新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体、构建方法及试剂盒与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体、构建方法及试剂盒。


背景技术：

2.目前，毕赤酵母pichia pastoris目前已是仅次于大肠杆菌的最常用蛋白表达系统，广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到成功地表达。经过这么多年的发展，毕赤酵母表达载体已经被广泛的应用于食品、医药和工业酶制剂领域，是一种非常重要的重组蛋白表达系统。毕赤酵母表达系统的优点主要包括：1.适用于清晰基因背景的多种翻译后修饰；2.在已知成分培养基中可以快速生长；3.极易使用，相比哺乳动物细胞更加便宜；4.容易进行高密度培养和发酵，表达量高。
3.毕赤酵母菌体内没有天然质粒存在，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达，可以保持基因稳定性并且可以产生多种拷贝数的基因。但是单拷贝数的重组菌株常常表达量较低，一般是通过提高外源基因在毕赤酵母中的拷贝数来提高目的蛋白的表达水平，并且使用下述3种方法：1.在表达载体中插入首尾相连的多拷贝阅读框；2.载体中插入kan基因，g418抗性水平与基因拷贝数呈线性关系；3.载体中插入shble基因(博来霉素)，该基因在大肠和酵母中都可以表达和起生物学功能，且在酵母中抗性水平和基因拷贝数呈线性关系。
4.常用的多拷贝质粒是ppic9k和ppicza，其中ppic9k载体带有kan基因，可以使用g418筛选，但是本身较大，有9000bp多大小，在体外进行多拷贝构建的分子生物学操作比较繁琐和不方便；而ppiczaa载体较小，只有3600bp大小，但是该载体使用的是博来霉素，博来霉素价格昂贵而且在转化筛选过程中经常出现生长不均一的菌落，俗称大小斑，给克隆筛选工作带来非常大的难度。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
6.(1)现有技术中，载体骨架不便于后续的分子克隆操作实验效率。
7.(2)现有技术中，博来霉素价格昂贵而且在转化筛选过程中经常出现生长不均一的菌落，俗称大小斑，给克隆筛选工作带来非常大的难度。
8.(3)现有技术中，大规模发酵中不能显著提高蛋白表达量。
9.(4)现有技术中，载体不能让后续分离纯化工作简单快捷，造成纯化费用高。
10.解决以上问题及缺陷的难度为：
11.(1)寻找合适的手段将酵母载体改造成适当大小；
12.(2)进行载体的部分原件的有效替换，使之更利于酵母重组子的筛选和转化。
13.解决以上问题及缺陷的意义为：
14.(1)酵母载体小型化，更利于分子生物学操作；
15.(2)不用博来霉素，降低成本，解决大小斑问题；
16.(3)改变启动子强度，提高蛋白表达量；
17.(4)提高多拷贝载体的构建效率和成功率。


技术实现要素：

18.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体、构建方法及试剂盒。
19.本发明是这样实现的，一种新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体，所述新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体的dna的序列为seq id no：1。
20.所述seq id no：1来源于ppiczaa，片长低于4k。
21.本发明的另一目的在于提供一种卡那霉素，所述卡那霉素的dna的序列为seq id no：2；所述卡那霉素为为seq id no：1中筛选。
22.所述seq id no：2序列n端带上bamhi和spei酶切位点以及与载体骨架同源的20bp序列；序列c端带上mlui酶切位点以及以及与载体骨架同源的20bp序列；酶切位点dna的序列为seq id no：3；
23.同源臂dna的序列为seq id no：4。
24.本发明的另一目的在于提供一种bdm启动子，所述bdm启动子的dna的序列为seq id no：5。
25.本发明的另一目的在于提供一种mf4i信号肽，所述mf4i信号肽的dna的序列为seq id no：6。
26.本发明的另一目的在于提供一种多克隆位点区，所述多克隆位点区的dna的序列为seq id no：7。
27.本发明的另一目的在于提供一种新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体的构建的方法，所述新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体的构建的方法包括：
28.(1)将ppiczaa载体的博来霉素抗体换成kana霉素抗性；
29.(2)，kana orf序列与骨架载体的融合；
30.(3)将ppick载体的启动子和信号肽换成bdm启动子和mf4i信号肽；
31.(4)kana orf序列与骨架载体的融合。
32.步骤(1)包括：
33.(1.1)用bamhi和mlui双酶切ppiczaa载体，得到一大小为2495bp的载体骨架，序列如seq id no：1；
34.(1.2)全基因合成kana orf序列，序列n端带上bamhi和spei酶切位点以及与载体骨架同源的20bp序列；序列c端带上mlui酶切位点以及以及与载体骨架同源的20bp序列。合成的kana orf全序列如如seq id no：2；
35.所述步骤(2)中片段与载体的融合利用同源重组的方法，具体方法为：回收的载体骨架100ng，回收的kana orf片段300ng，neb gibson assembly master mix 5ul，总反应体系10ul，反应体系置于50℃反应1个小时后立即转化大肠杆菌top10感受态细胞，转化子经鉴定送测，测序正确的载体保存备用；
36.所述步骤(3)中，ppick载体用bglii和sali双酶切做载体骨架，得到一大小为2810bp的载体骨架；包括seq id no：3；同源臂dna的序列为seq id no：4；
37.所述步骤(4)包括：
38.(4.1)全基因合成bdm启动、mf4i信号肽以及mcs区域全序列，在序列c端带上与ppick载体骨架同源的20bp序列，在序列n端同样带上与ppick载体另一端同源的20bp序列；包括：seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7；
39.(4.2)kana orf序列与骨架载体的融合，片段与载体的融合利用同源重组的方法，具体方法为：回收的ppick载体骨架150ng，回收的bdm
‑
mf4i
‑
mcs片段450ng，neb gibson assembly master mix 5ul，总反应体系10ul，反应体系置于50℃反应1个小时后立即转化大肠杆菌top10感受态细胞，转化子经鉴定送测，测序正确的载体即为ppick
‑
bdm。
40.本发明的另一目的在于提供一种试剂盒，所述试剂盒包含的序列seq id no：1～seq id no：7。
41.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
42.载体骨架来源于ppiczaa，最终载体骨架仅为4k左右，便于后续的分子克隆操作实验效率。
43.原核中筛选抗性为卡那霉素，不同于ppiczaa载体的博来霉素抗性，博来霉素价格昂贵而且在转化筛选过程中经常出现生长不均一的菌落，俗称大小斑，给克隆筛选工作带来非常大的难度。
44.载体选用经验证能显著提高蛋白发酵表达量的突变型aox启动子，特别是大规模发酵中能显著提高蛋白表达量。
45.载体选用mf4i信号肽，能高效分泌表达目的蛋白，让后续分离纯化工作简单快捷，进一步节省纯化费用。
46.载体能利用生物砖原理，体外高效构建目的蛋白多拷贝表达载体，显著提高蛋白表达量，在生产过程过有非常大的优势。
