农杆菌介导的红椿遗传转化方法

本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，涉及一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法。

背景技术：

红椿(toonaciliata)，为楝科(meliaceae)香椿属(toona)阔叶树种。在我国，红椿天然居群具有零星分布的特点，主要在华南、华中、华东及西南地区分布，因其材质好，色泽艳丽，花纹美丽，芯材呈现生红褐色，红椿被冠有“中国桃花心木”之称，是优良的家具用材，被广泛应用在家具设计、车船制造及室内装饰领域；其树形美观，也可以作为行道树栽种；红椿也是近年来得到普遍关注的药用植物，红椿根茎叶都可以入药，枝叶提取物具有抗病毒、抗菌等生物活性，具有良好的药用功效；该树种具有早期生长迅速等特点，其生长量均超过一般人工栽培的常绿阔叶树种。因此，在我国南方地区，红椿已成为重点开发和利用的优质速生用材树种。

目前研究发现，在早期生长过程中，红椿极易遭到害虫取食危害，直接导致枝条中空、断折，从而形成多头树甚至导致幼树死亡，这使得红椿难以成材，乃至成为红椿种植的致命伤害。对红椿危害较大的害虫是麻楝蛀斑螟，若不能有效地解决麻楝蛀斑螟对红椿的侵害，该树种则不能大范围推广，严重制约了该速生阔叶树种的可持续发展。同时，在部分林分试验地中，红椿极易遭受反复冻害，使其无法正常生长。

通过遗传转化技术，将理想的基因转移到受体植物基因组中去，达到定向改良的目的，为树木的育种提供了新途径。目前，随着相关基因的分离和鉴定及离体培养再生技术的进步，通过遗传转化方法培育具有优良性状的新品种已经成为现实。随着转基因研究的不断深入，所能改变的性状并不只局限于抗虫或者抗病，而且延伸到对环境胁迫的抗性等方面中。然而，红椿作为木本植物，存在生长周期长、具有高度杂合性以及再生能力差等特点，使得遗传转化具有一定困难和特殊性，而且红椿自身的生物学特性导致其在离体组织培养过程中存在难以消毒彻底从而容易产生内生菌污染、外植体褐化难以克服等技术难题，这严重影响了红椿遗传转化体系的成功构建，导致至今针对红椿的遗传转化体系的研究还尚未见报道。基于此，目前还没有一套合适的遗传转化体系能用于将抗性基因等转入红椿从而达到推进红椿定向遗传改良。

技术实现要素：

基于此，有必要针对红椿遗传转化体系缺失的现状，本发明的主要目的是提供一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法，该方法实现了遗传转化技术在红椿中的成功应用并获得较高的转化率。

本发明的主要目的是通过以下技术方案实现的：

一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法，所述方法包括如下步骤：

以红椿的叶片为外植体，用携带有植物表达载体的根癌农杆菌的菌液侵染所述外植体；

将经过侵染的所述外植体接种于共培养培养基，共培养；

对经过共培养的所述外植体进行诱导培养，诱导培养包括：愈伤组织的诱导培养、不定芽的诱导培养、芽的诱导培养、根的诱导培养；

在其中一个实施例中，所述菌液中含有45mmol/l～155mmol/l的乙酰丁香酮，所述共培养培养基中含有145mmol/l～155mmol/l的乙酰丁香酮。

在其中一个实施例中，所述共培养培养基为含2.8mg/l～3.2mg/l6-ba、0.8mg/l～1.2mg/lkt、0.03mg/l～0.06mg/lnaa、28g/l～32g/l蔗糖、4.8g/l～5.2g/l琼脂和145mmol/l～155mmol/l乙酰丁香酮的ms培养基。

在其中一个实施例中，共培养的条件包括：避光，温度为23℃～27℃，时长为22h～26h。

在其中一个实施例中，侵染之前，对所述外植体进行超声波处理，超声波处理的时长为25s～35s，超声波处理的功率为4.5khz～5.5khz。

在其中一个实施例中，所述植物表达载体为pcambia1305.2，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌eha105。

在其中一个实施例中，不定芽的诱导培养的步骤包括：

所述愈伤组织的诱导培养采用t1培养基，所述t1培养基为含2.8mg/l～3.2mg/l6-ba、0.8mg/l～1.2mg/lkt、0.03mg/l～0.06mg/lnaa、28g/l～32g/l蔗糖、4.8g/l～5.2g/l琼脂和90mg/l～110mg/l头孢噻肟钠的ms培养基；

所述不定芽的诱导培养采用t2培养基，所述t2培养基为含2.8mg/l～3.2mg/l6-ba、0.8mg/l～1.2mg/lkt、0.03mg/l～0.06mg/lnaa、28g/l～32g/l蔗糖、4.8g/l～5.2g/l琼脂、90mg/l～110mg/l头孢噻肟钠和9mg/l～11mg/l卡那霉素的ms培养基；

所述芽的诱导培养采用t3培养基，所述t3培养基为含0.25mg/l～0.35mg/l6-ba、0.18mg/l～0.22mg/lnaa、28g/l～32g/l蔗糖、4.8g/l～5.2g/l琼脂、90mg/l～110mg/l头孢噻肟钠和9mg/l～11mg/l卡那霉素的ms培养基。

