一种产β-榄香烯重组菌及其构建方法和用途

本发明涉及代谢工程、合成生物学和生物制药等技术领域，特别涉及一种产β-榄香烯菌株的构建方法及用途。

背景技术：

以β-榄香烯(β-elemene)为主要成分的榄香烯类化合物，为国家ⅱ类非细胞毒性抗肿瘤新药。β-榄香烯具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖、转移和主动免疫保护等作用，临床上可以单独或与其他化疗药物联合用于治疗各种癌症，此外还具有抗氧化、抗菌、抗病毒、改善微循环等药效，因此具有良好医药价值和应用前景。

目前市场的β-榄香烯主要是从中药莪术中提取获得。该获取方法成本高、纯度低，而常规化学全合成方法的步骤繁琐、反应条件苛刻、得率低、环境不友好，限制了β-榄香烯的供给和应用。因此，寻找新的β-榄香烯经济可行的量产技术，对该类药物的推广应用具有重要意义。

合成生物学的发展，为规模化生产自然界中含量低、结构复杂、应用价值高的天然产物提供了新的方法。利用微生物生长速度快、周期短、成本低、遗传背景清楚有利于遗传改造等优点，通过构建重组细胞、异源重组天然产物的合成途径，已有快速、大量获取中间体和终产物的成功范例：在酿酒酵母中构建青蒿素的生物合成途径，其前体青蒿酸的产量达到25g/l(paddon,c.j.,etal.nature496.7446(2013):528.)。

β-榄香烯是植物中比较常见的一类倍半萜类化合物，但目前尚无β-榄香烯合酶被克隆，β-榄香烯是由吉玛烯a经cope重排而来的，而吉玛烯a则是经吉玛烯a合酶催化底物法呢烯基焦磷酸fpp获得。研究开发一种快速、高产、环境友好的β-榄香烯的制备方法成为当前亟待研究的重要课题。

技术实现要素：

鉴于此，本发明的目的是提供了一种产β-榄香烯菌株及其构建方法。本发明通过构建产生倍半萜类化合物的前体法呢烯基焦磷酸(fpp)的重组质粒和构建来源于加拿大一枝黄花(solidagocanadensis)的吉玛烯a合酶scgas重组质粒，获得含有上述重组质粒的大肠杆菌工程菌株，并通过优化温度、诱导剂浓度、诱导时间和诱导时菌液浓度，从而实现快速、高产地制备β-榄香烯。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种产β-榄香烯的重组菌，所述重组菌表达吉玛烯a合酶scgas、乙酰乙酰辅酶a硫解酶atob、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶erg13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶thmg1、甲羟戊酸激酶erg12、磷酸甲羟戊酸激酶erg8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶mvd1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispa。

进一步地，所述吉玛烯a合酶scgas的氨基酸序列如seqidno.2所示。

进一步地，所述吉玛烯a合酶scgas的核苷酸序列如seqidno.1所示或如seqidno.3所示，

进一步地，所述乙酰乙酰辅酶a硫解酶atob的核苷酸序列如seqidno.4所示，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶erg13的核苷酸序列如seqidno.5所示、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶thmg1的核苷酸序列如seqidno.6所示、甲羟戊酸激酶erg12的核苷酸序列如seqidno.7所示、磷酸甲羟戊酸激酶erg8的核苷酸序列如seqidno.8所示、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶mvd1的核苷酸序列如seqidno.9所示，焦磷酸异戊烯脂异构酶idi的核苷酸序列如seqidno.10所示、法呢烯基焦磷酸合酶ispa的核苷酸序列如seqidno.11所示。

进一步地，所述重组菌为重组大肠杆菌或重组酵母菌。

进一步地，所述吉玛烯a合酶scgas的表达载体为pgex-4t1载体。

进一步地，所述重组菌表达乙酰乙酰辅酶a硫解酶atob、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶erg13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶thmg1、甲羟戊酸激酶erg12、磷酸甲羟戊酸激酶erg8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶mvd1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispa的表达载体为pacycduet-1载体。

进一步地，所述乙酰乙酰辅酶a硫解酶atob、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶erg13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶thmg1的基因连接到pacycduet-1的多克隆位点mcs1位点，所述甲羟戊酸激酶erg12、磷酸甲羟戊酸激酶erg8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶mvd1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispa的基因连接到pacycduet-1的mcs2位点。

本发明另一方面提供了上述产β-榄香烯的重组菌的构建方法，主要包括以下步骤：

(1)将吉玛烯a合酶scgas基因连接到pgex-4t1载体中，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒pgex-4t1-scgas；

(2)将乙酰乙酰辅酶a硫解酶atob基因、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶erg13基因、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶thmg1基因、甲羟戊酸激酶erg12基因、磷酸甲羟戊酸激酶erg8基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶mvd1基因、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi基因和法呢烯基焦磷酸合酶ispa基因连接到pacycduet-1载体中，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒pacycduet-fpp；

