一种母核为3-苯基-1，2，4-噁二唑的化合物及其制备方法和应用

本发明涉及医药领域，具体涉及一种母核为3-苯基-1，2，4-噁二唑的化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

炎性小体是一种高分子量复合物，其介导效应蛋白胱天蛋白酶的激活，是固有免疫的一部分。不同的模式识别受体(patternrecognitionreceptor，prr)识别病原体相关的分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，pamp)或损伤相关的分子模式(damageassociatedmolecularpatterns，damp)，从而形成多种不同的炎性小体。迄今为止，已经有多个prr被提出可以形成炎性小体，其中包括核苷酸结合寡聚域(nucleotide-bindingoligomerizationdomain，nod)样受体。而在由nod样受体形成的炎性小体中，包含吡啶结构域3的nod样受体(nodlikereceptorcontainingpyrindomain3，nlrp3)炎性小体的特征最为典型，研究也最为成熟与广泛。

nlrp3炎性小体是控制两个促炎性细胞因子：白介素(interleukin，il)-1家族的il-1β和il-18成熟与分泌的关键信号传导节点。nlrp3的激活会募集凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingacaspaserecruitmentdomain，asc)和procaspase-1进行组装。nlrp3炎性小体组装后，可以将无活性的procaspase-1水解成有活性的caspase-1。随后，caspase-1将细胞因子前体pro-il-1β和pro-il-18转化为成熟且具有生物活性的il-1β和il-18，并诱导促炎性细胞死亡，称为细胞焦亡。nlrp3蛋白主要由三部分组成：n端的热蛋白结构域(pyrindomain，pyd)，中央核苷酸结合结构域(nucleosidetriphosphatasedomain，nacht)和c端的亮氨酸富集区(leucine-richrepeat，lrr)。通常，nlrp3的激活分两个步骤进行。第一步(启动)是由toll样受体(toll-likereceptors，tlrs)识别许多pamp和damp启动的，从而激活介导核转录因子nf-κb介导的信号传导。它上调了炎性小体相关成分的转录，如非活性nlrp3，pro-il-1β和pro-il-18。此外，第二步(激活)是nlrp3的寡聚化以及nlrp3，asc和procaspase-1的募集组装。它主要由atp，造孔毒素，病毒rna和颗粒物等触发。

值得注意的是，异常的nlrp3炎性小体活化可能引起神经系统性疾病，代谢性疾病，炎性疾病及自身免疫性疾病的大量病理变化。研究表明，异常nlrp3炎性小体激活与2型糖尿病，肥胖引起的哮喘，胰岛素抵抗，黄斑变性，动脉粥样硬化，风湿性关节炎，类风湿性关节炎，慢性阻滞性肺部疾病，痛风，慢性肾脏疾病，冷吡啉相关周期性综合征，非酒精性脂眆肝病，炎性肠道疾病，阿尔茨海默氏病及帕金森症等疾病有密切关系。因此，nlrp3炎性小体可以作为治疗上述疾病的重要靶点。

自从2002年发现炎性小体以来，许多小分子和天然产物都作为nlrp3炎性小体抑制剂被开发出来，其中有些甚至可以在临床上使用。目前，用于治疗异常活化的nlrp3炎性小体的抑制剂最常用的靶标是il-1β和il-18，例如卡那津单抗(canakinumab)和gsk1070806。但此法存在一些限制，因为il-1不仅来源于nlrp3炎性小体，其他炎性小体如nlrp1，nlrc4，aim2等及非炎性小体方式也会引起成熟的il-1分泌。因此，直接作用于il-1而非活化异常的nlrp3炎性小体易于引起免疫抑制。所以，比起nlrp3炎性小体下游产物的抑制，特异性抑制nlrp3炎性小体的激活显得尤为重要。目前针对于nlrp3炎性小体激活的抑制剂也多有报道，可以针对参与激活的不同成分和信号因子，包括nlrp3，caspase-1，asc，离子通道，nf-κb等。例如，azd9056抑制p2x嘌呤能受体7(p2x7)atp门控离子通道，从而抑制k⁺外排。此外，小白菊内酯(parthenolide)通过引起caspase-1的烷基化来抑制caspase-1，并通过直接抑制nlrp3atp酶活性来抑制nlrp3。而且，它通过抑制nf-κb来减少炎性小体相关成分的表达。此外mcc950也是目前研究度极高，抑制效果显著的nlrp3炎性小体的小分子抑制剂。一些直接作用于nlrp3炎性小体本身的抑制剂如cy-09及冬凌草素甲(oridonin)也已被报道。cy-09直接与nlrp3的atp结合基序nacht结构域结合，抑制atp酶活性而抑制炎性小体的组装活化。而oridonin则可与nacht结构域结合从而阻断nlrp3与nek7蛋白的结合而阻断炎性小体的活化。cy-09对于nlrp3引起的cryopyrin蛋白相关周期综合征(caps)和2型糖尿病小鼠模型治疗效果显著，而oridonin在糖尿病小鼠模型中也有显著治疗效果。近年来，关于nlrp3炎性小体的研究及其抑制剂的开发都取得了一定进展，然而多数抑制剂针对于nlrp3炎性小体活化的下游产物，这种方法不直接靶向nlrp3炎性小体，缺少特异性，易引起免疫抑制。因此发现靶向nlrp3炎性小体激活的特异性抑制剂对于治疗nlrp3介导的相关疾病更有研究意义。