所述根的诱导采用t4培养基，所述t4培养基为含0.08mg/l～0.12mg/lnaa、13g/l～17g/l蔗糖、4.8g/l～5.2g/l琼脂、90mg/l～110mg/l头孢噻肟钠和9mg/l～11mg/l卡那霉素的ms培养基。

在其中一个实施例中，诱导培养的条件包括：温度为23℃～27℃，光照强度为2300lx～2700lx，每天光照时长为10h～14h，培养基更换频率为每13d～16d更换一次。

在其中一个实施例中，所述菌液的od600为0.4～0.8。

在其中一个实施例中，所述方法还包括对遗传转化所得产物进行鉴别的步骤。

在其中一个实施例中，鉴别采用的方法包括pcr分子检测、报告基因检测和激光共聚焦荧光显微检测中的一种或者两种以上的结合。

在其中一个实施例中，所述方法还包括对鉴别出的阳性植株进行炼苗和移栽的步骤。

在其中一个实施例中，所述外植体经预培养之后再用携带有植物表达载体的根癌农杆菌的菌液侵染；预培养的时长为1d～3d，预培养的培养基为含2.8mg/l～3.2mg/l6-ba、0.8mg/l～1.2mg/lkt、0.03mg/l～0.06mg/lnaa、28g/l～32g/l蔗糖、4.8g/l～5.2g/l琼脂的ms培养基，预培养的条件包括：避光，温度为23℃～27℃。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明针对红椿，以叶片为外植体，在用携带有植物表达载体的根癌农杆菌的侵染液侵染所述外植体以及对侵染过的外植体进行共培养的过程中，通过同时在侵染液和共培养培养基中添加乙酰丁香酮，特别是进一步配合对外植体进行适度的超声处理以及组织培养条件的优化，从而首次成功实现农杆菌介导的红椿遗传转化，并且遗传转化率较高(遗传转化率保持在10％左右)。同时，发明人通过重复试验发现，采用本发明的方法重复性和稳定好，不受季节环境等影响，可适用于批量化育苗，有利于推进红椿的产业化发展。整体来讲，本发明提供的方法，为实现外源基因对红椿的改良奠定了技术基础并提供了有效平台。

附图说明

图1为本发明一个实施例中的预培养图；

图2为本发明一个实施例中的共培养图；

图3为本发明一个实施例中的缓冲愈伤组织诱导培养图；

图4为本发明一个实施例中的阳性愈伤组织诱导培养(培养30d)图；

图5为本发明一个实施例中的阳性愈伤组织诱导培养(培养45d)图；

图6为本发明一个实施例中的阳性不定芽伸长培养(培养60d)图；

图7为本发明一个实施例中的阳性苗生根培养(培养90d)图；

图8为本发明一个实施例中的pcr分子检测结果图；图中，m.maeker；ck-.阴性对照；ck+.阳性对照；1～5、7～8、10～12均为阳性苗样品；6、9为未转化苗样品；

图9为本发明一个实施例中的gus染色结果图；图中，a.阴性对照；b.阳性苗；

图10为本发明一个实施例中激光共聚焦荧光显微镜；

图11为不同浓度卡那对外植体诱导率的影响；

图12为不同浓度头孢噻肟钠对外植体诱导率的影响。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明实施例提供一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法，所述方法包括如下步骤：

以红椿的叶片为外植体，用携带有植物表达载体的根癌农杆菌的菌液侵染所述外植体；

将经过侵染的所述外植体接种于共培养培养基进行共培养；

对经过共培养的所述外植体进行诱导培养，诱导培养包括：愈伤组织的诱导培养、不定芽的诱导培养、芽的诱导培养、根的诱导培养；

所述菌液中含有乙酰丁香酮，所述共培养培养基中含有乙酰丁香酮；

本发明实施例在侵染前对外植体进行了预培养，预培养培养基及培养条件与侵染后的共培养培养基与培养条件基本一致，有利于外植体提前适应培养基及培养条件，从而提高转化率。本发明实施例预培养的时长为1d～3d，预培养的培养基为含2.8mg/l～3.2mg/l6-ba、0.8mg/l～1.2mg/lkt、0.03mg/l～0.06mg/lnaa、28g/l～32g/l蔗糖、4.8g/l～5.2g/l琼脂的ms培养基，预培养的条件包括：避光，温度为23℃～27℃。

可以理解的是，所述外植体经切割产生伤口后再进行侵染。

本发明实施例在侵染菌液以及共培养培养基中添加了乙酰丁香酮(as)，as可以通过诱导农杆菌vir区基因的活化与表达，促进t-dna的加工与转移，从而使农杆菌t-dna更易进入植物基因组并与其整合，从而提高转化率。

本发明实施例所述的“愈伤组织的诱导培养”就是从外植体伤口诱导培养出愈伤组织，是缓冲培养，本发明实施例在筛选培养(不定芽的诱导培养、芽的诱导培养、根的诱导培养)前进行了缓冲培养，是由于外植体对卡那霉素十分敏感，为了避免外植体接触到卡那霉素后直接褐化死亡，在进行筛选培养之前进行缓冲培养有利于从而提高转化率。优选地，缓冲培养的时长为12d～16d。