(3)将步骤(1)所得的pgex-4t1-scgas重组质粒和步骤(2)所得的pacycduet-fpp共同转化感受态细胞，挑取阳性克隆即得产β-榄香烯的重组菌株。

进一步地，步骤(3)中的感受态细胞为e.coilbl21(de3)。

本发明提供了一种利用上述产β-榄香烯的重组菌生产β-榄香烯的方法，所述方法主要包括以下步骤：

(1)在转速50～300rpm，温度20～32℃的培养条件下，培养上述产β-榄香烯的重组菌，待重组菌液浓度a600为0.2～2时，加入iptg诱导剂至终浓度为0.01～1.0mm，继续培养至12-120h；

(2)使用有机溶剂萃取发酵液中的β-榄香烯，离心收集有机相，即得。

进一步地，所述培养的培养基为液体lb培养基。

进一步地，所述有机溶剂为乙酸乙酯、己烷、石油醚或氯仿中的一种或2种以上的混合物。

进一步地，所述有机溶剂与发酵液的体积比2:1～1:20。

本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

1.本发明构建的产β-榄香烯重组菌具备产量高、纯度高、低成本、无污染等特点,适于工业化生产β-榄香烯。

2.本发明的产β-榄香烯重组菌经发酵条件优化后β-榄香烯产量高达156.94mg/l。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。

图1重组质粒pacycduet-fpp示意图。

图2重组菌株和β-榄香烯的产量对应图。

图3共同表达pgex-4t1-scgas和pacycduet-fpp重组菌发酵条件正交实验组合中的β-榄香烯产量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

下述实施例中，采用的pgex-4t1载体、pacycduet-1购自于上海生工生物有限公司，e.colitrans-1和e.coilbl21(de3)感受态细胞购自于上海源叶生物科技有限公司。

实施例1重组质粒pgex-4t1-scgas构建

依据ncbi数据库中加拿大一枝黄花来源的吉玛烯a合酶scgas，其核苷酸序列如seqidno.1所示,其氨基酸序列如seqidno.2所示。由生工生物工程(上海)股份有限公司依据大肠杆菌密码子进行优化、合成基因和测序，获得密码子优化后的核苷酸序列如seqidno.3所示，并插入到pbluescriptiisk(+)载体中，构成pbluescriptiisk(+)-scgas重组质粒。

将pbluescriptiisk(+)-scgas重组质粒和pgex-4t1质粒分别用ecori与sali进行双酶切后(20μl酶切总体系中，10×quic.cutgreenbuffer2μl，ecori与sali各1μl，质粒pbluescriptiisk(+)-scgas或pgex-4t1各8μl，ddh2o8μl)，跑1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收后，连接入pgex-4t1载体(10μl连接总体系中，solutioni5μl，pgex-4t1线性化载体1μl，scgas片段4μl，16℃反应3小时)，转化e.colitrans-1感受态细胞，涂布含100mg/l的lb/amp平板，37℃培养过夜，挑取转化子进行菌落pcr验证(20μlpcr体系中，10×extaqbuffer2μl，dntp2μl，scgas-f和scgas-r各1μl，菌液1μl，extaq酶0.3μl，ddh2o12.7μl；pcr反应条件首先98℃变性5min；其次98℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，32个循环；最后72℃再延伸15min；引物序列见表1)，提取阳性菌落的质粒即pgex-4t1-scgas重组质粒。

表1.引物序列表

实施例2重组质粒pacycduet-fpp构建

2.1基因全长序列的获得

提取大肠杆菌trans-1和酿酒酵母s288c全基因组序列。依据ncbi上公布的atob、erg13、thmg1、erg12、erg8、mvd1、idi、ispa基因序列设计引物(7-22号引物，序列见表1)，以上述大肠杆菌基因组dna为模板扩增atob、idi、ispa，以酵母基因组dna为模板扩增erg13、thmg1、erg12、erg8、mvd1，使用高保真酶primestar^gxl(takara)进行扩增(50μlpcr体系中，5×primestarbuffer10μl，dntp4μl，引物-f和引物-r各1μl，模板1μl，primestar酶0.5μl，ddh2o32.5μl；pcr反应条件首先98℃变性5min；其次98℃变性10sec，55-60℃退火5sec，68℃延伸1-2min，32个循环；最后，68℃再延伸15min)，跑1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收后，回收产物使用extaq酶进行加a尾反应，与pmd18-t载体连接后，转化e.colitrans-1感受态细胞，涂布含100mg/l的lb/amp平板，37℃培养过夜，挑取转化子进行菌落pcr验证，阳性克隆送上海生工生物有限公司进行测序，测序正确的菌落，提取质粒后可作为后续载体构建的模板。