附图说明
47.为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
48.图1是本发明实施例提供的载体构建的流程图。
49.图2是本发明实施例提供的mph
‑
r酵母重组菌株摇瓶诱导上清液的sds
‑
page检测图。
50.图3是本发明实施例提供的l
‑
氨基酸氧化酶(laao)在毕赤酵母中的表达图。
51.图4是本发明实施例提供的l
‑
谷氨酸氧化酶(lgox)在毕赤酵母中的表达图。
具体实施方式
52.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
53.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型实用的毕赤酵母分泌性表达载
体，下面结合附图对本发明作详细的描述。
54.下面结合实施例对本发明作进一步描述。
55.实施例
56.将ppiczaa载体的博来霉素抗体换成kana霉素抗性
57.(1)用bamhi和mlui双酶切ppiczaa载体，得到一大小为2495bp的载体骨架，序列如下seq id no：1：
58.cgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatcagatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattcgaaacgatgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctgaagctgaattcacgtggcccagccggccgtctcggatcggtacctcgagccgcggcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcg
59.(2)全基因合成kana orf序列，序列n端带上bamhi和spei酶切位点以及与载体骨架同源的20bp序列；序列c端带上mlui酶切位点以及以及与载体骨架同源的20bp序列。合成的kana orf全序列如下seq id no：2：(灰色高亮标记的为酶切位点(seq id no：3actag、ggatcc、acgcgt)，小写序列为同源臂(seq id no：4 aagtgagaccttcgtttgtg以及gtacgcatgtaacattatac))
60.aagtgagaccttcgtttgtgactagttcgacccaatggatcccgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccgacctgcaggggggggggggaaagccacgttgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggacggcggctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttgaaggatcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaaaagttcaaaatcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtcagcaacaccttcttcacgaggcagacctcagcgccccccccccccctgcaggtcggccacgatgcgtccggcgtagaggatctcctgatgactgactcactgataataaaaatacggcttcagaatttctcaagactacactcactgtccgacttcaagtacgcgtgtacgcatgtaacattatac
61.在本发明中，全基因合成所用到的引物为(所有引物均为5
’‑3’
)：
62.kana orf
‑163.aagtgagaccttcgtttgtgactagttcgacccaatggatcccgctctcccttatgcga
64.kana orf
‑265.gcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcg
66.kana orf
‑367.cagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaag
68.kana orf
‑469.ggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattcc
70.kana orf
‑571.ccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtg
72.kana orf
‑673.atatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgag
74.kana orf
‑775.ggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccg
76.kana orf
‑877.tttgagacacaacgtggctttcccccccccccctgcaggtcggcatcaccggcgcca
78.kana orf
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80.kana orf
‑
10
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12
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86.kana orf
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90.kana orf
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15
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92.kana orf
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16
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94.kana orf
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96.kana orf
‑
18
97.ctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatca
98.kana orf
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19
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100.kana orf
‑
20
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102.kana orf
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21
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104.kana orf
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22
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106.kana orf
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23
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108.kana orf