本发明实施例在t1培养基、t2培养基、t3培养基、t4培养基中添加了头孢噻肟钠(cef)，cef用于控制农杆菌过量生长，避免组织培养过程中出现严重污染；本发明实施例在t2培养基、t3培养基、t4培养基中添加了卡那霉素(kan)用于有效筛选转化组织，使未转化成功的外植体死亡。

本发明实施例提供的上述方法，结合红椿高效再生体系，在遗传转化体系构建中进行了多方面的实验和摸索，可实现对红椿抗逆研究等多方面的遗传改良，填补了该珍贵树种在遗传转化中获得转基因植株的空白，为红椿的品种改良和遗传分析提供了有效的途径。本发明实施例方法，转化率在10％左右，不仅为红椿快繁技术提供可靠的研究平台，更进行为红椿基因工程改造创造了有利条件。

可以理解的是，本发明实施例所述的“植物表达载体”，包含有筛选基因、报告基因，当然，还可以进一步包含携带有抗虫基因、抗病基因等。以植物表达载体pcambia1305.2为例，其筛选基因为抗卡那霉素基因，报告基因为gus基因。

优选地，本发明实施例所述的“叶片”为红椿的无菌种子苗叶片。以此为外植体来源，不受环境、季节限制且取材方便；并且，克服了外植体灭菌难、褐化严重、生根困难等问题；选择以红椿叶片为受体，充分利用了叶片含有较多原生质体易产生不定芽的优势，并且为后续选择母树叶片为受体奠定了坚实的实验基础，可达到保证母树优良性状的目的。

在其中一个示例中，所述t1培养基(缓冲培养基)培养基中含有90mg/l～110mg/l的头孢噻肟钠，筛选培养的培养基包括从外植体伤口诱导的愈伤组织到不定芽的诱导培养基(t2培养基)、所述不定芽到芽的诱导培养基(t3培养基)、所述芽到芽生根的诱导培养基(t4培养基)，均含有9mg/l～11mg/l的卡那霉素和90mg/l～110mg/l的头孢噻肟钠。参照图11和图12，分别为不同浓度卡那和不同浓度头孢噻肟钠对外植体诱导率的影响。

在其中一个示例中，所述菌液中含有45mmol/l～155mmol/l的乙酰丁香酮，所述共培养培养基中含有145mmol/l～155mmol/l的乙酰丁香酮。

在其中一个示例中，所述共培养培养基为含2.8mg/l～3.2mg/l6-ba、0.8mg/l～1.2mg/lkt、0.03mg/l～0.06mg/lnaa、28g/l～32g/l蔗糖、4.8g/l～5.2g/l琼脂和145mmol/l～155mmol/l乙酰丁香酮的ms培养基。

在其中一个示例中，共培养的条件包括：避光，温度为23℃～27℃，时长为22h～26h。

在其中一个示例中，侵染之前，对所述外植体进行超声波处理，超声波处理的时长为25s～35s，超声波处理的功率为4.5khz～5.5khz。本发明实施例在进行农杆菌侵染进行之前结合了超声波震荡对红椿外植体进行短时间破碎处理，大大增加了农杆菌对外植体细胞的侵染成功率。

在其中一个示例中，所述植物表达载体为pcambia1305.2，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌eha105。

在其中一个示例中，所述愈伤组织的诱导培养(即对经过共培养的所述外植体进行缓冲培养)采用t1培养基，再用t3培养基对所述不定芽进行伸长培养至芽高2～4cm；

所述t1培养基为含2.8mg/l～3.2mg/l6-ba、0.8mg/l～1.2mg/lkt、0.03mg/l～0.06mg/lnaa、28g/l～32g/l蔗糖、4.8g/l～5.2g/l琼脂和90mg/l～110mg/l头孢噻肟钠的ms培养基；

所述不定芽的诱导培养(即诱导培养健康的愈伤组织至长出不定芽)采用t2培养基，所述t2培养基为含2.8mg/l～3.2mg/l6-ba、0.8mg/l～1.2mg/lkt、0.03mg/l～0.06mg/lnaa、28g/l～32g/l蔗糖、4.8g/l～5.2g/l琼脂、90mg/l～110mg/l头孢噻肟钠和9mg/l～11mg/l卡那霉素的ms培养基；

所述芽的诱导培养(对所述不定芽进行伸长培养至芽高2cm～4cm)采用t3培养基，所述t3培养基为含0.25mg/l～0.35mg/l6-ba、0.18mg/l～0.22mg/lnaa、28g/l～32g/l蔗糖、4.8g/l～5.2g/l琼脂、90mg/l～110mg/l头孢噻肟钠和9mg/l～11mg/l卡那霉素的ms培养基。

在其中一个示例中，根的诱导培养包括用t4培养基对所述芽进生根培养；

所述根的诱导培养(即芽至芽生根的诱导培养)采用t4培养基，所述t4培养基为含0.08mg/l～0.12mg/lnaa、13g/l～17g/l蔗糖、4.8g/l～5.2g/l琼脂、90mg/l～110mg/l头孢噻肟钠和9mg/l～11mg/l卡那霉素的ms培养基。

