一种能降解烟碱和对羟基苯甲酸的细菌、菌剂、降解方法及其应用

1.本发明涉及降解微生物技术领域，具体涉及一种能降解烟碱和对羟基苯甲 酸的细菌、菌剂、降解方法及其应用。


背景技术：

2.烟碱(nicotine)，又名尼古丁，是一种存在于茄科植物(茄属)中的生物碱， 同时也是烟草的重要成分，占烟草生物碱的95％以上。烟草种植过程中产生的 废弃物和一些低等级烟叶绝大部分被焚烧或者直接丢弃在烟田中，烟农每年弃 于田间的低次烟草数量是相当可观的，约占烟叶产量的14％左右。这些烟草废 弃物如果不加以合理处理，会使其中的烟碱等有毒物质进入农田土壤中，对环 境造成严重污染，而且会对农田土壤的土质、肥力和微生态结构产生一定的影 响。
3.目前，研究人员发现可以采用多种途径来实现对烟碱的降解，包括物理法、 化学法和生物法。由于物理法和化学法极易对环境造成二次污染，所以采用生 物法，尤其是利用微生物对烟碱进行降解具有独特优势，其效率高、污染少， 并且具有可持续性，所以成为了控制环境中烟碱污染的最有前景方法。
4.对羟基苯甲酸是多种作物的自毒物质，它的积累不利于作物的生长发育， 使得作物产量和质量降低，是导致连作障碍的主要原因之一。利用微生物降解 对羟基苯甲酸是解决自毒作用的一条很好的途径，既可以降低自毒物质的含量， 又不对环境产生危害。
5.目前，国内外研究者已经从环境中分离了多种烟碱降解菌，包括节杆菌、 假单胞菌、苍白杆菌和曲霉等。但对这些微生物的研究多局限于单一的烟碱降 解方面。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种能降解烟碱和对羟基苯甲 酸的细菌、菌剂、降解方法及其应用。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一个方面，提供一种能降解烟碱和对羟基苯甲酸的细菌，所述细 菌为ln
‑
1，分类命名为放射根瘤菌(rhizobium radiobacter)，已于2021年1月 18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no.m2021103，保藏 单位地址：中国，武汉，武汉大学，邮编:430072，其16s rdna核苷酸序列如 seq id no：1所示。
9.本发明的第二个方面，提供一种包含所述细菌的菌剂。
10.本发明的第三个方面，提供一种使用所述细菌或所述菌剂降解烟碱和/或对 羟基苯甲酸的方法，将所述细菌或所述菌剂添加到含烟碱和/或对羟基苯甲酸的 液体矿物盐培养基中培养。
11.进一步的，所述方法中，具体是于29
‑
31℃、160
‑
180rpm条件下摇床培养。
12.本发明的第四个方面，提供一种包括所述细菌或所述菌剂的降解烟碱和/ 或对羟
基苯甲酸的产品。
13.本发明的第五个方面，提供所述细菌或所述菌剂在制备改良富含烟碱和/ 或对羟基苯甲酸土壤土质的产品中的应用。
14.本发明的第六个方面，提供一种包括所述细菌或所述菌剂的改良富含烟碱 和/或对羟基苯甲酸土壤土质的产品。
15.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
16.本发明提供的一种能降解烟碱和对羟基苯甲酸的细菌、包含所述细菌的菌 剂、降解方法及其应用，这些基于ln
‑
1的产品和应用，具有高效降解碱和对 羟基苯甲酸的有益效果，在改良烟田土壤土质、改善烟田土壤微生态结构及缓 解烟田连作障碍方面具有潜在的应用价值。
附图说明
17.图1为烟碱标准曲线。
18.图2为菌株在1000mg/l烟碱条件下的降解曲线和生长曲线。
19.图3为对羟基苯甲酸标准曲线。
20.图4为菌株在322mg/l对羟基苯甲酸条件下的降解曲线和生长曲线。
具体实施方式
21.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明 的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商 业途径得到。
22.实施例1：烟碱降解菌株的筛选、分离纯化和鉴定
23.(1)培养基
24.液体矿物盐培养基的配制：k2hpo4·
3h2o 1.855g/l，kh2po
4 0.5g/l， (nh4)2so
4 1.0g/l，mgso4·
7h2o 0.409g
·
l，nacl 1.0g
·
l，微量元素溶液 1ml/l,调ph为7.0
‑
7.5，高压蒸汽灭菌(121℃，30min)后制得。其中，微 量元素溶液配方为：mnso4·
h2o 0.13g/l，zncl
2 0.23g/l，cuso4·
5h2o 0.038 g/l，cocl2·
6h2o 0.42g/l，na2moo4·
2h2o 0.15g/l，alcl
3 0.0276g/l。
25.固体矿物盐培养基的配制：在液体矿物盐培养基中加入质量体积比为2.0％ 的琼脂。
26.富集培养基的配制:在液体矿物盐培养基中加入烟碱，使得烟碱的终浓度 为2000mg/l。
27.(2)菌株的筛选、分离和纯化
28.取5g从河南省洛阳市洛宁县罗岭乡长期植烟烟田中钻取的土壤样品，置 于灭菌后的含有100ml富集培养基的锥形瓶中。将锥形瓶置于30℃、150 rpm/min的摇床上震荡培养7天。然后，取5ml土壤细菌培养液接种到新鲜的 100ml富集培养基中，继续培养7天。同样的过程循环四次，以富集烟碱降解 细菌。
29.取富集液0.5ml在2ml离心管中用0.85％的无菌生理盐水进行梯度稀释， 取10
‑2‑
10
‑6稀释度的富集菌液各0.2ml，均匀涂布在含2000mg/l烟碱的固体 矿物盐培养基平板上。
涂布好的平板在30℃恒温恒湿箱中培养，定期观察菌体 在平板上的生长状况。2
‑
