抗VISTA蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗vista蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。

背景技术：

vista(v-typeimmunoglobulindomain-containingsuppressoroft-cellactivation，激活的免疫球蛋白)，是一种近期发现的免疫负调节检查点，限制了t细胞有效攻击肿瘤的能力。人类vista与小鼠有90％同源性。同鼠科一样，人vista大多在造血组织或者大量白细胞浸润的组织中提取，这是对vista免疫相关功能的重要提示。vista蛋白在人体内的表达与自体血供有明显的相关性，其中胎盘、肺脏、脾脏和白细胞中表达量往往最高，而在细胞水平上则以巨噬细胞、脾cd11b+单核细胞、cd11c+树突状细胞、cd4+t细胞和cd8+t细胞上表达较高，在b细胞上则少有表达。

近年来，t细胞免疫抑制方面有着明确功能的新的靶标分子出现，即免疫检查点分子t细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域(vista)，前期的动物实验证实：封闭了vista靶点、将vista与其他免疫检查点抑制剂，例如pd-1(程序性死亡因子)联合使用都能起到杀伤肿瘤的作用。vista与pd-l1具有同源性，且vista与pd-1/pd-l1有着不同信号通路，来抑制t细胞免疫活性。

在对抗pd-1或抗ctla-4的肿瘤免疫治疗时出现获得性抵抗机制的研究中，发现vista可能代表另一个补偿性的抑制性通路。在肿瘤的抗pd-1/ctla4治疗出现获得性免疫抵抗时，结合vista和pd-1/ctla4联合阻滞可能是癌症治疗的一个有前途的新选择。vista免疫检查点已逐渐成为肿瘤免疫抑制剂治疗研宄的热点，并在肺癌、胃癌、黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌、前列腺癌等肿瘤中已有相关研究报道。

技术实现要素：

发明人提供了一种抗vista蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为seqidno.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为seqidno.5所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的dna序列为seqidno.2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的dna序列为seqidno.3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别vista蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体为小鼠igg2a亚型单克隆抗体。

进一步地，所述抗vista单克隆抗体由保藏号为cgmccno20766的杂交瘤细胞株产生。

发明人又提供了一种抗vista蛋白单克隆抗体的制备方法，选取vista蛋白中seqidno.1所示的氨基酸序列(第269位至第289位),在其羧基端添加了一个半胱氨酸后，与载体蛋白klh进行偶联作为免疫原。

发明人还提供了一株分泌抗vista蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株11a4，所述细胞株已于2020年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno20766，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

发明人还提供了上述单克隆抗体在vista蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

发明人最后提供了一种vista蛋白免疫组化检测试剂，所述免疫组化检测试剂含有重链可变区的氨基酸序列为seqidno.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为seqidno.5所示的氨基酸序列的抗vista单克隆抗体为其有效成分。

区别于现有技术，本发明所产生的有益技术效果为：上述技术方案选取vista蛋白c末端的第269位至第289位氨基酸为抗原肽,偶联klh后得到的免疫原对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗vista蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株11a4,以及由该细胞株所分泌的抗vista蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达vista蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1为尿路上皮癌免疫组化染色结果对比图；其中左为11a4分泌的vista，右为市售vista。

图2为上皮样血管肉瘤免疫组化染色结果对比图；其中左为11a4分泌的vista，右为市售vista。

图3为胎盘滋养层免疫组化染色结果对比图；其中左为11a4分泌的vista，右为市售vista。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1免疫原的制备

一、免疫原制备

依据uniprot中登录号为q9h7m9的蛋白质序列进行序列和二级结构分析，全长为311个氨基酸长度的vista蛋白分子量约为33kda左右。依据通过在线服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/netsurfp/预测的蛋白的二级结构(secondarystructure)和表面可及性(surfaceaccessibility)参数，并通过对其抗原性指数(jamesonba,wolfh.theantigenicindex:anovelalgorithmforpredictingantigenicdeterminants.computapplbiosci.1988,4(1):181-6.)的分析结果，选择第269-289位的氨基酸序列rqpsesgrhllsepstplspc作为抗原肽进行化学合成，为便于偶联，在该多肽的羧基端添加了一个半胱氨酸用于提供巯基偶联。

二、多肽的偶联及纯化

选择thermoscientific(货号：77653)的马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白试剂盒，按照试剂盒提供的流程操作。对于待偶联的多肽，首先以ellman试剂(thermoscientific，货号：22582)检测多肽中自由巯基：在96孔板中加入100μlellman试剂储备液，再加入10μl多肽溶液，用nanodrop分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果od值>0.15做下一步；od值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；od值<0.05返回多肽合成步骤重质控。开始偶联时，在每个mcklh包装中加入200μl去离子水，配制成10mg/ml的klh溶液，在500μl的imjectedc偶联缓冲液中溶解2mg半抗原，将500μl多肽溶液加入到200μl的载体蛋白溶液中，将1ml去离子水加入到一个包装的edc(10mg)中，缓慢振摇至完全溶解，取50μl加入到mcklh多肽溶液中，反应2小时后，经脱盐柱处理除去未偶联的交联剂和盐类，得到vista-klh。

实施例2杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂(sigma公司，f5881)乳化，免疫2只spf级balb/c雌性小鼠和2只icr小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(sigma公司，f5506)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接elisa(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(atccnumbercrl-8287)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的peg1500(roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的imdm(sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(paa公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xhat(sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％co2培养箱中培养。