在其中一个示例中，诱导培养的条件包括：温度为23℃～27℃，光照强度为2300lx～2700lx，每天光照时长为10h～14h，培养基更换频率为每13d～16d更换一次。

本发明实施例针对红椿自身的特点，更为了保证获得大量转基因植株，提高转化效率，本发明实施例对培养方式进行了改良，先进行了预培养、共培养以及缓冲培养，既可提高转化效率又克服了较为脆弱的外植体立即接触抗生素所带来的大量死亡，再选择了3种选择培养基对农杆菌侵染的外植体依次进行了选择筛选培养，既满足保证了头孢噻肟钠的抑菌效果和卡那的筛选效果，又满足了外植体在不同发育阶段的营养需求。

本发明实施例中，经前期实验确定卡那霉素筛选最适浓度为10mg/l，头孢噻肟钠抑菌最适浓度为100mg/l，在上述各种诱导培养基中加入适量抗生素，可筛选掉未转化的植株以及获得长势良好的转基因植株，并接着经过pcr分子检测、gus染色、激光共聚焦荧光显微镜均可以验证转基因植株材料，步骤简便，减少了实验工作量，准确度高，达到稳定严格有效的筛选目的。

在其中一个示例中，所述菌液的od600为0.4～0.8，例如为0.6。

在其中一个示例中，所述方法还包括对遗传转化所得产物进行鉴别的步骤。

在其中一个示例中，鉴别采用的方法包括pcr分子检测、报告基因检测和激光共聚焦荧光显微检测中的一种或者两种以上的结合。

在其中一个示例中，所述方法还包括对鉴别出的阳性植株进行炼苗和移栽的步骤。

实施例1

本实施例提供一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法，包括以下操作步骤：

1.无菌苗及外植体的获得及预培养

1.1将红椿种子去掉双侧翅，在初始温度为45℃的无菌水中浸泡4h，将浮在上部的干瘪种子去除。

1.2将浸泡4h后的种子，在无菌超净台上，用体积百分比浓度75％的酒精溶液灭菌1min，无菌水冲洗1次，用质量百分比浓度10％的次氯酸钠溶液灭菌18min，无菌水冲洗4次，每次冲洗5min。

1.3然后将种子播种于空白的ms培养基中培养，种子培养3d开始萌芽，35d后，无菌苗真叶长出，在超净台切取叶片并对叶片切出2个～3个伤口作为外植体；该步骤中：培养的条件为培养温度25±2℃，黑暗培养至胚根长出，然后转移至光照强度2500lx，光照时间12h条件下进行培养。

1.4接种到预培养培养基中进行预培养，接种时叶片近轴面紧贴培养基(见图1)；该步骤中：

预培养培养基为添加了6-ba3mg/l+kt1mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂5g/l的ms培养基；

所述预培养的培养条件为温度25±2℃，黑暗培养，预培养时间为3d。

2.外植体农杆菌侵染及共培养处理

2.1将步骤1所获取的外植体首先放入无菌水中，在超声波震荡仪中处理30s，超声波功率为5khz，达到破碎细胞的目的。

2.2利用携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液侵染经超声波处理的外植体，植物表达载体中含有筛选标记基因及报告基因，侵染期间置于摇床中不断摇晃，摇晃20min后取出外植体，用无菌水冲洗外植体3次，每次3min，期间不断摇晃，后用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，置于接种盘中晾干；该步骤中：

所述植物表达载体为含有筛选基因的质粒pcambia1305.2，携带抗卡那霉素(kanamycin)的筛选基因，质粒携带含内含子gus报告基因；

所述携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液按照以下步骤制备得到：

将冷冻保存的农杆菌eha105感受态细胞取出放入预冷的电击杯中与质粒进行电击；加入1mllb培养基至电击杯中，转至离心管中，于28℃、150rpm条件下培养1.5h；将100μl该菌液在lb+50mg/l卡那霉素+50mg/l利福平固体培养基上均匀涂板，29℃倒置培养2d，直至菌落长出；挑取单菌落进行pcr检测，确定阳性菌落；将鉴定完成的农杆菌加入到含有50mg/l卡那霉素和50mg/l氯霉素的lb液体培养基中，28℃，150rpm培养过夜，在摇菌13h后加入as50mmol/l直至摇至od600＝0.6的携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液；

侵染是先将处理好的外植体浸泡在无菌水中在超声波震荡仪中处理30s后，再将外植体转至侵染液(即携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液)中，置于摇床28℃、120rpm摇晃20min。

2.3再接种到铺有一层无菌滤纸的共培养培养基中进行共培养，接种时叶片近轴面紧贴培养基(见图2)；该步骤中：

共培养培养基为添加了6-ba3mg/l+kt1mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂5g/l+as150mmol/l的ms培养基；

所述共培养的培养条件为温度25±2℃，黑暗培养，共培养时间为1d。

3.阳性苗获得

3.1将共培养后的外植体首先转接至培养基1(t1)中进行缓冲愈伤诱导培养，培养基1(t1)为添加了6-ba3mg/l+kt1mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂5g/l+头孢噻肟钠100mg/l的ms培养基；缓冲愈伤诱导培养14d(见图3)，切除出现褐化的愈伤组织部分；该步骤中：