技术实现要素：

针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种母核为3-苯基-1，2，4-噁二唑的化合物及其制备方法和应用。本发明涉及以3-苯基-1，2，4-噁二唑为母核的一类新型nlrp3炎性小体抑制剂的发现，及此类化合物在抑制白介素il-1β的分泌和在治疗由nlrp3炎症小体异常激活引起的相关疾病的应用；本发明还包括此类抑制剂的制备过程和新型抑制剂的药效团组成以及在抗炎领域的应用。

本发明基于计算机辅助药物设计，在前期研究中设计并合成了一系列3-苯基-1，2，4-噁二唑为母核的衍生物，通过进一步药理活性筛选，发现3-苯基-1，2，4-噁二唑为母核的衍生物具有很好的抑制il-1β释放的活性，可作为nlrp3炎性小体抑制剂。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种母核为3-苯基-1，2，4-噁二唑的化合物，该化合物的结构如式i所示:

式中，r为c1～c30的烷基、芳基、杂芳基、c1～c30烷基芳基、c1-c30烷基杂芳基或c1-c12杂环；该c1～c12杂环被以下一个或多个相同或不同的取代基取代：c1～c30的烷基，烷氧基，烷氨基，酰胺基，硝基，卤素，苄基，腈基，氨基，羧基，羰基，三氟甲基。

