一株芽孢杆菌GDUTAN11及其在降解苯系物中的应用

一株芽孢杆菌gdutan11及其在降解苯系物中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体地，涉及一株芽孢杆菌gdutan11及其在降解苯系物中的应用。


背景技术：

2.苯系物是苯、甲苯、乙苯和几类二甲苯同分异构体(对二甲苯、间二甲苯和邻二甲苯)的统称，被美国环境保护局列为主要环境污染物。环境中苯系物化合物污染主要与石油泄漏、石油工业排放和发动机燃烧排放有关。目前已有研究证实，苯系物污染会导致人体神经损伤等病变。暴露于高浓度苯系物环境中会导致白细胞和红细胞数量以及血红蛋白水平降低，增加再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、白血病和非霍奇金淋巴瘤的风险，而且还会损害神经系统、呼吸系统、免疫系统和生殖系统。除此之外，苯系物等在次生有机气溶胶(soa)的形成中也起着关键作用，并发现气溶胶的形成和化学成分与苯系物化学结构相关。
3.因此，寻求一种可以有效处理苯系物污染物的方法已成为环境科学工作者的研究焦点。从土壤和地下水中去除苯系物有几种方法，包括物理、化学和生物法。传统的处理技术，如热、萃取、汽提、化学氧化、吸附等虽然可降低高浓度的苯和其他有机污染物，但是可能会产生有毒副产物；而生物降解是利用生物过程或微生物将有毒化合物转化为毒性较小的化合物，因此具有成本低、工艺简单、操作方便、处理效果好、无二次污染等优点引起人们的广泛关注。芽孢杆菌是一类常见的产芽孢杆状的革兰氏阳性菌，不仅广泛分布于土壤、水、空气以及动物肠道等处，而且能释出高活性的分解酵素，将难分解的大分子物质分解成可利用的小分子物质。目前，已有人将芽孢杆菌运用在降解苯污染物中，例如：公布号为cn105154366a的中国专利公开了一株可降解苯酚且具有产电特性的蜡样芽孢杆菌wl027，该菌株对青霉素、氯霉素和四环素具有良好的耐受性，具有耐盐性，降解苯酚的能力较高；公布号为cn109666612a的中国专利公开了一株枯草芽孢杆菌及其在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用，具体公开了保藏编号为cgmccno.16233的枯草芽孢杆菌对邻苯二甲酸二丁酯的降解性能良好。然而，上述菌株降解的苯污染物单一，在实际应用中受限较大。因此，亟待需要筛选一株能够降解多种苯污染物的菌株以满足人们的应用需求。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一株芽孢杆菌gdutan11。
5.本发明的第二个目的在于提供上述芽孢杆菌gdutan11在制备降解苯系物的微生物制剂中的应用。
6.本发明的第三个目的在于提供一种包含上述芽孢杆菌gdutan11的微生物制剂。
7.本发明的第四个目的在于提供上述芽孢杆菌gdutan11或微生物制剂在降解苯系物中的应用。
8.本发明的第五个目的在于提供一种利用上述芽孢杆菌gdutan11降解苯系物的方法。
9.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
10.本发明提供了一株芽孢杆菌(bacillus sp.)gdutan11，所述芽孢杆菌gdutan11于2021年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，其保藏编号为cctcc no：m 2021095。
11.本发明还提供了上述芽孢杆菌gdutan11在制备降解苯系物的微生物制剂中的应用。
12.本发明还提供了一种包含上述芽孢杆菌gdutan11的微生物制剂。
13.上述芽孢杆菌gdutan11或述微生物制剂在降解苯系物中的应用。
14.优选地，上述芽孢杆菌gdutan11或微生物制剂在修复苯系物污染土壤、净化苯系物污染空气以及处理苯系物污水中的应用。
15.本发明还提供一种降解苯系物的方法，包括将芽孢杆菌gdutan11接种在含有苯系物的无机盐培养基中。
16.优选地，上述方法具体包括以下步骤：对芽孢杆菌gdutan11进行富集增菌培养18～25h，离心，收集菌体，洗涤，然后将其接种于含有苯系物的无机盐培养基中，振荡，降解70～80h。
17.优选地，所述芽孢杆菌gdutan11在含有苯系物的无机盐培养基中的接种量为10％～15％。
18.优选地，所述苯系物在无机盐培养基中的浓度为5～25mg/l。
19.优选地，上述任一所述苯系物为苯、甲苯、间二甲苯和对二甲苯中的任意一种或多种。
20.更优选地，所述离心的转速为8000～12000rpm。
21.更优选地，所述洗涤所用的洗涤溶剂为磷酸盐缓冲液。
22.更优选地，所述降解的温度为35～37℃。
23.更优选地，所述振荡的频率为140～200r/min。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25.本发明提供了一株新型的芽孢杆菌gdutan11，所述菌株于2021年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021095。本发明提供的芽孢杆菌gdutan11对苯、甲苯和间二甲苯以及对二甲苯具有良好的降解性能。当降解72h时，芽孢杆菌gdutan11对5～25mg/l的甲苯、间二甲苯、对二甲苯的降解率均达到97％以上；对浓度为5～25mg/l的苯降解率达到84％以上。结果表明，芽孢杆菌gdutan11对苯系物具有良好的降解效果，其在修复苯系物污染土壤、净化苯系物污染空气以及处理苯系物污水中具有较高的实际应用价值和广阔的发展前景。
附图说明