缓冲愈伤诱导培养主要是根据红椿叶片对卡那霉素十分敏感，为了避免前期发育阶段出现大量死亡的情况，给外植体一个缓冲培养期可显著提高了农杆菌介导的转化频率。

3.2将步骤3.1所获得健康的愈伤组织转至添加了6-ba3mg/l+kt1mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂5g/l+100mg/l头孢噻肟钠+10mg/l卡那抗生素的不定芽诱导培养基2(t2)中进行不定芽诱导，见图4(培养30d)和图5(培养45d)。

3.3将步骤3.2诱导出的不定芽转至不定芽伸长培养基(t3)中进行不定芽伸长，该不定芽伸长培养基(t3)为添加了6-ba0.3mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖30g/l+琼脂5g/l+100mg/l头孢噻肟钠+10mg/l卡那抗生素的ms培养基，直至获得红椿转基因的健壮芽(见图6，培养60d)。

步骤3.1、3.2以及3.3中，培养基的ph为5.8～6.0，培养的温度为25±2℃，培养的光照强度2500lx，每天光照时间12h，每15d更换一次培养基，既确保培养基成分不流失也防止农杆菌大量繁殖；在愈伤及不定芽诱导培养过程中，叶片外植体以近轴面紧贴培养基的放置方式进行愈伤诱导。

4.转基因植株生根培养

待红椿转基因的健壮芽伸长到4cm时，切取不定芽，接种于ms+naa0.1mg/l+蔗糖15g/l+琼脂5g/l+100mg/l头孢噻肟钠+10mg/l卡那抗生素的生根培养基中(t4)诱导生根培养；该步骤中：诱导生根培养是切取4cm的芽，并切除根基部的坏死的愈伤组织，其生根培养基中(t4)的ph为5.8～6.0，培养的温度为25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h。生根培养90d的阳性苗见图7。

5.转基因植物检测

利用植物表达载体上的筛选标记基因和报告基因进行pcr分子检测(图8)、gus染色(图9)和激光共聚焦荧光显微镜(图10)，检测步骤3中所获得的红椿转基因芽或转基因植株是否为阳性转基因材料；该步骤中：

pcr分子检测引物包括：

gus-f(seqidno.1)：5′-gtcgcgcaagactgtaacca-3′，

gus-r(seqidno.2)：5′-cggcgaaattccatacctg-3′；

pcr反应程序为94℃2min，35个循环(94℃30s，58℃30s，72℃30s)，72℃延伸5min，4℃保存。

6.转基因植株的炼苗及移栽

将鉴定为阳性转基因材料的植株开盖进行适应，然后将植株从培养瓶中取出，洗净根上的培养基，于无菌水中浸泡1h，后移栽到灭菌过的泥炭土与蛭石质量比为2:1的基质中，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后移开塑料袋，按生长需求浇水，得到移栽成功的转基因植株。

本实施例的结果：遗传转化率为15.56％。

实施例2

本实施例提供一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法，包括以下操作步骤：

1.无菌苗及外植体的获得及预培养

1.1将红椿种子去掉双侧翅，在初始温度为45℃的无菌水中浸泡3h，将浮在上部的干瘪种子去除。

1.2将浸泡3h后的种子，在无菌超净台上，用体积百分比浓度75％的酒精溶液灭菌1min，无菌水冲洗1次，用质量百分比浓度10％的次氯酸钠溶液灭菌15min，无菌水冲洗3次，每次冲洗5min。

1.3然后将种子播种于空白的ms培养基中培养，种子培养3d开始萌芽，30d后，无菌苗真叶长出，在超净台切取叶片并对叶片切出2个～3个伤口作为外植体；该步骤中：培养的条件为培养温度25±2℃，黑暗培养至胚根长出，然后转移至光照强度2500lx，光照时间12h条件下进行培养。

1.4接种到预培养培养基中进行预培养，接种时叶片近轴面紧贴培养基；该步骤中：

预培养培养基为添加了6-ba2.8mg/l+kt0.8mg/l+naa0.03mg/l+蔗糖28g/l+琼脂4.8g/l的ms培养基；

所述预培养的培养条件为温度25±2℃，黑暗培养，预培养时间为1d。

2.外植体农杆菌侵染及共培养处理

2.1将步骤1所获取的外植体首先放入无菌水中，在超声波震荡仪中处理25s，超声波功率为4.5khz，达到破碎细胞的目的。

2.2利用携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液侵染经超声波处理的外植体，植物表达载体中含有筛选标记基因及报告基因，侵染期间置于摇床中不断摇晃，摇晃20min后取出外植体，用无菌水冲洗外植体3次，每次3min，期间不断摇晃，后用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，置于接种盘中晾干；该步骤中：

所述植物表达载体为含有筛选基因的质粒pcambia1305.2，携带抗卡那霉素(kanamycin)的筛选基因，质粒携带含内含子gus报告基因；

所述携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液按照以下步骤制备得到：

将冷冻保存的农杆菌eha105感受态细胞取出放入预冷的电击杯中与质粒进行电击；加入1mllb培养基至电击杯中，转至离心管中，于28℃、150rpm条件下培养1h；将100μl该菌液在lb+50mg/l卡那霉素+50mg/l利福平固体培养基上均匀涂板，28℃倒置培养2d，直至菌落长出；挑取单菌落进行pcr检测，确定阳性菌落；将鉴定完成的农杆菌加入到含有50mg/l卡那霉素和50mg/l氯霉素的lb液体培养基中，28℃，150rpm培养过夜，在摇菌12h后加入as45mmol/l直至摇至od600＝0.6的携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液；