在一些技术方案中：所述的r为其中r1和r2分别独立的为h，卤素，c1～c20的烷基或c1～c20的烷氧基；

优选：r1和r2分别独立的为h，卤素，c1～c10的烷基或c1～c10的烷氧基；

进一步优选：r1和r2分别独立的为h，卤素或c1～c3的烷基，且所述的r1和r2不同时为h；

最优选：r1为c1～c3的烷基，r2为h；

或：所述的r为其中r3和r4分别独立的为h，卤素，c1～c20的烷基或c1～c20的烷氧基；

优选：r3和r4分别独立的为h，卤素，c1～c10的烷基或c1～c10的烷氧基；

进一步优选：r3和r4分别独立的为h，卤素或c1～c3的烷基，且所述的r不为

最优选：r3和r4分别独立的为h或c1～c3的烷基；

或：所述的r为其中r5和r6分别独立的为h，卤素，c1～c20的烷基或c1～c20的烷氧基；

优选：r5和r6分别独立的为h，卤素，c1～c10的烷基或c1～c10的烷氧基；

进一步优选：r5和r6分别独立的为h，卤素或c1～c3的烷基；

最优选：r5和r6分别独立的为h，cl。

或：所述的r为其中r7为h，卤素，c1～c20的烷基，c1～c20的烷氧基或

优选：r7为h，卤素，c1～c10的烷基，c1～c10的烷氧基或

进一步优选：r7为h，卤素、c1～c3的烷基或

最优选：r7为h、c1～c3的烷基或特别的优选：r7为h、-me或

其中：r15为h，卤素，c1～c10的烷基或c1～c10的烷氧基；

进一步优选：r15为h，卤素或c1～c3的烷基；

最优选：r15为c1～c3的烷基；特别的优选：r15为-me；

在一些技术方案中：所述的r为

其中：r8为h，卤素，c1～c20的烷基或c1～c20的烷氧基；

优选：r8为h，卤素，c1～c10的烷基或c1～c10的烷氧基；

进一步优选：r8为h，卤素或c1～c3的烷基；

最优选：r8为cl或c1～c3的烷基；特别的优选：r8为cl或-me；

其中：r9为h，卤素，c1～c20的烷基或c1～c20的烷氧基；

优选：r9为h，卤素，c1～c10的烷基或c1～c10的烷氧基；

进一步优选：r9为h，卤素或c1～c3的烷基；

最优选：r9为h或c1～c3的烷基；特别的优选：r9为h或-me；

其中：r10为h，卤素，c1～c20的烷基或c1～c20的烷氧基；

优选：r10为h，卤素，c1～c10的烷基或c1～c10的烷氧基；

进一步优选：r10为h，卤素或c1～c3的烷基；

最优选：r10为c1～c3的烷基，特别的优选：r10为-me。

在一些技术方案中：所述的r为

其中：r11和r12分别独立的为h，卤素，c1～c20的烷基或c1～c20的烷氧基；

优选：r11和r12分别独立的为h，卤素，c1～c10的烷基或c1～c10的烷氧基；

进一步优选：r11和r12分别独立的为h，卤素或c1～c3的烷基；

最优选：r11和r12分别独立的为h；

其中：r13和r14分别独立的为h，卤素，c1～c20的烷基或c1～c20的烷氧基；

优选：r13和r14分别独立的为h，卤素，c1～c10的烷基或c1～c10的烷氧基；

进一步优选：r13和r14分别独立的为h，卤素或c1～c3的烷基；

最优选：r13和r14分别独立的为c1～c3的烷基；特别的优选：r13和r14分别独立的为-me；

其中：r16为h，卤素，c1～c20的烷基或c1～c20的烷氧基；

优选：r16为h，卤素，c1～c10的烷基或c1～c10的烷氧基；

进一步优选：r16为h，卤素或c1～c3的烷基；

最优选：r16为h。

在一些具体的技术方案中，所述的化合物结构式如下：

一种上述的母核为3-苯基-1，2，4-噁二唑的化合物的制备方法，该方法包括如下步骤：

步骤1，化合物ii通过加成反应，得到化合物ⅲ；

步骤2，i.将所述化合物ⅲ进行酯化反应；ii.在加热条件下环化，得到化合物iv；

步骤3，将所述化合物iv与hsr反应，得到化合物i。

式中，r的定义如上述。

上述制备方法中：所述步骤1为，将化合物ii加入乙醇溶解，再加入盐酸羟胺与碳酸氢钠，回流反应，得到式iii所示化合物。

上述制备方法中：所述步骤2为，i.将化合物iii加入丙酮，再加入碳酸钾，之后逐滴加入氯乙酰氯，回流反应，得到混合液；ii.将混合液转入四氢呋喃中在70℃下回流反应，得到式iv所示化合物。

上述制备方法中：所述步骤3为，化合物iv加入四氢呋喃中，再加入碳酸钾及hsr，得到化合物i。

一种药物组合物，该组合物包括：含有治疗有效量的上述的母核为3-苯基-1，2，4-噁二唑的化合物、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物及药学上可接受的载体。

本发明所述的母核为3-苯基-1，2，4-噁二唑的化合物或者其药学上可接受的盐，或者上述的药物组合物在制备nlrp3炎性小体抑制剂中的应用。

本发明所述的母核为3-苯基-1，2，4-噁二唑的化合物或者其药学上可接受的盐，或者上述的药物组合物在制备治疗炎症相关疾病的药物中的应用。

进一步的，所述炎症相关疾病选自糖尿病，动脉粥样硬化，风湿性关节炎，类风湿性关节炎，慢性阻滞性肺部疾病，痛风，慢性肾脏疾病，冷吡啉相关周期性综合征，非酒精性脂眆肝病，炎性肠道疾病以及神经退行性疾病等，所述神经退行性疾病选自帕金森症，亨廷顿病，阿尔兹海默症，多发性硬化症。

关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

c1-c30烷基是指含有一个至三十个碳原子的直链或支链的烃链，可选地被c1-c30烷基取代。

取代是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。

碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(ca～cb)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，c1-c30烷基是指包含1～30个碳原子的烷基。

芳基表示芳基碳环基团，具有单一环、多个环或多个稠环，其中至少一个是芳族的，c1-c30的烷基，烷氧基，烷氨基，酰胺基，硝，卤素，苄基，腈基，氨基，羧基，羰基，三氟甲基等单-、二-、三-、四-、五-取代。

杂芳基表示一个或多个5-、6-或7-元的芳香族环系，至少含有一个选自氮、氧或硫的杂原子，它们可以被卤素、硝基、三氟甲基、腈基、c1-c12烷基等单-、二-、三-、四-、五-取代。

c1-c30烷基芳基表示含有c1-c30的烷基与芳基相连，可选地被c1-c30烷基取代。

c1-c30烷基杂芳基表示含有c1-c30的烷基与杂芳基相连，可选地被c1-c30取代。

杂环是指稳定的含杂原子或杂原子团的单环、双环或三环，它们可以是饱和的，部分不饱和或者不饱和的烷氧基是指相应的醇少掉一个氢原子而成的基团。

卤素是指氟、氯、溴和碘。

本发明化合物指式i所示的化合物。该术语还包括式i化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物及药学上可接受的载体。