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24
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110.kana orf
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25
111.accggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgagg
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114.kana orf
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29
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120.kana orf
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126.kana orf
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34
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130.kana orf
‑
35
131.tccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatgg
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36
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134.kana orf
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37
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136.kana orf
‑
38
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138.kana orf
‑
39
139.tgatgactgactcactgataataaaaatacggcttcagaatttctcaagactacactca
140.kana orf
‑
40
141.gtataatgttacatgcgtacacgcgtacttgaagtcggacagtgagtgtagtcttgaga
142.在本发明中，kana orf序列与骨架载体的融合。
143.本实验中片段与载体的融合利用同源重组的方法，具体方法为：回收的载体骨架100ng，回收的kana orf片段300ng，neb gibson assembly master mix 5ul，总反应体系10ul，反应体系置于50℃反应1个小时后立即转化大肠杆菌top10感受态细胞，转化子经鉴定送测，测序正确的载体(本文中标记为ppick)保存备用。
144.下面结合ppick载体的启动子和信号肽换成bdm启动子和mf4i信号肽对本发明作进一步描述。
145.在本发明中，将ppick载体的启动子和信号肽换成bdm启动子和mf4i信号肽。
146.ppick载体用bglii和sali双酶切做载体骨架，得到一大小为2810bp的载体骨架，具体序列如下(是序列载体)seq id no：8：
147.catcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgactagttcgacccaatggatcccgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccgacctgcaggggggggggggaaagccacgttgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggacggcggctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttgaaggatcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaaaagttcaaaatcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtcagcaacaccttcttcacgaggcagacctcagcgccccccccccccctgcaggtcggccacgatgcgtccggcgtagaggatctcctgatgactgactcactgataataaaaatacggcttcagaatttctcaagactacactcactgtccgacttcaagtacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatctctaga
148.(1)全基因合成bdm启动、mf4i信号肽以及mcs区域全序列，在序列c端带上与ppick载体骨架同源的20bp序列，在序列n端同样带上与ppick载体另一端同源的20bp序列。合成的全序列如下：(浅灰标记为bdm启动子
149.seq id no：5(aacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcgccataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagttgttgatcttgactacttttaacgataacttgagaagatctaagaacaactaactgtttgaaactatggctattccaagattt)，深灰标记的为mf4i信号肽序列seq id no：6(ccatctatctttatagctgtcttgtttgctgcatcttctgctttggctgctccagttaacactactactgaagatgaaactgctcaaattccagctgaggctgttattggttactctgatttggaaggtgattttgatgttgctgttttgccattttctaactctactaacaacggtttgttagaggaagccgaggctgaagctgaaccaaagttcattaatactactattgcctctattgctgctaaggaagaaggtgtttctttggaa)，浅灰标记的是多克隆位点区(seq id no：7gaattcattggggtacctcgagccgcggccgcccaatgtcgac)，小写序列是同源臂(ttggtcatgagatctctaga以及catcatcatcatcatcattga)
150.ttggtcatgagatctctagaaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcgccataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagttgttgatcttgactacttttaacgataacttgagaagatctaagaacaactaactgtttgaaactatggctattccaagatttccatctatctttatagctgtcttgtttgctgcatcttctgctttggctgctccagttaacactactactgaagatgaaactgctcaaattccagctgaggctgttattggttactctgatttggaaggtgattttgatgttgctgttttgccattttctaactctactaacaacggtttgttagaggaagccgaggctgaagctgaaccaaagttcattaatactactattgcctctattgctgctaaggaagaaggtgtttctttggaagaattcattggggtacctcgagccgcggccgcccaatgtcga