三、克隆化及elisa筛选阳性杂交瘤细胞

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％co2培养箱中培养。3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清用免疫原和合成多肽分别进行elisa筛选。阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1％ht(sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次elisa筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和ht)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次elisa筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数约5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用hitraprproteinaff(ge公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。sds-page胶鉴定纯度，bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mmpbs(ph7.4)稀释包被羊抗鼠igg(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％tween的pbs(pbs-t)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％bsa和3％蔗糖的pbs)，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用pbs-t清洗3次。用封闭液1：1000稀释hrp标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释hrp标记的羊抗鼠(igm，igg1，igg2a，igg2b，igg3，iga)抗体(southernbiotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加50μl含0.15％abts(southernbiotech公司)和0.03％h2o2的柠檬酸缓冲液(ph4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的od值。

结果显示，本发明单克隆抗体为igg2a型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

取实施例1中制备的vista多肽，包被浓度为2μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，pbs-t洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，pbs-t洗3次。将实施例3中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。hrp标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。每孔加入100μl含0.1％tmb(sigma公司)和0.03％h2o2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5m硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出od值对应抗体稀释倍数的曲线，找到最大结合od值的一半时对应的稀释倍数a，利用下列公式计算出该抗体的亲和常数为1.92×10⁹。

三.单抗反应特异性和应用效果

取实施例1中制备的vista多肽，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在bio-rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到pvdf膜上(millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的tbs-t封闭液中4℃过夜。加入由11a4杂交瘤分泌的抗体的单克隆抗体(1：1000稀释)4℃孵育过夜。用tbs-t洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次tbst洗膜，加入ecl超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以chemidocmp多色荧光成像系统(bio-rad)进行化学发光图像数据的采集。

实施例5抗体的可变区序列测定

取培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。trizol法提取杂交瘤细胞总rna，取9μl总rna，加入2.5μloligo(dt)12–18primer(10mm)，及5μldntps，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μlrtbuffer(5x)，2.5μldtt(0.1m)及1μl逆转录酶，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cdna保存在-20℃。将获得的第一链cdna进行pcr扩增，在50μl反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》(科学出版社，2005年出版)一书中鼠单抗引物序列设计和合成。

其余dntps及缓冲液均按照常规加入，最后加入cdna模板1μl和1u热启动taqdna聚合酶。设置pcr扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μlpcr产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离，轻链(κ轻链)的长度在320-340bp之间，重链的长度在340-370bp之间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至t载体或表达载体测序。

实施例6.免疫组化组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行he切片染色，以确定肿瘤部位。使用3dhistech公司的全自动组织芯片仪制作组织芯片。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入68℃烤箱内10分钟,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到50℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入68℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二.ihc染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，pbs冲洗3×3分钟。滴加3％h2o2孵育10分钟，pbs冲洗3×3分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，pbs冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育15-30分钟，pbs冲洗3×3分钟，甩去pbs，用新鲜配置的dab显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，pbs返蓝30秒。按照85％(3分钟)-95％(3分钟)-100％(3分钟)-100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三.数据统计

1、肿瘤组织芯片检测结果：

将本抗体vista(11a4)和市售抗体vista(d5l5t)在45例肿瘤组织的多肿瘤组织芯片中的进行同步检测并比较检测结果。

vista的免疫组化结果进行统计。整个试验过程采取双盲设计，统计结果如下表：

结果显示:11a4细胞株所分泌的抗vista蛋白单克隆抗体的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。在阳性检测中，在1例上皮样血管肉瘤和1例尿路上皮癌中的免疫细胞染色细胞数和染色强度明显高于市售vista的染色强度，说明其敏感度更高，有效避免假阴性结果。

图1为尿路上皮癌免疫组化染色结果对比图(左为11a4细胞株所分泌的vista，右为市售vista)。

图2为上皮样血管肉瘤免疫组化染色结果对比图(左为11a4细胞株所分泌的vista，右为市售vista)。

2、正常组织芯片检测结果：

正常组织芯片包括30种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

将本抗体(11a4)和市售抗体(d5l5t)在正常组织芯片上进行同步检测，阴阳性检测结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

图2为胎盘滋养层免疫组化染色结果对比图(左为11a4细胞株所分泌的vista，右为市售vista)。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110>福州迈新生物技术开发有限公司

<120>抗vista蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

<130>2021

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<400>1

argglnprosergluserglyarghisleuleusergluproserthr

151015

proleuserprocys

20

<210>2

<211>339

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>2

gaggtgcaactgcaggagtcagggactgaacttttgaggcctgggtcttcagtcaagttg60

tcctgcaagacttctggcttcaccttcaccagattctggatgcactgggtgagacagagg120

ccaggacaaggccttgagtggattggggagattaatcctagcaatggtgccagtgaaaac180

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atgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtacaaaaggattt300

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<210>3

<211>318

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

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gatatcgttctcactcagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcacc60

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accaagctggaaataaaa318

<210>4

<211>113

<212>prt

<213>人工序列(artificial)

<400>4

gluvalglnleuglngluserglythrgluleuleuargproglyser

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354045

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65707580

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859095

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100105110

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<210>5

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<400>5

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