3天后，挑取长势又快又好且形态不同的单菌落，采 用平板划线法进一步分离纯化培养。将纯化后的菌株接种于含烟碱的液体矿物 盐培养基中，通过高效液相色谱法检测培养液中烟碱的残留量，最后筛选出一 株能高效降解烟碱的菌株，记为菌株ln
‑
1。
30.(3)菌株的鉴定
31.将上述获得的菌株分别用vitek全自动微生物鉴定系统和16s rdna测序 进行鉴定。经过鉴定该株菌为放射根瘤菌(rhizobium radiobacter)，菌株名记 为ln
‑
1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no.m2021103。 该菌株的16s rdna测序结果如seq id no.1所示，vitek全自动微生物鉴定 系统鉴定结果如表1所示。
32.表1菌株rhizobium radiobacter ln
‑
1vitek全自动微生物鉴定系统鉴定 结果
[0033][0034]
实施例2：筛选菌株降解烟碱能力的测定
[0035]
(1)烟碱浓度及菌体生长量的测量方法
[0036]
菌体生长量通过测定培养液在600nm处的吸光度值来表示。烟碱残留量的 检测采用高效液相色谱法，根据烟碱标准曲线计算出待测培养液中烟碱的含量。 高效液相色谱检测条件为：采用beh
‑
c18柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，流动 相为甲醇(色谱纯)：水＝(10:90，v/
v)，流速为0.6ml/min，柱温为30℃， 进样量为20μl，检测波长为259nm，外标法按峰面积定量。
[0037]
烟碱标准曲线如图1所示，标准曲线方程为y＝25410.89x+1194118， r2＝0.99303，其中y为峰面积，x为烟碱含量。
[0038]
将1ml od
600
值调为0.6的菌株ln
‑
1接入含烟碱的液体矿物盐培养基中(烟 碱浓度为1000mg/l)，于30℃、180rpm条件下摇床培养，此为试验组。设 置两个对照组，对照组1为不接菌的含烟碱液体矿物盐培养基(烟碱浓度与试 验组一致)，对照组2为只接菌的不含烟碱液体矿物盐培养基(接入1ml od
600
值调为0.6的菌株ln
‑
1)，定时取样，连续测定降解过程中烟碱浓度的变化以 及rhizobium radiobacter ln
‑
1菌株的生长情况。
[0039]
(2)烟碱浓度及菌体生长量的测定
[0040]
取0h、8h、16h、20h、22h、24h、26h、28h、30h培养液各2ml于 离心管中，4℃、12000r/min条件下离心10min，取上清液，然后相同条件再 次离心后取上清液，用0.22μm的水相滤膜过滤两次，最后用高效液相色谱方法 检测烟碱含量。菌体生长量通过测定0h、8h、16h、20h、22h、24h、26h、 28h、30h培养液在600nm处的吸光度值来表示。菌株在1000mg/l烟碱条件 下的降解曲线和生长曲线如图2。由上述结果可见，烟碱的浓度随着菌株ln
‑
1 的生长而降低，菌株ln
‑
1对烟碱具有良好的降解效果，30h能对烟碱完成全部 降解。
[0041]
实施例3：筛选菌株降解对羟基苯甲酸能力的测定
[0042]
(1)对羟基苯甲酸浓度及菌体生长量的测量方法
[0043]
菌体生长量通过测定培养液在600nm处的吸光度值来表示。对羟基苯甲酸 残留量根据其在255nm的吸光度值代入标准曲线进行计算。
[0044]
对羟基苯甲酸标准曲线如图3所示，标准曲线方程为y＝0.014x
‑
0.00008，其 中y为对羟基苯甲酸含量，x为255nm处的吸光度值。
[0045]
将1ml od
600
值调为0.55的菌株ln
‑
1接入含对羟基苯甲酸的液体矿物盐 培养基中(对羟基苯甲酸浓度为322mg/l)，于30℃、160rpm条件下摇床培 养，此为试验组。设置两个对照组，对照组1为不接菌的含对羟基苯甲酸液体 矿物盐培养基(对羟基苯甲酸浓度与试验组一致)，对照组2为只接菌的不含 对羟基苯甲酸液体矿物盐培养基(接入1ml od
600
值调为0.55的菌株ln
‑
1)， 定时取样，连续测定降解过程中烟碱浓度的变化以及rhizobium radiobacter ln
‑
1 菌株的生长情况。
[0046]
(2)对羟基苯甲酸浓度及菌体生长量的测定
[0047]
取0h、10h、14h、18h、22h、32h、36h培养液各2ml于离心管中，25℃、 10000r/min条件下离心5min，取上清液，以不加对羟基苯甲酸的无机盐基础培 养液作参比，在波长255nm下测定吸光度值，然后根据标准曲线计算培养液中 的对基苯甲酸残留量。菌体生长量通过测定0h、10h、14h、18h、22h、32h、 36h培养液在600nm处的吸光度值来表示。菌株在322mg/l对羟基苯甲酸条 件下的降解曲线和生长曲线如图4。由上述结果可见，对羟基苯甲酸的浓度随着 菌株ln
‑
1的生长而降低，菌株ln
‑
1对对羟基苯甲酸具有良好的降解效果，培 养了18h后对羟基苯甲酸已经被降解了98.7％。
[0048]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基 本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要 求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0049]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发 明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及 其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。