侵染是先将处理好的外植体浸泡在无菌水中在超声波震荡仪中处理25s后，再将外植体转至侵染液(即携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液)中，置于摇床28℃、120rpm摇晃20min。

2.3再接种到铺有一层无菌滤纸的共培养培养基中进行共培养，接种时叶片近轴面紧贴培养基；该步骤中：

共培养培养基为添加了6-ba2.8mg/l+kt0.8mg/l+naa0.03mg/l+蔗糖28g/l+琼脂4.8g/l+as145mmol/l的ms培养基；

所述共培养的培养条件为温度25±2℃，黑暗培养，共培养时间为22h。

3.阳性苗获得

3.1将共培养后的外植体首先转接至不定芽诱导培养基1(t1)中进行缓冲愈伤诱导培养，不定芽诱导培养基1(t1)为添加了6-ba2.8mg/l+kt0.8mg/l+naa0.03mg/l+蔗糖28g/l+琼脂4.8g/l+头孢噻肟钠90mg/l的ms培养基；缓冲愈伤诱导培养直至外植体长出愈伤，切除出现褐化的愈伤组织部分；该步骤中：

缓冲愈伤诱导培养主要是根据红椿叶片对卡那霉素十分敏感，为了避免前期发育阶段出现大量死亡的情况，给外植体一个缓冲培养期可显著提高了农杆菌介导的转化频率。

3.2将步骤3.1所获得健康的愈伤组织转至添加了6-ba2.8mg/l+kt0.8mg/l+naa0.03mg/l+蔗糖28g/l+琼脂4.8g/l+90mg/l头孢噻肟钠+9mg/l卡那抗生素的不定芽诱导培养基2(t2)中进行不定芽诱导。

3.3将步骤3.2诱导出的不定芽转至不定芽伸长培养基(t3)中进行不定芽伸长，该不定芽伸长培养基(t3)为添加了6-ba0.25mg/l+naa0.18mg/l+蔗糖28g/l+琼脂4.8g/l+90mg/l头孢噻肟钠+9mg/l卡那抗生素的ms培养基，直至获得红椿转基因的健壮不定芽。

步骤3.1、3.2以及3.3中，培养基的ph为5.8～6.0，培养的温度为25±2℃，培养的光照强度2300lx，每天光照时间10h，每13d更换一次培养基，既确保培养基成分不流失也防止农杆菌大量繁殖；在愈伤及不定芽诱导培养过程中，叶片外植体以近轴面紧贴培养基的放置方式进行愈伤诱导。

4.转基因植株生根培养

待红椿转基因的健壮不定芽伸长到3cm时，切取不定芽，接种于ms+naa0.08mg/l+蔗糖13g/l+琼脂4.5g/l+90mg/l头孢噻肟钠+9mg/l卡那抗生素的生根培养基中(t4)诱导生根培养；该步骤中：

诱导生根培养是切取3cm的不定芽，并切除根部的愈伤组织，其生根培养基中(t4)的ph为5.8～6.0，培养的温度为25±2℃，光照强度2300lx，光照时间10h。

5.转基因植物检测

利用植物表达载体上的筛选标记基因和报告基因进行pcr分子检测、gus染色和激光共聚焦荧光显微镜，检测步骤3中所获得的红椿转基因芽或转基因植株是否为阳性转基因材料；该步骤中：

pcr分子检测引物包括：

gus-f(seqidno.1)：5′-gtcgcgcaagactgtaacca-3′，

gus-r(seqidno.2)：5′-cggcgaaattccatacctg-3′；

pcr反应程序为94℃2min，35个循环(94℃30s，58℃30s，72℃30s)，72℃延伸5min，4℃保存。

6.转基因植株的炼苗及移栽

将鉴定为阳性转基因材料的植株开盖进行适应，然后将植株从培养瓶中取出，洗净根上的培养基，于无菌水中浸泡1h，后移栽到灭菌过的泥炭土与蛭石质量比为2:1的基质中，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后移开塑料袋，按生长需求浇水，得到移栽成功的转基因植株。

本实施例的结果：遗传转化率为13.33％。

实施例3

本实施例提供一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法，包括以下操作步骤：

1.无菌苗及外植体的获得以及预培养

1.1将红椿种子去掉双侧翅，在初始温度为45℃的无菌水中浸泡5h，将浮在上部的干瘪种子去除。

1.2将浸泡5h后的种子，在无菌超净台上，用体积百分比浓度75％的酒精溶液灭菌1min，无菌水冲洗1次，用质量百分比浓度10％的次氯酸钠溶液灭菌20min，无菌水冲洗5次，每次冲洗5min。