ccatcatcatcatcatcattga
151.在本发明中，全基因合成所用到的引物为(所有引物均为5
’‑3’
)：
152.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑1153.ttggtcatgagatctctagaaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgcc
154.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
2ggcacttatgtgtgagaatggacctgtggatgtcggatggcaaaaaggtttcattbdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑3155.tctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgtt
156.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑4157.ggtgttgaggagaagaggagtggaggtcctgcgtttgcaacggtctgctgctagt
158.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
5ctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggct
159.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
6gcctaatagaaggaattggaatgagcgagctccaatcaagcccaataactgggctbdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
7aattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggc
160.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑8161.gcattcggaaataaacaaacatgaacctcgccaggggggccaggatagacaggct
162.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
9tgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatg
163.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
10gaacatgaaactatttgaccccacactcagaaagccctcatctggagtgatgttcbdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
11caaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtctt
164.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
12atcttggatgagatcacgcttttgtcatattaggttccaagacagcgtttaaact
165.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
13gtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagtt
166.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
14caaacggtatggcgacttttggaagtttctttttgaccaactggccgttagcatt
167.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
15
168.agtcgccataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatct
169.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
16
170.cggggttcagaagcgatagagagactgcgctaagcattaatgagattatttttgagcat
171.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
17
172.atcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttt
173.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
18
174.atcttggaagcatacaatgtggagacaatgcataatcatccaaaaagcgggtgtttccc
175.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
19
176.ttgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaa
177.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
20
178.tgtttatatattgctgtcaagtaggggttagaacagttaaattttgatcatgaacgtta
179.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
21
180.acagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcat
181.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
22
182.ttgtcaattggaaccagtcgcaattatgaaagtaagctaataatgatgataaaaaaaaa
183.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
23
184.ctggttccaattgacaagttgttgatcttgactacttttaacgataacttgagaagatc
185.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
24
186.aatcttggaatagccatagtttcaaacagttagttgttcttagatcttctcaagttatc
187.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
25
188.atggctattccaagatttccatctatctttatagctgtcttgtttgctgcatcttctgc
189.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
26
190.gcagtttcatcttcagtagtagtgttaactggagcagccaaagcagaagatgcagcaaa
191.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
27
192.actgaagatgaaactgctcaaattccagctgaggctgttattggttactctgatttgga
193.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