2.2利用重叠pcr原理构建操纵子a和b

操纵子a中包含基因atob、erg13、thmg1，操纵子b中包含基因erg12、erg8、mvd1、idi、ispa。分别以步骤2.1中含有atob、erg13、thmg1质粒为模板，用高保真酶primestar^gxl进行pcr扩增，使用各自基因正反向引物(23-28号引物，序列见表1)，进行第一轮pcr反应，分别扩增上述3个基因(pcr反应条件首先98℃变性5min；其次98℃变性10sec，55-60℃退火5sec，68℃延伸1-2min，15个循环；最后，68℃再延伸15min)，然后以上述pcr产物各1μl为模板，使用23号和28号引物，进行第二轮pcr反应(pcr反应条件首先98℃变性5min；其次98℃变性10sec，55-60℃退火5sec，68℃延伸1-2min，32个循环；最后，68℃再延伸15min)，跑1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收后，即为操纵子a。操纵子b的构建过程类似操纵子a，仅使用不同引物扩增不同基因，第一轮pcr使用29-38号引物分别扩增erg12、erg8、mvd1、idi、ispa基因，第二轮使用29号和38号引物。

2.3使用okclondna连接试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)具体操作方法见试剂盒说明书，将操纵子a同源重组到pacycduet-1载体的多克隆位点1(mcs2)的sali位点，将操纵子b同源重组到pacycduet-1载体的多克隆位点2的xhoi位点，即获得pacycduet-fpp重组质粒。

实施例3高产β-榄香烯重组菌的构建

3.1用质粒pgex-4t1或pgex-4t1-scgas与pacycduet-1或pacycduet-fpp共同转化e.coilbl21(de3)感受态，涂布lb/amp&cm抗性平板，过夜培养后，挑取单克隆使用pgex-4t1载体上的通用引物m13-f&m13-r和pacycduet-1载体上的通用引物cm-f&cm-r(3-6号引物，序列见表1)进行菌落pcr鉴定，阳性克隆即分别为pgex-4t1/pacycduet-fpp/bl21、pgex-4t1-scgas/pacycduet-fpp/bl21、pgex-4t1-scgas/pacycduet-1/bl21、pgex-4t1/pacycduet-1/bl21重组菌株。

3.2上述步骤3.1获得的4种重组菌株分别接种到至含amp&cm抗生素的2ml液体lb培养基中，37℃恒温震荡培养箱中180rpm过夜培养。第二天以1：50的比例扩接至50ml含amp&cm抗生素的液体lb培养基中，37℃恒温震荡培养箱中继续培养至菌液浓度a600约为2，加入10μl浓度为0.5m的iptg及10ml的正十二烷溶液，28℃恒温震荡培养箱内，180rpm培养48h。将发酵液冷却至室温，等体积分装至3个50ml离心管内，再在每个离心管内加入20ml乙酸乙酯，用封口膜封口震荡混匀抽提，并超声5分钟；室温下12000rpm离心10min，收集上清液至圆底烧瓶；在28℃，50rpm的旋转蒸发仪上旋至无乙酸乙酯，收集正十二烷；加入适量无水na2so4去除有机相内水分，再次离心收集上清，即为发酵产物。

3.3将步骤3.2发酵产物用0.22μm有机滤膜过滤，并用乙酸乙酯稀释200倍，加入终浓度为20mg/l乙酸壬酯为内参，样品使用gc-ms检测，通过β-榄香烯与内参的峰面积比值，计算β-榄香烯的含量(如图2所示)。gc-ms检测条件：石英毛细管柱hp-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：80℃，停留3min；10℃/min升至210℃，停留1min。载气：高纯氦气，流量设置为1ml/min；进样口及接口温度分别设置为250℃与280℃；进样量1μl；离子源ei；电子能量70ev；离子源温度250℃；扫描质量范围35～550amu；溶剂延迟6.5min。

结果表明，只表达pgex-4t1-scgas的重组菌中β-榄香烯的产量为49.21mg/l(图2，scgasb)，而共同表达pgex-4t1-scgas和pacycduet-fpp的重组菌中β-榄香烯的产量为146.88mg/l(图2，scgasd)，产量提高了2.98倍。因此，共同表达pgex-4t1-scgas和pacycduet-fpp的重组菌可作为β-榄香烯的量产的重组菌株。

实施例4高产β-榄香烯重组菌的发酵条件优化

活化步骤3.1中获得的pgex-4t1-scgas/pacycduet-fpp/bl21重组菌进行发酵条件优化。影响发酵产物产量的主因素包括iptg添加时菌的浓度、培养温度、iptg使用浓度及诱导时长，分别选择3个不同的实验条件(如表2所示)设计l9(3⁴)正交实验表(如表3所示)，并使用正交实验的极差分析法分析4个因素对β-榄香烯产量的影响。按照方法3.2制备待检测样，使用3.3方法检测样品中β-榄香烯的含量变化，并计算和评估各因素对β-榄香烯产量的影响。

通过正交实验的极差分析法确定的各因素对β-榄香烯产量的主次关系结果如表4所示，不同发酵条件下，β-榄香烯产量如图3所示，最终确定发酵条件为重组菌的a600为0.5时添加iptg，iptg的终浓度为0.1mm，在28℃摇瓶发酵72h时，β-榄香烯的产量达到156.94mg/l。

表2.正交因素水平

表3.正交实验条件

表4.β-榄香烯的产量与各因素的关系表

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>大连大学

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