1.3然后将种子播种于空白的ms培养基中培养，种子培养3d开始萌芽，40d后，无菌苗真叶长出，切取叶子作为外植体；该步骤中：

培养的条件为培养温度25±2℃，黑暗培养至胚根长出，然后转移至光照强度2500lx，光照时间12h条件下进行培养。

1.4接种到预培养培养基中进行预培养，接种时叶片近轴面紧贴培养基；该步骤中：

预培养培养基为添加了6-ba3.2mg/l+kt1.2mg/l+naa0.06mg/l+蔗糖32g/l+琼脂5.2g/l的ms培养基；

所述预培养的培养条件为温度25±2℃，黑暗培养，预培养时间为3d。2.外植体农杆菌侵染及共培养处理

2.1将步骤a所获取的外植体首先放入无菌水中，在超声波震荡仪中处理35s，超声波功率为5.5khz，达到破碎细胞的目的。

2.2利用携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液侵染经超声波处理的外植体，植物表达载体中含有筛选标记基因，侵染期间置于摇床中不断摇晃，摇晃20min后取出外植体，用无菌水冲洗外植体3次，每次3min，期间不断摇晃，后用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，置于接种盘中晾干；该步骤中：

所述植物表达载体为含有筛选基因的质粒pcambia1305.2，携带抗卡那霉素(kanamycin)的筛选基因，质粒携带含内含子gus报告基因；

所述携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液按照以下步骤制备得到：

将冷冻保存的农杆菌eha105感受态细胞取出放入预冷的电击杯中与质粒进行电击；加入1mllb培养基至电击杯中，转至离心管中，于28℃、150rpm条件下培养2h；将100μl该菌液在lb+50mg/l卡那霉素+50mg/l利福平固体培养基上均匀涂板，30℃倒置培养2d，直至菌落长出；挑取单菌落进行pcr检测，确定阳性菌落；将鉴定完成的农杆菌加入到含有50mg/l卡那霉素和50mg/l氯霉素的lb液体培养基中，28℃，150rpm培养过夜，在摇菌15h后加入as155mmol/l直至摇至od600＝0.8的携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液；

侵染是先将处理好的外植体浸泡在无菌水中在超声波震荡仪中处理35s后，再将外植体转至侵染液(即携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液)中，置于摇床28℃、120rpm摇晃20min。

2.3再接种到铺有一层无菌滤纸的共培养培养基中进行共培养，接种时叶片近轴面紧贴培养基；该步骤中：

共培养培养基为添加了6-ba3.2mg/l+kt1.2mg/l+naa0.06mg/l+蔗糖32g/l+琼脂5.2g/l+as155mmol/l的ms培养基；

所述共培养的培养条件为温度25±2℃，黑暗培养，共培养时间为26h。

3.阳性苗获得

3.1将共培养后的外植体首先转接至不定芽诱导培养基1(t1)中进行缓冲愈伤诱导培养，不定芽诱导培养基1(t1)为添加了6-ba3.2mg/l+kt1.2mg/l+naa0.06mg/l+蔗糖32g/l+琼脂5.2g/l+头孢噻肟钠110mg/l的ms培养基；缓冲愈伤诱导培养14d，切除出现褐化的愈伤组织部分；该步骤中：

缓冲愈伤诱导培养主要是根据红椿叶片对卡那霉素十分敏感，为了避免前期发育阶段出现大量死亡的情况，给外植体一个缓冲培养期可显著提高了农杆菌介导的转化频率。

3.2将步骤3.1所获得健康的愈伤组织转至添加了6-ba3.2mg/l+kt1.2mg/l+naa0.06mg/l+蔗糖32g/l+琼脂5.2g/l+110mg/l头孢噻肟钠+11mg/l卡那抗生素的不定芽诱导培养基2(t2)中进行不定芽诱导，见图3(培养30d)和图4(培养45d)。

3.3将步骤3.2诱导出的不定芽转至不定芽伸长培养基(t3)中进行不定芽伸长，该不定芽伸长培养基(t3)为添加了6-ba0.35mg/l+naa0.22mg/l+蔗糖32g/l+琼脂5.2g/l+110mg/l头孢噻肟钠+11mg/l卡那抗生素的ms培养基，直至获得红椿转基因的健壮芽(见图5，培养60d)。

步骤3.1、3.2以及3.3中，培养基的ph为5.8～6.0，培养的温度为25±2℃，培养的光照强度2700lx，每天光照时间14h，每16d更换一次培养基，既确保培养基成分不流失也防止农杆菌大量繁殖；在愈伤及不定芽诱导培养过程中，叶片外植体以近轴面紧贴培养基的放置方式进行愈伤诱导。

4.转基因植株生根培养

待红椿转基因的健壮不定芽伸长到5cm时，切取不定芽，接种于ms+naa0.12mg/l+蔗糖17g/l+琼脂5.2g/l+110mg/l头孢噻肟钠+11mg/l卡那抗生素的生根培养基中(t4)诱导生根培养；该步骤中：

诱导生根培养是切取5cm的不定芽，并切除根部的愈伤组织，其生根培养基中(t4)的ph为5.8～6.0，培养的温度为25±2℃，光照强度2700lx，光照时间14h。