26.图1为芽孢杆菌gdutan11在电子扫描显微镜下的形态图。
具体实施方式
27.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
28.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
29.实施例1芽孢杆菌gdutan11的筛选、分离与鉴定
30.本发明所述的对苯系物具有降解能力的芽孢杆菌(bacillus sp.)gdutan11，在以苯系物为碳源和能源物质时，从广东省广州市兴丰垃圾填埋场垃圾渗滤液中筛选分离、纯化而得。其分离纯化方法如下：苯、甲苯筛选采用的无机盐培养基配方(k2hpo4·
3h2o 1.2g/l,kh2po
4 1.2g/l,nh4cl 0.4g/l,mgso4·
7h2o 0.2g/l,feso4·
7h2o 0.01g/l，微量元素：cacl2·
2h2o 0.2g/l,mnso4·
4h2o 0.2g/l,cuso4·
2h2o 0.01g/l,znso4·
7h2o 0.2g/l,cocl2·
6h2o 0.09g/l,na2moo4·
2h2o 0.12g/l,h3bo
3 0.006g/l)。以苯、甲苯为驯化底物，驯化底物浓度依次为1mg/l、5mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l。首先取10ml垃圾渗滤液加入含1mg/l苯系物的无机盐培养基，37℃驯化5天后，以10％接种量移入下一浓度中接着驯化，以此类推逐步提高浓度进行驯化。驯化结束后将终浓度的菌液稀释10
‑1～10
‑7倍，各取0.2ml不同倍数菌液分别均匀涂布在以苯系物为碳源的固体培养基中，挑选生长速度快、边缘整齐的单菌落富集培养后进行的降解实验，将具有降解效果最好的菌落进行保存并做菌种鉴定。鉴定结果如下：
31.(1)菌体的形态特性：
32.a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，得出所筛选的芽孢杆菌为革兰氏阳性菌；在电子显微镜下观察，其形态为杆状，菌体大小为(0.5～0.8)
×
(2～3)μm，无鞭毛，如图1所示；
33.b.菌落的形态特性：在lb固体培养基培养24h后，菌落形态为圆形，乳白色，不透明，菌落直径为3～5mm；
34.c.主要的生理生化特征如表1：
35.表1检测菌体的生理生化特征
[0036][0037]
注：反应状态分为阳性和阴性，阳性形状编码为“+”，阴性形状编码为
“‑”
[0038]
(2)采用dna提取试剂盒提取细菌总dna。采用细菌的16s rdna通用引物：
[0039]
上游引物：27f(5'
‑
agtttgatcmtggctcag
‑
3')
[0040]
下游引物:：1492 r(5'
‑
ggttaccttgttacgactt
‑
3')
[0041]
扩增其16s rdna基因，测序结果如下(seq id:no.1)：
[0042]
cgtggcatctgcagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggataacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggctgtcacttatggatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtgctagttgaataagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccatcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagagctgcaagaccgcgaggtggagctaatctcataaaaccgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggggtaacctttttgaagccagccgcctaaggtg
gaacagatgattggggtgagcaccccaggggggggaacacaaaaaaagg
[0043]
将长为1485bp的16s rrna基因序列与genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现菌种与bacillus sp.(in:bacteria)strain l
‑
6最相似，相似度为97％。综合上述的生理生化特性、16s rrna基因序列结果，本发明所筛选的细菌应归属芽孢杆菌属，命名为bacillus sp.gdutan11，于2021年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：m 2021095，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
[0044]
实施例2芽孢杆菌gdutan11降解苯系物的性能
[0045]
配置无机盐培养基：在顶空血清瓶中加入100ml培养液(k2hpo4·
3h2o 0.12g，kh2po
4 0.12g，nh4cl 0.04g，mgso4·
7h2o 0.02g，feso4·
7h2o 0.001g)，100μl微量元素(cacl2·
2h2o 0.2g/l，mnso4·
4h2o 0.2g/l，cuso4·
2h2o 0.01g/l，znso4·
7h2o 0.2g/l，cocl2·
6h2o 0.09g/l，na2moo4·
2h2o 0.12g/l，h3bo0.006 g/l)，121℃高压灭菌30min。
[0046]
1.芽孢杆菌gdutan11降解苯的性能