许多化合物可以与溶剂形成复合物，在这种溶剂中，它们进行反应，或它们从其中沉淀或结晶出来，这些复合物被称为“溶剂合物”。例如与水形成的复合物被称为水合物。

药物上可接受的载体是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质。

本发明所述的化合物可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片剂，胶囊，粉剂，糖浆，悬浮剂，针剂，可以加入香料，甜味剂，液体或固体填料或稀释剂等常用药用辅料。

本发明所述的化合物在临床上的给药方式可以采用口服、注射等方式。

“治疗有效量”或“有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。

本发明达到的有益效果：

本发明提供了一种3-苯基-1，2，4-噁二唑为母核的化合物，如式i所示。此类化合物结构新颖，制备方法简单，通过特异性抑制nlrp3炎症小体的活化，对白介素il-1β的释放具有显著的抑制活性，从而减轻炎性损伤，改善炎症微环境，具有潜在的抗炎活性，同时对thp-1细胞无明显毒性。可用于制备成抗炎药物，并用于许多炎症相关疾病的炎性损伤，这些疾病包括冷吡啉相关周期性综合征，炎性肠道疾病，慢性阻滞性肺部疾病，糖尿病，风湿性关节炎，类风湿性关节炎，痛风，非酒精性脂肪肝病，慢性肾脏疾病，动脉粥样硬化，神经退行性疾病如阿尔兹海默症，帕金森症，亨廷顿病，多发性硬化症。

附图说明

图1是目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值之比进行半定量分析图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品

仪器和试剂:熔点采用wrs-2微机熔点仪测定，薄层色谱用硅胶gf254购于阿拉丁试剂公司(aladdin，上海晶纯生化科技股价有限公司)；柱色谱用硅胶fcp(200～300目)购于国药集团化学试剂有限公司:其他所用试剂和溶剂均为国产分析纯，根据需要经无水干燥处理后使用。

实施例1合成化合物ⅲ

称量盐酸羟胺(3.9g，0.06mo1)于反应瓶，向其依次加入乙醇70ml，碳酸氢钠(4.8g，0.06mol)，再加入4-(三氟甲氧基)苄腈(5.8ml，0.04mol)，75℃下回流反应4h，tlc监测原料消失。减压除去溶剂，用乙酸乙酯萃取，水洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥。硅胶柱纯化，减压除去溶剂，得白色固体5.7g，收率:64.8％。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ9.78(s,1h),7.87–7.68(m,2h),7.38(dq,j＝7.9,1.1hz,2h),5.92(s,2h).¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ150.28,149.09,133.14,127.82,122.21,121.15.hrms(esi)calcdforc8h7f3n2o2[m+h]⁺221.0532,found221.0535.hplc(10％-100％methanolinwater),tr＝11.22min,>98.17％。

实施例2合成化合物iv

称量化合物iii(4.4g，0.02mol)于反应瓶，向其加入丙酮50ml，碳酸钾(3g，0.02mol)，逐滴加入氯乙酰氯(3.25ml，0.04mol)，55℃回流反应8h，tlc监测原料消失。减压除去溶剂，加入四氢呋喃，70℃回流反应，tlc监测原料消失。减压除去溶剂，用乙酸乙酯萃取，水洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥。硅胶柱纯化，减压除去溶剂。得到淡黄色油状物2.3g,收率41.4％。¹hnmr(300mhz,chloroform-d)δ8.33–8.04(m,2h),7.36(dp,j＝7.9,1.1hz,2h),4.78(s,2h).¹³cnmr(75mhz,chloroform-d)δ174.65,167.88,151.54,129.29,124.72,122.07,121.17,33.29.hrms(esi)calcdforc10h6clf3n2o2[m+h]⁺279.0143,found279.0119.hplc(50％-100％methanolinwater),tr＝18.36min,>97.47％。

实施例3合成化合物i-1

5-(((1h-咪唑-2-基)硫代)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1，2，4-噁二唑(i-1)

以i-1化合物为例，称量化合物iv(200mg，0.72mmo1)于反应瓶，向其依次加入四氢呋喃10ml，碳酸钾(160mg，1.16mmol)，再加入1h-咪唑-2-硫醇(100mg，1mmol)，室温反应过夜，tlc监测原料消失。反应液依次用乙酸乙酯萃取，水洗，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。用硅胶柱纯化，得到203mg，收率:82.5％。

5-(((1h-咪唑-2-基)硫代)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑(i-1).白色固体,收率82.5％,m.p.152.1-153.0℃。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ12.48(s,1h),8.13–8.05(m,2h),7.60–7.53(m,2h),7.09(s,2h),4.60(s,2h).¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ178.17,167.21,150.90,136.46,130.25,129.71,125.67,122.16,118.72,28.64.hrms(esi)calcdforc13h9f3n4o2s[m+h]⁺343.0471,found343.0459.hplc(10％-100％methanolinwater),tr＝16.29min,>98.07％.

