为对照：其表达结果如图3所示：图中：a为清水对照，b为空载对照(载体pbi 121，不含目的基因cgap2)，c为过表达处理，花芽分化初期，中期，盛期，后期。结果显示：慈姑的cgap2基因过表达处理在慈姑不同组织部位、花发育不同时期的表达量均高于清水对照和空载对照；且很明显的，在花芽分化初时期(c4)慈姑的cgap2基因过表达处理其表达量与两对照组的差异达到最大，说明：慈姑cgap2基因的过表达能影响慈姑的花发育，特别是在花芽分化初期。
32.通过后续的性状观察发现，转基因后，对慈姑花影响最突出的表型在于对花序的影响上，其结果如图4所示，图4中a为未转染过表达载体的的半重瓣慈姑花，b为转染了过表达载体的半重瓣慈姑花；可见，过表达后，半重瓣慈姑花表现出重瓣慈姑花的表达性状：b组与a组相比，过表达cgap2基因后，雄蕊和雌蕊数量减少，花瓣数量明显变多，说明过表达cgap2基因可以使半重瓣型慈姑花序转为重瓣型花序。这与图1表达的一致，cgap2基因在花芽分化初期的表达量达到最高。
33.实施例4：
34.对实施例3几组实验的慈姑盛花期性状进行表型分析：
35.盛花期时，计数半重瓣与重瓣花的舌状花、过渡花和盘花的花瓣数，每种花型计数10朵花。测量边缘舌花和过渡花长度、宽度，观察盘花发育情况。花瓣的长度为花尖端到基部的纵向最长长度，宽度所测部位为与花瓣长垂直的横向最宽处。各实验重复三次，每次测量至少10个花瓣。
36.表1过表达cgap2基因后慈姑花花瓣的差异
37.性状清水对照(mm)空载对照(mm)过表达(mm)长12.4
±
0.56bb12.7
±
0.44bb15
±
0.67aa宽2.6
±
0.086bb2.63
±
0.072bb8.4
±
0.32aa
38.从表1可知，清水对照和空载对照的慈姑花花瓣并无显著差异，仍表现为半重瓣慈姑花的表型；而过表达后，慈姑花的花瓣表现出更长、更宽的重瓣慈姑花的表型。
39.表2过表达cgap2基因后慈姑花花瓣的差异后半重瓣花序花瓣数的差异
40.部位清水对照(个)空载对照(个)过表达(个)舌花15bb14bb8aa过渡花3bb4bb10aa盘花5bb3bb33aa
41.从表2可以看出，清水对照和空载对照的慈姑花中：舌花、过渡花、盘花其个数并无显著差异；而过表达后，慈姑的过渡花、盘花个数均高于对照组；舌花个数显著低于对照组而且达到显著水平。
42.综上所述，基因cgap2可影响慈姑花的形态，半重瓣型慈姑经过过表达cgap2基因
可达到重瓣型慈姑的表型，重瓣型慈姑的花表现出花瓣更多、更大更具有观赏价值的优势，是一种优良的观赏植物。而后期通过基因调控，可认为获得更多的重瓣型慈姑，为解析慈姑重瓣花的形成及其发育相关机制具有重要的影响，对于选育更多高品质的重瓣花新品种具有至关重要的理论和实践意义。
43.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。