[0047]
首先将筛选的芽孢杆菌gdutan11在营养肉汤培养基(牛肉膏3.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl 5.0g/l)中富集增菌培养24h后，以转速为12000rpm离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，然后以10％接种量悬浮在上述装有100ml无机盐培养基的血清瓶中，然后加入一定量苯溶液使得其浓度分别为5mg/l、8mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l，加盖密封后在摇床温度37℃，振动频率200r/min条件下进行降解试验，降解72h后从血清瓶顶空取样，使用含氢焰离子化检测器(fid)gc9800气相色谱仪(at.se
‑
54毛细管柱，30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，测定气相中苯的浓度，并利用亨利定律来检测其在液相中的降解率。检测条件为：检测器温度200℃，进样口气化室温度150，柱炉温度120℃。采用agilent 500μl气密针进样，进样量为500μl，不分流模式。结果如表2所示：
[0048]
表2芽孢杆菌gdutan11对不同初始浓度的苯的降解率
[0049]
苯浓度降解率5mg/l97.7％8mg/l91.8％10mg/l91.2％15mg/l89.5％20mg/l86.2％25mg/l84.4％
[0050]
由表2可知，芽孢杆菌gdutan11对浓度为5～25mg/l的苯的降解效果良好。
[0051]
2.芽孢杆菌gdutan11降解甲苯的性能
[0052]
首先将筛选的芽孢杆菌gdutan11在营养肉汤培养基(牛肉膏3.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl 5.0g/l)中富集增菌培养24h后，以转速为12000rpm离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，然后以10％接种量悬浮在上述装有100ml无机盐培养基的血清瓶中，然后加入一定量甲苯溶液使得其浓度分别为5mg/l、8mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l，加盖密封后在摇床温度37℃，振动频率140r/min条件下进行降解试验，降解72h后从血清瓶顶空取样，使用含氢焰离子化检测器(fid)gc9800气相色谱仪(at.se
‑
54毛细管柱，30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，测定气相中苯的浓度，并利用亨利定律来检测其在液相中的降解率。检测条件为：检测器温度200℃，进样口气化室温度150，柱炉温度120℃。采用agilent 500μl
气密针进样，进样量为500μl，不分流模式。结果如表3所示：
[0053]
表3芽孢杆菌gdutan11对不同初始浓度的甲苯的降解率
[0054]
甲苯浓度降解率5mg/l100％8mg/l100％10mg/l99.7％15mg/l99.3％20mg/l99.3％25mg/l97.2％
[0055]
由表3可知，芽孢杆菌gdutan11对浓度为5～25mg/l的甲苯的降解效果良好。
[0056]
3.芽孢杆菌gdutan11降解二甲苯的性能
[0057]
首先将筛选的芽孢杆菌gdutan11在营养肉汤培养基(牛肉膏3.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl 5.0g/l)中富集增菌培养24h后，以转速为12000rpm离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，然后以10％接种量悬浮在上述装有100ml无机盐培养基的血清瓶中，然后分别加入一定量对二甲苯、间二甲苯溶液使得其浓度分别为5mg/l、8mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l，加盖密封后在摇床温度37℃，振动频率140r/min条件下进行降解试验，降解72h后从血清瓶顶空取样，使用含氢焰离子化检测器(fid)gc9800气相色谱仪(at.se
‑
54毛细管柱，30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，测定气相中二甲苯(对二甲苯和间二甲苯)的浓度，并利用亨利定律来检测其在液相中的降解率。检测条件为：检测器温度200℃，进样口气化室温度150，柱炉温度120℃。采用agilent 500μl气密针进样，进样量为500μl，不分流模式，结果如表4、5所示。
[0058]
表4芽孢杆菌gdutan11对不同初始浓度的间二甲苯的降解率
[0059]
间二甲苯浓度降解率5mg/l100％8mg/l100％10mg/l100％15mg/l100％20mg/l99.8％25mg/l99.8％
[0060]
表5芽孢杆菌gdutan11对不同初始浓度的对二甲苯的降解率
[0061]
对二甲苯浓度降解率5mg/l100％8mg/l100％10mg/l100％15mg/l100％20mg/l99.8％25mg/l99.7％
[0062]
由表4～5可知，芽孢杆菌gdutan11能够降解间二甲苯、对二甲苯，芽孢杆菌
gdutan11对浓度为5～25mg/l的间二甲苯、对二甲苯的降解效果良好，降解率均达到99.6％以上，尤其是当浓度为5～15mg/l的间二甲苯、对二甲苯，其降解率高达100％。