实施例4合成化合物i-2

5-((苯并[d]噻唑-2-基硫基)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1，2，4-噁二唑(i-2)合成方法与实施例3相同，以化合物ⅳ(200mg，0.72mmo1)，苯并[d]噻唑-2-硫醇(167mg，1mmo1)为原料，得到白色固体137mg，收率46.5％，m.p.68.1-68.9℃。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.16–8.08(m,2h),8.04(ddd,j＝7.9,1.4,0.6hz,1h),7.83(ddd,j＝8.1,1.3,0.6hz,1h),7.63–7.49(m,2h),7.49–7.42(m,1h),7.38(ddd,j＝7.9,7.3,1.3hz,1h),5.11(s,2h).¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ177.60,167.39,164.67,152.71,150.97,150.94,135.48,129.78,127.01,125.46,125.35,122.53,122.17,121.85,118.70,27.64.hrms(esi)calcdforc17h10f3n3o2s2[m+h]⁺410.0239,found410.0243.hplc(70％-100％methanolinwater),tr＝18.56min,>97.26％.

实施例5合成化合物i-3

5-(((5-氯吡啶基-2-基)硫代)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑(i-3)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),5-氯吡啶-2-硫醇(145mg,1mmo1)为原料,得到白色固体212mg,收率76.3％,m.p.75.6-76.4℃。1hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.49(dd,j＝2.6,0.8hz,1h),8.17–8.00(m,2h),7.85(dd,j＝8.6,2.6hz,1h),7.58–7.52(m,3h),4.85(s,2h).¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ178.42,167.28,154.86,150.91,148.32,137.36,129.74,128.48,125.57,123.54,122.15,118.71,24.83.hrms(esi)calcdforc15h9clf3n3o2s[m+h]⁺388.0129,found388.0132.hplc(70％-100％methanolinwater),tr＝16.72min,>97.17％.

实施例6合成化合物i-4

5-((吡啶-2-基硫基)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑(i-4)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),吡啶-2-硫醇(111mg,1mmo1)为原料,得到黄色油状物147mg,收率57.8％。¹hnmr(300mhz,chloroform-d)δ8.47(ddd,j＝5.0,1.9,1.0hz,1h),8.19–8.06(m,2h),7.57(ddd,j＝8.1,7.4,1.8hz,1h),7.30(ddt,j＝10.0,8.1,1.0hz,3h),7.08(ddd,j＝7.4,5.0,1.1hz,1h),4.76(s,2h).¹³cnmr(75mhz,chloroform-d)δ177.45,167.56,155.32,151.25,149.45,136.57,129.23,125.28,122.32,122.07,121.03,120.45,24.32.hrms(esi)calcdforc15h10f3n3o2s[m+h]⁺354.0519,found354.0503.hplc(60％-100％methanolinwater),tr＝17.32min,>97.08％.

实施例7合成化合物i-5

5-(((1-甲基-1h-四唑-5-基)硫基)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑(i-5)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),1-甲基-1h-四唑-5-硫醇(116mg,1mmo1)为原料,得到白色固体223mg,收率86.5％,m.p.84.8-85.7℃。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.17–8.01(m,2h),7.60–7.55(m,2h),4.95(s,2h),4.01(s,3h).¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ177.25,167.32,152.63,150.99,150.97,129.74,125.41,122.21,34.40,27.94.hrms(esi)calcdforc12h9f3n6o2s[m+h]⁺359.0533,found359.0493.hplc(60％-100％methanolinwater),tr＝9.55min,>95.10％.

实施例8合成化合物i-6

5-(((4-甲基苯并[d]噻唑-2-基)硫代)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑(i-6)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),4-甲基苯并[d]噻唑-2-硫醇(181mg,1mmo1)为原料,得到白色固体211mg,收率69.3％,m.p.89.9-90.1℃。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.14–8.07(m,2h),7.86–7.77(m,1h),7.58–7.50(m,2h),7.26–7.19(m,2h),5.06(s,2h),2.48(s,3h).¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ178.00,167.36,163.23,151.84,150.93,150.91,135.25,131.32,129.71,127.32,125.58,125.29,122.17,119.82,27.99,18.05.hrms(esi)calcdforc18h12f3n3o2s2[m+h]⁺424.0396,found424.0401.hplc(70％-100％methanolinwater),tr＝23.56min,>98.35％.

