一种香蕉花粉活力检测的分子探针及其制备方法

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种香蕉花粉活力检测的分子探针及其制备方法。


背景技术：

2.香蕉（musa spp.）属于芭蕉科（musaceae）芭蕉属（musa），是单子叶的多年生常绿草本果树，是热带、亚热带地区最重要的作物之一。也是继柑橘之后世界产量第二大水果，占据了世界水果产量的16%。栽培香蕉(musa paradisiaca)品种为多倍体，基因组类型主要有aaa、aab和abb。多数栽培香蕉品种雌雄性高度不育，这导致香蕉的有性杂交育种难度很大,但是由于不是100%的雄性不育，因此有些花粉具有活性。同时，有些三倍体品种在减数分裂过程中能产生不减数的三倍体配子 ,如果用野生二倍体香蕉的花粉进行授粉也可获得少量四倍体种子。近年来，国外已有机构成功利用雄性育性较高的aa或bb基因组类型的二倍体香蕉资源或近缘种如阿宽蕉（也称野生蕉）（musa itinerans cheesm.）作为父本，经人工授粉获得杂交种子，其中育性高的二倍体父本尤其关键。所以，鉴定野生蕉花粉活力，有助于筛选出花粉育性较高的单株就行杂交育种，也可以筛选出优良基因和可育性高的野生蕉类型作为父本进行杂交育种。最后，采收活力良好的花粉，是所有杂交授粉的要求。因此，香蕉花粉活力的鉴定，是提高杂交育种的成功率的重要技术。
3.驯化的香蕉的品种达上千种，其遗传多样性较高，但不育性的困难导致通过杂交开发新品种在20世纪并未有太大进展。随着基因组学、生理学、细胞遗传学的不断发展，极大地增加了我们对香蕉及其基因多样性的理解。比如香蕉枯萎病，在过去一直是香蕉产业的头号杀手，对其发病机理和救治措施一直不明确，但在最新的研究中已陆续发现了部分导致香蕉易感病毒的基因。而大多数的研究都是关于香蕉抗逆性，关于调控香蕉花粉育性的报道很少。同时，对应香蕉的雄配子体的活力鉴定，也是香蕉表型组学的重要指标。
4.分子探针技术在植物学的应用主要是检测其代谢产物和分子标记辅助分类，如对树木的性别鉴定和野生植物资源的鉴定收集。尤其在香蕉产业中，只有对野生蕉的分子标记，尚未见到其他应用。在香蕉分子育种方面，分子探针可以帮助找到生长发育、生理生化和新陈代谢的关键节点。但是，在花粉发育和活力鉴定方面，仍然缺乏适用的分子探针。
5.目前检测活性的方法一般是用与酶促反应相联的分子。例如ttc（2，3，5—氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感复合物，1894年首次合成用来检测种子的活力。它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色；而当细胞活力下降或死亡时，脱氢酶活性下降，不能反应产生红色产物。这类染色反应显示细胞、组织和包括花粉等器官和个体活性的优点是快速简单，缺点是其定量化显示受到细胞、组织、器官被检测物形态的约束，难以精确定量使用。
6.本发明通过识别基因的特异性表达和花粉活力生理变化的联系，从而确定最佳的花粉采集、保存条件，并筛选出高精度的花粉活力分子探针，弥补了过去以例如ttc酶染色为基础的活力监测的不足，同时纳入染色剂的相互印证，对实际生产具有高精度的实用价
值。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于针对上述问题，提供一种香蕉花粉活力检测的分子探针及其制备方法。通过识别基因的特异性表达和花粉活力生理变化的联系，从而确定最佳的花粉采集、保存条件，并筛选出高精度的花粉活力分子探针。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于鉴别香蕉花粉活力的核苷酸序列，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.一种鉴别香蕉花粉活力的核酸分子探针，根据上述的核苷酸序列seq id no.1设计核酸分子探针；所述分子探针核苷酸序列如下：seq id no.2 f:5
’‑
cgttgtgattctgtgctgct
‑3’
; seq id no.3 r:5
’‑
gtttctcagcgaggaagtcg
‑3’
。
10.一种鉴别香蕉花粉活力的试剂盒，所述试剂盒包括上述核酸分子探针seq id no.2 、seq id no.3 和常规pcr反应试剂。
11.一种鉴别香蕉花粉活力的方法，采用上述核酸分子探针seq id no.2 和seq id no.3 作为pcr引物，以待测样品cdna为模板，利用qpcr方法鉴定香蕉花粉活力。
12.进一步的，一种鉴别香蕉花粉活力的试剂盒，所述试剂盒包括上述的核酸分子探针、常规pcr反应试剂和ttc染色试剂。
13.更进一步的，一种鉴别香蕉花粉活力的方法，采用上述的试剂盒，通过qpcr方法结合ttc染色试剂以获得花粉表型组学和探针监测结果的互相印证。
14.本发明的优点在于：本发明通过通过全基因组鉴定以及对gdsl家族的分析，筛选获得一个用于鉴别香蕉花粉活力的核苷酸序列ma01_t03770.1。以核苷酸序列ma01_t03770.1为基础，设计筛选获得高精度的花粉活力分子探针。通过识别基因的特异性表达和花粉活力生理变化的联系，从而确定最佳的花粉采集、保存条件；解决了传统方法如ttc酶染色为基础的花粉鉴定活力监测不足的问题，对杂交育种和花粉研究都具有应用价值，对实际生产具有高精度的实用价值。
