一种α-檀香烯合成酶、基因及应用

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种α-檀香烯合成酶、基因及应用。

背景技术：

α-檀香烯(α-santalene)，结构式如下式ⅰ所示，是从檀香树中提取的倍半萜类挥发性成分，可在细胞色素氧化酶p450的催化下生成α-檀香醇，α-檀香烯和α-檀香醇是檀香精油的主要成分。檀香精油毒性低、无致突变性，是目前公认安全的食品添加剂；檀香精油不仅用于香料和化妆品，还具有镇静安神、抗炎镇痛、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤作用，对皮肤疾病、支气管炎、黏膜炎、抑郁失眠等具有一定的疗效。虽然檀香精油具有很重要的作用，市场价值也在不断扩大，但是檀香精油主要是通过水蒸汽蒸馏从天然植物檀香的心材和根中提取分离，导致檀香树木被过度砍伐，生态环境遭到严重的破坏；进一步也导致檀香精油产量下降，价格上涨，同时檀香树生长条件苛刻，生长周期长，精油含量很低且受到种植环境等诸多因素影响；提取精油需要多步的分离纯化，工艺复杂要求高难度大。

采用酶催化方法进行α-檀香烯的生物合成具有一定的优势，例如反应条件温和、选择性高、产物专一性高。而进行酶催化的首要前体是优质的生物催化剂的获得。目前关于檀香烯合成酶的研究较少，例如从檀香植物santalumalbum、s.austrocaledonicum和s.spicatum中分别克隆到檀香烯合成酶，但是其产物专一性不高，除了生成α/β-santalene外，还有其异构体epi-β-santalene、bergamotene等产物。因此，研究优质的α-檀香烯合成酶基因的克隆、表达，有助于α-檀香烯的生物合成，同时也能进一步利用代谢工程或者生物合成相关技术进行α-檀香烯以及α-檀香醇的细胞工厂生产，本发明具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明经研究发现了一种来源于植物温郁金的α-檀香烯合成酶，能够使用大肠杆菌基因工程菌进行大量表达，且该酶具有很好的催化合成α-檀香烯的效果。

温郁金(curcumawenyujiny.h.chenetc.ling)为姜科植物，主产于浙江瑞安，由于温郁金具有鲜明的地域特性和较高的药用价值，因而被列为“浙八味”之一。温郁金药材表面呈棕褐色，又称“黑郁金”。

本发明首先提供了一种α-檀香烯合成酶，来源于温郁金(curcumawenyujiny.h.chenetc.ling)，氨基酸序列为seqidno.2所示。

本发明又提供了所述α-檀香烯合成酶在制备α-檀香烯中的应用。

本发明又提供了编码所述α-檀香烯合成酶的基因。优选的，所述的基因，核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明又提供了一种包含所述基因的重组表达载体。优选的，所述的重组表达载体，使用pet28a载体作为骨架。

本发明又提供了一种包含所述重组表达载体的基因工程菌。优选的，所述的基因工程菌，使用的宿主细胞为大肠杆菌。作为宿主细胞的大肠杆菌菌株可以选用e.coilbl21codonplus。

本发明还提供了一种制备α-檀香烯的方法，使用所述α-檀香烯合成酶作为催化剂，以法尼基焦磷酸为底物，在二硫苏糖醇、mgcl2和1,2,3-丙三醇的作用下催化合成α-檀香烯。优选的，初始催化反应体系中催化剂的用量为1.0μg/ml，底物浓度为2μg/ml，二硫苏糖醇和mgcl2的浓度分别为1mm和10mm，1,2,3-丙三醇体积浓度为10％。

本发明具有以下有益效果：

本发明对温郁金来源的α-檀香烯合成酶进行功能验证并在大肠杆菌中进行α-檀香烯合成方法的发明与应用。发现温郁金来源的α-檀香烯合成酶可在原核表达体系中催化fpp生成大量的α-檀香烯、以及少量的β-檀香烯和α-法尼烯，根据峰面积计算α-檀香烯的含量达到了90％以上，从而在大肠杆菌中快速，大量地制备所述的催化剂，并应用于α-檀香烯的合成，进一步可应用于α-檀香醇的合成，具有重要的意义。

附图说明

图1为cwss与其他物种来源的α-檀香烯合成酶的氨基酸序列比对图。

图2为cwss与其他物种来源的倍半萜合酶构建的系统进化树，其中，ccss：cinnamomumcamphorass；clss：clausenalansiumss；czgbs：curcumazedoariagermacrenebsynthase；zzes：zingiberzerumbeteudesmolsynthase；spss：santalumspicatumss。

图3为sds-page分析重组cwss工程菌经iptg诱导表达结果(泳道m：marker；泳道1：诱导后上清部分；泳道2：诱导后沉淀部分)。

图4为cwss催化反应产物的gc-ms图。a:gc-ms全色谱图；b：局部放大的色谱图；c：出峰时间为16.10min的产物峰的质谱图；d：标准品α-檀香烯的质谱图。