实施例9合成化合物i-7

5-((对甲苯甲硫基)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑(i-7)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),4-甲基苯硫醇(124mg,1mmo1)为原料,得到黄色油状物157mg,收率59.5％。¹hnmr(300mhz,chloroform-d)δ8.24–8.01(m,2h),7.49–7.24(m,4h),7.23–7.05(m,2h),4.25(s,2h),2.35(s,3h).¹³cnmr(75mhz,chloroform-d)δ177.16,167.52,151.31,138.60,132.43,130.11,129.54,129.21,125.22,122.08,121.08,30.42,21.16.hrms(esi)calcdforc17h13f3n2o2s[m+h]⁺367.0723,found367.0675.hplc(60％-100％methanolinwater),tr＝23.27min,>98.98％.

实施例10合成化合物i-8

3-(((3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,1,2,4-噁二唑-5-基)甲基)硫代)丙酸甲酯(i-8)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),3-巯基丙酸甲酯(120mg,1mmo1)为原料,得到黄色油状物119mg,收率45.7％。¹hnmr(300mhz,chloroform-d)δ8.24–8.07(m,2h),7.37–7.32(m,2h),3.98(s,2h),3.73(s,3h),3.06–2.89(m,2h),2.84–2.56(m,2h).¹³cnmr(75mhz,chloroform-d)δ177.25,171.90,167.61,151.37,129.24,125.14,122.08,121.12,51.98,34.00,27.43,25.91.hrms(esi)calcdforc14h13f3n2o4s[m+h]⁺363.0621,found363.0578.hplc(50％-100％methanolinwater),tr＝16.84min,>96.88％.

实施例11合成化合物i-9

n-(3-(5-(((3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑-5-基)甲基)硫基)-1h-四唑-1-基)苯基)乙酰胺(i-9)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),n-(3-(5-巯基-1h-四唑-1-基)苯基)乙酰胺(235mg,1mmo1)为原料,得到白色固体231mg,收率67.2％,m.p.149.6-149.9℃。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ10.39(s,1h),8.17–8.00(m,3h),7.69(ddd,j＝8.3,2.0,1.1hz,1h),7.64–7.50(m,3h),7.35(ddd,j＝7.8,2.2,1.1hz,1h),5.03(s,2h),2.09(s,3h).¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ177.08,169.46,167.34,153.28,150.96,141.14,133.52,130.94,129.78,125.40,122.18,120.96,118.97,114.48,27.99,24.52.hrms(esi)calcdforc19h14f3n7o3s[m+h]⁺478.0904,found478.0901.hplc(30％-100％methanolinwater),tr＝20.90min,>98.07％.

实施例12合成化合物i-10

5-(((1h-1,2,4-三唑-3-基)硫基)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑(i-10)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),1h-1,2,4-三唑-3-硫醇(101mg,1mmo1)为原料,得到白色固体178mg,收率72.1％,m.p.119.8-120.4℃。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.52(s,1h),8.17–7.97(m,2h),7.64–7.44(m,2h),4.75(s,2h).¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ178.41,167.27,156.34,150.92,146.49,129.74,125.60,122.16,118.72,26.66.hrms(esi)calcdforc12h8f3n5o2s[m+h]⁺344.0424,found344.0393.hplc(10％-100％methanolinwater),tr＝21.02min,>98.74％.

实施例13合成化合物i-11

5-(((5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)硫代)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑(i-11)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-硫醇(132mg,1mmo1)为原料,得到黄白色固体189mg,收率70.2％,m.p.61.8-62.1℃。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.23–8.00(m,2h),7.60–7.55(m,2h),4.99(s,2h),2.68(s,3h).¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ177.52,167.34,167.23,162.99,150.97,129.78,125.46,122.20,28.23,15.72.hrms(esi)calcdforc13h9f3n4o2s2[m+h]⁺375.0192,found375.0157.hplc(60％-100％methanolinwater),tr＝11.22min,>95.81％.

实施例14合成化合物i-12

5-(((6-溴苯并[d]噻唑-2-基)硫代)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑(i-12)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),6-溴苯并[d]噻唑-2-硫醇(245mg,1mmo1)为原料,得到白色固体287mg,收率81.9％,m.p.86.3-87.1℃。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.34(d,j＝2.0hz,1h),8.20–7.97(m,2h),7.75(d,j＝8.7hz,1h),7.64–7.48(m,3h).¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ177.50,167.39,166.18,151.78,150.97,137.49,130.11,129.78,125.44,125.10,123.25,122.19,117.80,27.69.hrms(esi)calcdforc17h9brf3n3o2s2[m+h]⁺487.9344,found487.9348.hplc(70％-100％methanolinwater),tr＝23.40min,>97.88％.