5.转基因植物检测

利用植物表达载体上的筛选标记基因和报告基因进行pcr分子检测、gus染色和激光共聚焦荧光显微镜，检测步骤3中所获得的红椿转基因芽或转基因植株是否为阳性转基因材料；该步骤中：

pcr分子检测引物包括：

gus-f(seqidno.1)：5′-gtcgcgcaagactgtaacca-3′，

gus-r(seqidno.2)：5′-cggcgaaattccatacctg-3′；

pcr反应程序为94℃2min，35个循环(94℃30s，58℃30s，72℃30s)，72℃延伸5min，4℃保存。

6.转基因植株的炼苗及移栽

将鉴定为阳性转基因材料的植株开盖进行适应，然后将植株从培养瓶中取出，洗净根上的培养基，于无菌水中浸泡1h，后移栽到灭菌过的泥炭土与蛭石质量比为2:1的基质中，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后移开塑料袋，按生长需求浇水，得到移栽成功的转基因植株。

本实施例的结果：遗传转化率为11.11％。

实施例4

本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的主要变化之处在于：菌液中的as的浓度为20mmol/l。本实施例的结果：遗传转化率为6.67％。

实施例5

本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的主要变化之处在于：共培养培养基中as的浓度为200mmol/l。本实施例的结果：遗传转化率为7.67％。

实施例6

本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的主要变化之处在于：共培养的时长为48h。本实施例的结果：遗传转化率为7.07％。

实施例7

本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的主要变化之处在于：超声波处理的时长为20s。本实施例的结果：遗传转化率为7.16％。

实施例8

本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的主要变化之处在于：

(1)不定芽的诱导培养的步骤包括：

用t1培养基对经过共培养的所述外植体诱导培养至长出愈伤组织，用t2培养基诱导培养健康的所述愈伤组织至长出不定芽，用t3培养基对所述不定芽进行诱导培养；

所述t1培养基为含3.0mg/l6-ba、0.2mg/lkt、0.5mg/lnaa、30g/l蔗糖、5g/l琼脂和100mg/l头孢噻肟钠的ms培养基；

所述t2培养基为含3.0mg/l6-ba、0.2mg/lkt、0.5mg/lnaa、30g/l蔗糖、5.0g/l琼脂、100mg/l头孢噻肟钠和10mg/l卡那霉素的ms培养基；

所述t3培养基为含0.3mg/l6-ba、0.5mg/lnaa、30g/l蔗糖、5.0g/l琼脂、100mg/l头孢噻肟钠和10mg/l卡那霉素的ms培养基。

(2)根的诱导培养包括如下步骤：

用t4培养基对所述不定芽进行诱导培养；

所述t4培养基为含0.5mg/lnaa、15g/l蔗糖、5g/l琼脂、100mg/l头孢噻肟钠和10mg/l卡那霉素的ms培养基。

本实施例的结果：遗传转化率为6.94％。

实施例9

本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的主要变化之处在于：

t1培养基为添加了6-ba3mg/l+kt1mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂5g/l+头孢噻肟钠200mg/l的ms培养基；

t2培养基为添加了6-ba3mg/l+kt1mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂5g/l+200mg/l头孢噻肟钠+5mg/l卡那抗生素的ms培养基；

t3培养基为添加了6-ba0.3mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖30g/l+琼脂5g/l+200mg/l头孢噻肟钠+5mg/l卡那抗生素的ms培养基；

t4培养基为添加了naa0.1mg/l+蔗糖15g/l+琼脂5g/l+200mg/l头孢噻肟钠+5mg/l卡那抗生素的ms培养基。

本实施例的结果：遗传转化率为6.21％。

对比例1

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别为“2.外植体农杆菌侵染及共培养处理”中，仅菌液中含有as150mmol/l，而共培养培养基中不添加as，即共培养培养基为添加了6-ba3mg/l+kt1mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂5g/l的ms培养基。其余同实施例1。

本实施例的结果：遗传转化率为3.34％。

对比例2

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别为“2.外植体农杆菌侵染及共培养处理”中，菌液中不含有as，仅在共培养培养基中添加as，即共培养培养基为添加了6-ba3mg/l+kt1mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂5g/l+as50mmol/l的ms培养基。

本实施例的结果：遗传转化率为2.21％。

本发明实施例涉及如下优选试验：以下几个方面的优选试验，都是相对于实施例1改变一个变量的条件进行的，下表数据均进行了三次重复实验，包括均值、标准差(可作为重复性判定标准)、邓肯分析的差异显著性(判定该变量不同梯度是否存在显著性差异)。

(1)外植体对不同浓度卡那的敏感度进行了比较，结果见下表以及图11：

表1、外植体对不同浓度卡那的敏感度

(2)不同浓度头孢噻肟钠的抑菌效果及外植体对不同浓度头孢噻肟钠的敏感度进行了比较，结果见下表以及图12：

表2、不同浓度头孢噻肟钠的抑菌效果及外植体对不同浓度头孢噻肟钠的敏感度

(3)预培养对遗传转化的影响进行了研究，结果见下表：

表3、预培养对遗传转化的影响

(4)对菌液od600值对遗传转化的影响进行了优选，结果见下表：

表4

(5)对侵染方式对遗传转化的影响进行研究，结果见下表：

表5

(6)as对遗传转化的影响进行优选，结果见下表：

表6

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>华南农业大学

<120>农杆菌介导的红椿遗传转化方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtcgcgcaagactgtaacca20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cggcgaaattccatacctg19