一种干细胞增殖促进剂及其应用的制作方法

1.本发明属于干细胞培养技术领域，尤其涉及一种干细胞增殖促进剂及其应用。


背景技术：

2.干细胞是一类具有自我复制能力(self
‑
renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以 分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，es 细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞 (totipotent stem cell，tsc)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stemcell)(专能干细胞)。干细胞(stem cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生 各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
3.间充质干细胞(msc,mesenchymal stem cells)是胚胎干细胞的重要成员，来源于发育早期 的中胚层，属于多能干细胞，msc最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和 促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内 或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、 内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子 细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。尤其是脐带间充质干细胞(mesenchymal stemcells，mscs)是存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞， 具有广阔的临床应用前景。
4.现有技术中进行干细胞培养常采用多组分促进剂，配制以及使用比较繁琐。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供一种干细胞增殖促进剂，该干细胞增殖促进剂是使用微波反 应釜从大豆中提取获得。
6.进一步的，所述干细胞增殖促进剂的具体制备方法包括以下步骤：
7.(1)物料前处理：将大豆筛选并去掉杂质；
8.(2)将准备好的物料放入微波反应釜中处理2
‑
3min，冷凝回收气化出的大豆精华，即 获得干细胞增殖促进剂。
9.更进一步的，所述步骤(2)中微波反应釜的处理频率为2045mhz。
10.进一步的，所述干细胞为间充质干细胞。
11.本发明的目的之二在于提供干细胞增殖促进剂在干细胞培养中的应用。
12.本发明的目的之三在于提供一种干细胞的培养基组合，该培养基组合中含有完全培养基 和干细胞增殖促进剂。
13.进一步的，所述培养基组合中完全培养基：干细胞增殖促进剂的体积比为3
‑
5:1。
14.本发明的目的之四在于提供一种干细胞的增殖促进方法，该方法在培养基中培养干细胞， 所述培养基含有干细胞增殖促进剂。
15.本发明提供的大豆提取精华液具有水分子簇结构，水分子簇尺寸的大小与其物理
性质有 直接的关系，分子团簇小的水具有渗透力强、溶解度高、与细胞亲和性好等特性，改变水分 子簇的大小可以使水在生物体中的作用发生改变(张建平，赵林，谭欣.水分子团簇结构的改 变及其生物效应[j].化学通报，2004，(4)：278
‑
283)。
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o
‑
核磁共振法是目前用于表征 水团簇结构的主要方法，
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o
‑
核磁共振的半峰宽可以用于表征水分子团簇的大小(li r,jiangz,shi s et al.raman spectra and 17
o
‑
nmr study effects ofcacl
2 andmgcl
2 on water structure[j].jmol struct，2003，645(1)：69
‑
75.和李睿华，蒋展鹏，杨宏伟,等.离子对水的
17
o
‑ꢀ
nmr化学位移和水结构)。
[0016]
按照现有最新广泛植物靶向代谢成分检测技术对大豆精华液分析可知其含有656种小分 子化合物，都是1000da以下的小分子化合物，富含大豆多种次生代谢产物小分子化合物(酚 酸类90种、氨基酸及其衍生物90种、生物碱及萜类90种、有机酸82种、黄酮类80种、脂 类70种、糖及醇类及其他类67种、核苷酸及其衍生物51种、木质素类23种、维生素类13 种)。
[0017]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0018]
本发明提供了一种间充质干细胞培养的方法，在不添加人表皮生长因子、人碱性成纤维 细胞生长因子等细胞因子等干细胞培养的生化激活剂成分的情况下，可以常规培养72小时做 到干细胞增值效率提高3
‑
4倍，同时其还具有降低动物血清添加比例的潜力。