实施例15合成化合物i-13

2-(((3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-恶二唑-5-基)甲基)硫基)苯并[d]噁唑(i-13)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),苯并[d]噁唑-2-硫醇(151mg,1mmo1)为原料,得到白色固体220mg,收率77.7％,m.p.76.8-77.2℃。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.18–8.00(m,2h),7.75–7.57(m,2h),7.57–7.52(m,2h),7.41–7.21(m,2h),5.07(s,2h).¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ177.39,167.41,162.83,151.96,150.98,141.44,129.78,125.41,125.32,125.19,122.17,119.03,118.70,110.88,26.94.hrms(esi)calcdforc17h10f3n3o3s[m+h]⁺394.0468,found394.0431.hplc(60％-100％methanolinwater),tr＝20.42min,>98.94％.

实施例16合成化合物i-14

5-(((1-甲基-1h-咪唑-2-基)硫代)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑(i-14)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),1-甲基-1h-咪唑-2-硫醇(114mg,1mmo1)为原料,得到红棕色油状物143mg,收率55.8％。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.15–8.04(m,2h),7.60–7.53(m,2h),7.30(d,j＝1.2hz,1h),6.96(d,j＝1.2hz,1h),4.58(s,2h),3.58(s,3h).¹³cnmr(75mhz,chloroform-d)δ176.53,167.61,151.37,138.32,130.20,129.19,125.01,123.35,122.06,121.12,33.53,29.50.hrms(esi)calcdforc14h11f3n4o2s[m+h]⁺357.0628,found357.0653.hplc(10％-100％methanolinwater),tr＝17.38min,>98.86％.

实施例17合成化合物i-15

3-(((3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-恶二唑-5-基)甲基)硫基)丙酸(i-15)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),3-巯基丙酸(106mg,1mmo1)为原料,得到白色固体106mg,收率42.3％,m.p.111.9-112.5℃。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ12.36(s,1h),8.23–8.10(m,2h),7.67–7.51(m,2h),4.22(s,2h),2.85(t,j＝7.0hz,2h),2.60(t,j＝7.0hz,2h).¹³cnmr(75mhz,chloroform-d)δ177.18,176.84,167.61,151.39,129.26,125.05,121.14,33.88,27.04,25.92.hrms(esi)calcdforc13h11f3n2o4s[m+h]⁺349.0464,found349.0456.hplc(10％-100％methanolinwater),tr＝23.12min,>95.32％.

实施例18合成化合物i-16

5-(((1h-苯并[d]咪唑-2-基)硫代)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑(i-16)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),1h-苯并[d]咪唑-2-硫醇(150mg,1mmo1)为原料,得到白色固体187mg,收率66.3％,m.p.145.1-145.5℃。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ12.79(s,1h),8.14–7.99(m,2h),7.63–7.39(m,4h),7.14(q,j＝3.5hz,2h),4.99(s,2h).¹³cnmr(75mhz,dmso-d6)δ178.17,167.33,150.92,148.28,129.75,125.54,122.53,122.16,121.86,118.13,111.12,26.46.hrms(esi)calcdforc17h11f3n4o2s[m+h]⁺393.0628,found393.0603.hplc(10％-100％methanolinwater),tr＝20.32min,>97.02％.

实施例19合成化合物i-17

5-(((4-氯苯基)硫代)甲基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑(i-17)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),4-氯苯硫醇(144mg,1mmo1)为原料,得到淡黄色油状物181mg,收率65.1％。¹hnmr(300mhz,chloroform-d)δ8.16–7.92(m,2h),7.46–7.39(m,2h),7.36–7.27(m,4h),4.28(s,2h).¹³cnmr(75mhz,chloroform-d)δ176.65,167.58,151.39,134.52,133.09,131.69,129.53,129.21,125.03,122.07,121.13,29.87.hrms(esi)calcdforc16h10clf3n2o2s[m+h]⁺387.0176,found387.0151.hplc(70％-100％methanolinwater),tr＝19.07min,>97.09％.

实施例20合成化合物i-18

3-(((3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,2,4-噁二唑-5-基)甲基)硫代)丁-2-酮(i-18)合成方法与实施例3相同,以化合物ⅳ(200mg,0.72mmo1),3-巯基丁烷-2-酮(104mg,1mmo1)为原料,得到淡黄色油状物180mg,收率72.3％。¹hnmr(300mhz,chloroform-d)δ8.21–8.10(m,2h),7.38–7.30(m,2h),3.93(s,2h),3.66(q,j＝7.1hz,1h),2.33(s,3h),1.48(d,j＝7.1hz,3h).¹³cnmr(75mhz,chloroform-d)δ204.74,176.89,167.63,151.38,129.25,125.08,121.13,118.61,48.64,26.02,24.40,15.78.hrms(esi)calcdforc14h13f3n2o3s[m+h]⁺347.0672,found347.0673.hplc(50％-100％methanolinwater),tr＝18.00min,>96.72％.