15.附图说明：图1染色方法示例。
16.图2 ma01_t03770.1在不同时间采样花粉中的表达量。
17.图3为8:00香蕉花粉染色图。
18.图4为 9:00香蕉花粉染色图.图5 为10:00香蕉花粉染色图.图6为11:00香蕉花粉染色图。
19.图7为 12:00香蕉花粉染色图。
20.图8为13:00香蕉花粉染色图。
21.图9为14:00香蕉花粉染色图。
22.图10为15:00香蕉花粉染色图。
23.图11为16:00香蕉花粉染色图。
具体实施方式
24.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此实施例1.一种香蕉花粉活力检测的分子探针的制备：本发明所使用的分子探针序列来源于香蕉a基因组第一条染色体上的基因，通过生信分析初步鉴定该基因属于gdsl脂肪酶家族，该家族能促进植物花粉水合作用，从而提高授粉率。通过全基因组鉴定以及对gdsl家族的分析，筛选出ma01_t03770.1，其cds序列如seqidno.1所示。本发明的分子探针设计参考香蕉a基因组数据库(https://banana
‑
genome
‑
hub.southgreen.fr/pahang_v2)下载的ma01_t03770.1基因序列，并委托铂尚生物公司合成。分子探针核苷酸序列如下：seqidno.2f:5
’‑
cgttgtgattctgtgctgct
‑3’
；seqidno.3r:5
’‑
gtttctcagcgaggaagtcg
‑3’
。
25.实施例2.香蕉花粉活性分子探针的使用方法：采集的新鲜花粉分成两部分，一部分立即用于第一步的染色，一部分液氮保存用于第二步的cdna制备。
26.第一步：配置ttc染色液：按照0.5wt%
‑
1wt%的质量分数将ttc粉末溶解于pbs缓冲液，配置好的染色液可在4℃、避光条件下短期保存。首先在载玻片滴加ttc溶液，取少量花粉平铺于液滴表面，盖上盖玻片，置于25℃
‑
35℃环境中培养15min（如图1所示）。观察到部分花粉变成浅红色，部分为深红色，颜色越深则代表活力越好。
27.第二步：将液氮保存的花粉研磨提取rna，并根据相关步骤逆转录为下面体系所需的cdna原液，再根据测定的浓度稀释，保证dna总量在50
‑
100ng。
28.配置20μlqpcr反应体系工作液：反应程序设定：95℃30s；95℃5s，60℃30s，72℃30s，50次循环。
29.实施例3.香蕉花粉活性分子探针试剂盒的制作和使用技术香蕉花粉活性分子探针试剂盒包括如表1所示组分。试剂盒保存：
‑
20℃保存两年。
30.表1香蕉花粉活性分子探针试剂盒产品组分
上述试剂盒中内参基因引物序列如下：seq id no.4 ubq(f): 5
’‑
ggcaccacaaacaacacagg
‑3’
；seq id no.5ubq(r): 5
’‑
agacgagcaaggcttccatt
‑3’
。
31.香蕉花粉活性分子探针试剂盒能准确、高效的用于qpcr扩增，反应温度为60℃。并且附带ttc粉末和微型显微镜，用于花粉活力的快速检测。ttc粉末可直接使用pbs缓冲液溶解，配比为0.5%
‑
1%，现配现用。
32.实施例4选择晴朗的天气，随机选取3棵长势良好、开雄花的福建本地野生蕉，分别在上午8：00、9：00、10：00、11：00、12：00、13：00、14：00、15：00、16：00九个时间点各取一次花粉，留一部分花粉立即用ttc染色，获得生理指标，将剩下的花粉迅速放入液氮冷藏。使用rnaprep pure plant kit (tiangen, china) 试剂盒提取野生蕉花粉不同时间点的总rna，用prime
‑ꢀ
script
™
rt reagent kit（perfect real time，takara）试剂盒将各个材料的rna反转录成cdna，具体步骤参照说明书。然后进行qrt
‑
pcr实验，测定各个时间的ma01_t03770.1相对表达量：设计20 μl 反应体系，其中 syber green pcr mix 10 μl，ma01_t03770.1（f）和ma01_t03770.1（r）引物各 0.8 μl（10 pmol/μl），cdna 模板（双蒸水稀释5倍）2μl，每个反应 3 次重复。反应程序设为95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，50次循环，在lighcycler 480上进行基因表达分析，内参基因为ubq，表达计算方法采用2
‑∆∆
ct法，即内参校正后以8:00采花粉的表达量为1计算相对表达量。结果如图2所示，图2结果表明在9:00之前花粉活力处于较低水平，而在9:00活力达到最高，随后呈现逐步下降的趋势，13:00以后活力不再变化。
33.不同时间点取样花粉的ttc染色结果如图3所示。通过对其视野内的染色率统计，9:00的花粉染色率达到最大为54.72%，而在10:00至13:00分别为：31.75%、29.23%、18.33%、14.89%，而上午8:00及13:00以后花粉染色率都不足10%。结果表明ma01_t03770.1基因表达量与花粉染色率存在正相关性，且表达量越高，染色率的差异越明显。由此证明上午9:00为花粉的最佳采集时间。
34.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。