具体实施方式

实施例1：温郁金来源的α-檀香烯合成酶、基因、载体、工程菌的制备

1、候选的cwss基因的同源性分析

收集温州瑞安飞云江两岸的温郁金块根、嫩叶、芽和茎组织，由上海美吉生物技术公司进行转录组测序，获得的序列进行生物信息学分析发现一条候选的倍半萜合酶基因(即本申请α-檀香烯合成酶，cwss)，其推测的氨基酸序列在ncbi进行blastp分析发现，与姜科植物zingiberofficinale来源的红没药烯合成酶(accessionnumber：d2yzp9)具有最大的同源性，序列一致性达到86％；进一步与其他来源的倍半萜烯合成酶进行序列比对，结果显示cwss具有保守的结构域，例如ddxxd，rxr，nse/dte，rrx8w(图1)。

对cwss和其他植物来源的倍半萜合酶进行系统进化树分析，发现其聚类到了tps-a亚家族，该亚家族均来源于被子植物倍半萜合酶(图2)。生物信息学分析推测改基因序列可能为倍半萜合酶，因此，进一步进行功能分析。

2、cwss基因全长的克隆

采用rnaeasyfast植物组织rna快速提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取温郁金块根、嫩叶、芽和茎混合组织的rna，采用primescriptrtreagentkit反转录试剂盒(宝生物工程有限公司)进行反转录获得cdna。根据候选的cwss基因序列，设计一对引物(上游引物：5’-atggggcttggccagactccgt-3’；下游引物：5’-tcaaacaggaacaggatgaac-3’)，以cdna为模板进行高保真pcr反应，pcr反应体系：10*pcrbuffer5μl，上下游引物(10μm)各1μl，cdna1μl，高保真taq酶，0.5μl，加水补齐50μl。pcr反应参数为：首先95℃变性5min；其次，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；最后70℃延伸10min。待pcr反应结束后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带，进行ta亚克隆(宝生物工程有限公司)。在50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上进行阳性克隆筛选，如上采用pcr筛选阳性克隆，将阳性克隆送上海捷瑞生物技术公司测序验证，成功获得seqidno.1所示核苷酸序列的基因cwss，该基因编码的酶cwss氨基酸序列为seqidno.2所示。

含目的基因cwss的重组载体及工程菌的构建：根据cwss基因编码序列(seqidno.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(上游为ndei，下游为xhoi)，具体地说，上游引物为：5’-catatggggcttggccagactccgt-3’，下游引物为：5’-ctcgagtcaaacaggaacaggatgaac-3’。pcr反应体系：10*pcrbuffer5μl，上下游引物(10μm)各1μl，cdna1μl，高保真taq酶，0.5μl，加水补齐50μl。pcr反应参数为：首先95℃变性5min；其次，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃y延伸2min，30个循环；最后70℃延伸10min。经pcr扩增后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带。同时，提取pet28a重组质粒，进行ndei和xhoi(neb北京公司)双酶切，采用dna产物纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收酶切产物，dna连接酶(neb北京公司)进行过夜连夜，再将连接产物cwss-pet28a采用热激法转入e.coilbl21codonplus感受态细胞中，在50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上进行阳性克隆筛选，获得工程菌e.coilbl21codonplus/pet28a/cwss。

3、cwss蛋白的诱导表达与纯化

将第2步中获得的工程菌e.coilbl21codonplus/pet28a/cwss在含100ml50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃摇床过夜培养。将10ml过夜培养后的菌液倒入1l含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，37℃培养，直到菌液od600达到0.6-0.8时加入iptg终浓度为0.5mm，28℃诱导16h后，离心收集菌体，5g湿菌体用25ml、ph7.4磷酸缓冲液重悬，超声破碎细胞。离心取上清，用0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤，根据产品说明书，将滤液进行镍柱(qiagen，德国)亲和层析纯化获得带his-tag的cwss重组酶液，电泳图见图3所示。结果表达cwss在大肠杆菌中以可溶的形式表达。

实施例2：重组酶cwss的催化性质分析

以实施例1方法制备的cwss重组酶液(浓度为50mg/l，体积为10μl)为催化剂，加入ph7.0tris-hcl缓冲液、2μgfpp(法尼基焦磷酸)、500mmmgcl2溶液20μl、500mmdtt2μl、100μl稀甘油(1,2,3-丙三醇)构成反应体系1ml，分别在30℃下搅拌充分反应120min，同时采用顶空-固相微萃取技术吸附反应产物，待反应结束后，将萃取头取出注入气相色谱仪，对产物进行定性分析。色谱条件：选用gc-2010岛津气相色谱仪；色谱柱为hp-5；载气：n2，吹扫流量为3ml/min，无分流；柱箱起始温度40℃，保留2分钟，然后以7℃/min的速度升温至220℃，保留5分钟；进样口温度为250℃；检测器温度为250℃。质谱数据以45-500全扫描模式收集。比对nist数据库分析产物：在16.10min出现了最大的主产物峰α-檀香烯，16.29min和16.66min出现了极小的β-檀香烯和α-法尼烯，根据峰面积计算，α-檀香烯占90.97％(如图4所示)。

序列表

<110>杭州师范大学

<120>一种α-檀香烯合成酶、基因及应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1653

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<213>温郁金(curcumawenyujiny.h.chenetc.ling)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<400>6

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