性能测试

下面是本发明化合物的药理学实验结果,该部分的化合物代号所对应的结构式等同于实施例部分的代号所对应的结构式。

一.用于测定il-1β含量的elisa实验

细胞培养上清中il-1β的分泌使用双抗体夹心法elisa检测。新鲜收集的细胞样本室温静置20min后,于4℃3000g离心10min,上清即可用于检测分析。将样品与标准品分别加入已包被抗体的96孔板中,加入生物素化抗体后置于37℃摇床孵育1h后,洗板5次,加入酶结合工作液,37℃避光孵育30min后,洗板5次。加入显色底物,37℃避光孵育15min。加入终止液终止反应。10min内用全波长酶标仪(thermo)于450nm波长处测量吸光度值。化合物对白介素il-1β的制率计算如下：

抑制率(％)＝1-(药物孔od值-空白孔od值)/(阴性对照孔od值-空白孔od值),以不加药物和诱导因子的细胞孔为空白对照,以不加药物,加lps和atp的细胞孔为阴性对照。

本发明以mcc950为阳性对照,dmso组为阴性对照,细胞裂解液为空白背景,设置3个复孔,化合物对il-1β抑制率结果表示为各组数据平均值±sem。本发明中部分化合物对白介素il-1β的抑制率如表1所示。

表1：

由表1数据可知，本发明的化合物对白介素il-1β具有抑制活性，这为开发高效安全，结构新颖，特异性强的nlrp3抑制剂，及治疗nlrp3介导的炎症相关疾病如冷吡啉相关周期性综合征，炎性肠道疾病，慢性阻滞性肺部疾病，糖尿病，风湿性关节炎，类风湿性关节炎，痛风，非酒精性脂肪肝病，慢性肾脏疾病，动脉粥样硬化，神经退行性疾病等的药物提供了基础。

二.细胞毒性评价

通过使用mtt测定确定细胞毒性。mtt购自sigma(st.louis，mo)。将其溶解在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中至储备溶液浓度为5mg/ml并储存在-20℃。在用测试化合物或dmso的密度梯度处理细胞24小时后,将20.0μlmtt溶液(5mg/ml)加入到96孔板的每个孔中并孵育4小时。然后,除去溶液并向每个孔中加入150.0μldmso以溶解水溶性mtt-甲臜晶体。通过e1x800吸光度酶标仪(biotek,vermont，usa)在570nm记录吸光度值(od值)。化合物对细胞生长抑制率的计算如下：

抑制率(％)＝1-药物孔od值/空白孔od值,以不加药物和诱导因子的细胞孔为空白对照。本发明部分化合物的细胞毒性评价如表2所示。

表2:

由表2数据可知,本发明的绝大多数化合物ic50>100μm,细胞毒性小。

三.westernblot监测化合物对目的蛋白的影响

细胞蛋白制备:吸取六孔板细胞上清,经冰预冷pbs缓冲液漂洗两次后用细胞刮刀将细胞从六孔板中刮下并收集。2000r离心5min,按照1:5(体细胞压积:裂解液体积)比例加入ripa蛋白裂解液,冰上裂解60min,12000r离心10min,吸取上清即为全细胞蛋白，取4μl进行bca法测定蛋白浓度,其余蛋白上清按体积加入5×上样缓冲液后沸水浴中变性10min,分装后-20℃保存。

根据bca定量结果,取40-80μg样品/泳道上样,依据目的蛋白的分子量采用不同胶浓度的sds-page分离,进行恒压(84v)浓缩25min,恒压(120v)凝胶电泳55min。200ma恒流湿转电转90min使蛋白转移至pvdf膜(millipore，usa)。将pvdf膜置于3％bsa-tbst(ph7.4,10mmtris-hc1,150mmnacl,0.1％tween-20)室温震荡封闭1h后,加入3％bsa-tbst配制的一抗:鼠抗il-1β(1:1000,cellsignalingtechnology,usa),兔抗β-actin(1:1000,sigma，usa),4℃过夜。tbst漂洗10min×3次后,分别加入hrp标记的山羊抗鼠二抗(1:4000)，hrp标记的山羊抗兔二抗(1:4000),室温震荡孵育100min,tbst漂洗10min×3次后加入ecl(pierce)发光底物显色。imagequantlas4000mini(ge)显影。将目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值之比进行半定量分析(图1)。

由westernblot实验表明,本发明中的化合物i-18可明显抑制pro-il-1β蛋白的表达，具有浓度依赖性。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。