附图说明
[0019]
图1为实施例1中提取的大豆精华水分子团大小的检测报告。
[0020]
图2为实施例1中提取的大豆精华的广泛靶向代谢组检测报告。
[0021]
图3为实施例4中不同浓度大豆精华液培养细胞的统计结果柱状图。
具体实施方式
[0022]
实施例1
[0023]
大豆精华提取液的制备方法如下：
[0024]
(1)物料前处理：将大豆筛选去掉尘土等杂质，清洗沥干并整理到规格大小一致；
[0025]
(2)将准备好的物料放入微波裂解反应釜，在2045mhz的微波频率下处理2
‑
3min， 冷凝回收气化出的大豆精华。
[0026]
大豆中物质在高频微波作用下蒸馏或气化，通过冷凝回收得到大豆精华液，5kg大豆可 收集到500g精华液，大豆精华液的ph在8左右，呈弱碱性，通过
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o
‑
nmr检测精华液的 小分子团结构大小为38.81hz，具体的检测报告参见图1。大豆精华液的广泛靶向代谢组检测 报告如图2所示。
[0027]
实施例2
[0028]
大豆精华液的安全性能试验步骤如下：
[0029]
采用直接饮用方法，选取体重范围在20g至23g内的15只雄性小白鼠以及15只雌性小 白鼠，随机分为3组，其中一组不给予大豆精华液(对照组)，一组每隔6h给予5ml实施 例1中制备的大豆精华液(试验组1)，还有一组每隔6h给予1ml实施例1中制备的大豆 精华液(试验组2)，持续喂养6个月。结果表明，1周内测试试验组1和试验组2，动物无 死亡现象，小鼠活动正常，与对照组无差异；6个月时测试试验组1和试验组2，动物无死亡 现象，小鼠活
动正常。通过强迫游泳实验，相比对照组，试验组1和试验组2的小鼠游泳时 间明显延长，表现比对照组稍有力量。
[0030]
实施例3
[0031]
大豆精华提取液对日本医蛭养殖替代血清的培养实验，步骤如下：
[0032]
日本医蛭人工养殖中，幼苗繁育期需要用到动物血清，才能快速生长，以达到产出水蛭 素的要求。我们通过对比实验，在3个养殖池，分别不加动物血清、添加动物血清、添加大 豆提取液，生产一周以后发现添加大豆提取液的水蛭生长速度最快，添加动物血清的水蛭生 长速度其次，超过血清促进水蛭生长的效果。发现大豆提取液可以一定程度上替代动物血清 作为一种植物来源的培养试剂。
[0033]
实施例4
[0034]
大豆精华提取液对细胞增殖的影响试验，步骤如下：
[0035]
(1)取生长状态良好的皮肤间充质干细胞(货号：bfn60808614)，采用一般传代方法 进行酶消化，用完全培养基培养液(dmem f12+10％fbs)制成间皮肤充质干细胞悬液。
[0036]
(2)采用细胞计数仪进行计数，调整细胞密度至5*104个/ml，贴壁精确地向96孔板(12 列*8行)中加入100μl/孔的细胞悬液，使细胞数量达到5000个/孔，每孔细胞总数要求一致。
[0037]
(3)24小时后，去掉96孔板中的培养基，每1行分别加入100μl含不同比例浓度大豆 精华液(实施例1中制备的)样品的培养基(大豆精华液样品：完全培养基体积比分别为1:3、 1:5、1:7、1:9、1:11、1:13、1:15、1:17、1:19、1:21)，每个体积比都设置5个重复，同时设 置完全培养基为空白对照组。
[0038]
上述完全培养基的货号为pm150312b，武汉普诺赛生命科技有限公司生产，此培养基也 可自配。
[0039]
(4)将96孔细胞培养板放置于37℃，5％co2培养箱孵育。
[0040]
(5)细胞培养三天后，分别向96孔板每孔加入10μl cck
‑
8溶液，将培养板在培养箱 内继续孵育1
‑
4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算均值。
[0041]
(6)将所有的检测时间点检测完成后，采用统计学分析软件，以不同浓度的样品为横轴， 细胞od值数为纵轴(对数)做柱状图，分析样品对间充质干细胞的增殖活性的影响，结果 如表1和图3所示，由表1和图3可知，在正常对照中代表干细胞浓度的od值是0.429，在 大豆精华样品占比1:3的组合中代表干细胞浓度的od值是1.77，效率提高了4.12倍，在提 取液占比1:5的组合中代表干细胞浓度的od值是1.386，效率提高了3.23倍。根据多组实验 确认，提取液在dmem f12+10％fbs占比16.7％—25％之间增值效率最佳。
[0042]
在上述实验中，fbs中的小牛血清的添加比例为7.5％，低于正常情况下的10％，可见大 豆提取液可以一定程度替代fbs(小牛血清)，作为干细胞培养中一种重要的培养试剂。
[0043]
表1
[0044][0045]
本发明提供了一种间充质干细胞培养的方法，在不添加细胞因子等干细胞培养的生化激 活剂成分以及降低动物血清添加量的情况下，可以常规培养72小时做到干细胞增值效率提高 3
‑
4倍。
[0046]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定， 在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变 形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。