28
194.gtagagttagaaaatggcaaaacagcaacatcaaaatcaccttccaaatcagagtaacc
195.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
29
196.ccattttctaactctactaacaacggtttgttagaggaagccgaggctgaagctgaacc
197.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
30
198.tccttagcagcaatagaggcaatagtagtattaatgaactttggttcagcttcagcctc
199.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
31
200.tctattgctgctaaggaagaaggtgtttctttggaagaattcattggggtacctcgagc
201.bdm
‑
mf4i
‑
mcs
‑
32tcaatgatgatgatgatgatggtcgacattgggcggccgcggctcgaggtaccccaat
202.(2)kana orf序列与骨架载体的融合。
203.载体构建的流程图1(本实验中片段与载体的融合利用同源重组的方法)，具体方法为：
204.s101，回收ppick载体骨架150ng；
205.s102，回收bdm
‑
mf4i
‑
mcs片段450ng，neb gibson assembly master mix 5ul，总反应体系10ul，反应体系置于50℃反应1个小时后立即转化大肠杆菌top10感受态细胞；
206.s103，转化子经鉴定送测，测序正确的载体即为ppick
‑
bdm。
207.下面结合具体实施例对本发明地技术方案作进一步描述。
208.实施案例1
209.本实施例用于来源于邻单胞菌属中的一种甲基对硫磷水解酶mph(methyl parathion hydrolase)，该基因的genbank是aak14390.1。在ncbi中搜索mph的基因序列，去掉mph基因中的原始信号肽序列。翻译成氨基酸序列之后，根据毕赤酵母的密码子偏爱性在武汉金开瑞生物工程有限公司合成该基因，基因序列mph基因全长为912bp，共编码304个氨基酸。将合成好的基因克隆到ppick
‑
bdm表达型载体，得到ppick
‑
bdm
‑
mph。线性化酶切载体之后电转化毕赤酵母gs115感受态细胞。筛选出阳性菌落接种于bmgy培养基摇瓶发酵。在48小时甲醇诱导后，500ml摇瓶中mph
‑
r的表达水平增加至1.9u/ml，比酶活为15.8u/mg。且在5l基础盐高密度发酵培养基中表达量增加至18.4u/ml，将表达量再次提高了9.7倍。图2为mph
‑
r酵母重组菌株摇瓶诱导上清液的sds
‑
page检测图。
210.实施案例2
211.本实施通过毕赤酵母异源表密码子的偏爱性合成了北里孢菌(kitasatospora cheerisanensis)的l
‑
氨基酸氧化酶基因laao(genbank:wp_051653666.1)，并将该基因整合毕赤酵母表达载体ppick
‑
bdm上，挑选重组子。按照毕赤酵母诱导表达方法，诱导表达了该l
‑
氨基酸氧化酶(laao)，通过对发酵液中的laao进行酶活性质分析，结果显示，毕赤酵母异源表达的laao酶活为0.87u/ml，最适反应温度20℃，最适反应ph为6。
212.使用ppick
‑
bdm载体构建了laao基因的多拷贝质粒及菌株，并均实现了表达，通过对该酶的基因剂量效应研究发现，该基因有一定的基因剂量效应，2，3，4拷贝的kc
‑
laao较单拷贝的laao，通过摇瓶发酵比较酶活，发现酶活分别提高了1.89，2.47和3.06倍。通过分批补料发酵，使得菌体湿重和laao的酶活提高了5.15倍和45.24倍。高密度发酵策略提高了laao的生产效率。图3为l
‑
氨基酸氧化酶(laao)在毕赤酵母中的表达图。
213.实施案例3
214.本实施案例合成了加纳链霉菌(streptomyces ghanaenis atcc 14672)来源的l
‑
谷氨酸氧化酶基因(genbank:efe71695.1)，利用ppick
‑
bdm载体在体外实现了该基因多拷贝数质粒的构建并且电转化毕赤酵母，摇瓶实验结果表明多拷贝菌株的酶活相对于单拷贝有了大幅提高，多拷贝表达菌株p
‑
lgox2、p
‑
lgox3和p
‑
lgox4的发酵上清中lgox的酶活水平分别是单拷贝表达菌株p
‑
lgox1的1.75，2.41和2.75倍；后面采用4拷贝的重组菌株进行了高密度发酵实验，分别尝试了2种补料发酵工艺do
‑
stat和指数补料，采用do
‑
stat补料工艺，发酵结束时发酵结束时菌体湿重和酶活性最高分别达到386g/l和150.1u/ml，采用甘油和甲醇指数补料工艺，发酵结束时总酶活和单位生产效率最终达到247.8u/ml和2581u/l/h。
215.实施案例4l
‑
谷氨酸氧化酶(lgox)在毕赤酵母中的表达，如图4。
216.本实施使用ppick
‑
bdm载体将laao基因和lgox基因在毕赤酵母表面进行了展示，构建了多拷贝的表面展示载体，分别是pglod(1
‑
3)
‑
agα1和paao(1
‑
3)
‑
agα1，并将这些载体转化了毕赤酵母细胞，得到了重组菌株glod(1
‑
3)
‑
agα1和aao(1
‑
3)
‑
agα1。后续实验证明了高拷贝的重组菌株的glod的产率是688.5u/g(干重)，而laao的产率是626.7u/g(干重)，相交于传统方法有极大的提高。
217.实施案例5
218.本实施案例将来自于aspergillus oryzae nky2017的壳聚糖酶基因ccha在毕赤酵母中实现了表达，这里使用ppick
‑
bdm构建了ccha的多拷贝表达载体，并得到了相应的多拷贝表达菌株ccha1/2/3/4。其中ccha4菌株的表达量最高，高密度发酵结束时，用ccha4表达菌株得到的壳聚糖酶总活性可以达到22,500u/ml。
219.在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
220.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所
作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
221.<110>湖北省生物农药工程研究中心
222.<120>新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体、构建方法及试剂盒
223.<160>8
224.<210>1
225.<211>2495
226.<212>dna
227.<213>人工序列(artificial sequence)
228.<400>1
229.cgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatcagatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattcgaaacgatgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctgaagctgaattcacgtggcccagccggccgtctcggatcggtacctcgagccgcggcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgt
aacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcg
230.<210>2
231.<211>1675
232.<212>dna
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