一株具有缓解HaCaT细胞氧化损伤作用的动物双歧杆菌

一株具有缓解hacat细胞氧化损伤作用的动物双歧杆菌
技术领域
1.本发明涉及一株具有缓解hacat细胞氧化损伤作用的动物双歧杆菌，属于微生物技术领域以及医药技术领域。


背景技术：

2.皮肤作为人体最大的器官，是抵御外界机械、化学、物理及生物等各种刺激的第一道防线。而uv照射或臭氧、苯并芘等污染物诱导细胞产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ros)，生成脂质过氧化物，诱发氧化应激损伤及炎症反应，打破体内氧化/抗氧化系统平衡，使机体组织衰退、生理功能低下，损伤皮肤屏障，导致皮肤老化。
3.人体内活性氧生成过多，会打破活性氧生成与清除的动态平衡，体内抗氧化系统不能及时清除，导致细胞处于氧化应激状态，过多的自由基损伤细胞内dna，破坏蛋白质和脂质结构，细胞活力降低甚至死亡。皮肤如果长期暴露在此状态下，会出现肤色加深、晒伤、皮肤炎症性疾病甚至是皮肤癌。
4.随着皮肤疾病发生的增加，人们对护肤产品的需求及更深入的研究也随之增加。传统防晒剂含有无机化合物，如二氧化钛(tio2)和氧化锌(zno)，这些矿物质能够反射uva和uvb的照射。但是，这些金属基颗粒的安全问题也引起人类的担忧。
5.因此，需要开发一种的天然产品，既不会给患者带来副作用，同时，也能增强皮肤的内源性抗氧化的能力，来中和ros对皮肤造成的氧化损伤，缓解皮肤氧化损伤带来的各种皮肤疾病，并且，还能够应用于各类别的患者。


技术实现要素：

6.本发明的技术方案如下：
7.为解决上述问题，本发明提供了一株动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)ccfm1155，所述动物双歧杆菌于2021年2月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmcc no：61495，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
8.所述动物双歧杆菌来源于江苏无锡地区的人体粪便样本，该菌株经测序分析，其16s rdna序列如seq id no.1所示，将测序得到的序列在genebank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为动物双歧杆菌，命名为动物双歧杆菌ccfm1155。
9.所述动物双歧杆菌ccfm1155的微生物形态学特征为：细胞呈乳白色、不规则型、圆形凸起、光滑。
10.本发明还提供了上述动物双歧杆菌的细胞、发酵上清液或胞内物在制备预防和/或治疗皮肤氧化损伤的产品中的应用。
11.在本发明的一种实施方式中，所述胞内物为上述动物双歧杆菌破碎后的上清液。
12.在本发明的一种实施方式中，所述胞内物的制备方法为将上述动物双歧杆菌的菌液离心收集菌泥，添加pbs溶液溶解，加液氮研磨破碎，收集菌泥悬液，添加pbs溶液溶解，超声破碎，离心收集上清液；0.22μm一次性滤器过滤除菌。
13.本发明还提供了一种产品，其特征在于，所述产品含有上述动物双歧杆菌的细胞、发酵上清液或胞内物中的一种或多种。
14.在本发明的一种实施方式中，所述胞内物为上述动物双歧杆菌破碎后的上清液。
15.在本发明的一种实施方式中，所述胞内物的制备方法为将上述动物双歧杆菌的菌液离心收集菌泥，添加pbs溶液溶解，加液氮研磨破碎，收集菌泥悬液，添加pbs溶液溶解，超声破碎，离心收集上清液；0.22μm一次性滤器过滤除菌。
16.在本发明的一种实施方式中，所述产品包含日化用品或药品。
17.在本发明的一种实施方式中，所述日化用品为护肤品或洗护用品。
18.在本发明的一种实施方式中，所述日化用品含有上述动物双歧杆菌的细胞、发酵上清液或胞内物中的一种或多种。
19.在本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含保湿剂、润肤剂和/或乳化剂。
20.本发明的一种实施方式中，所述保湿剂包含甘油、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、山梨醇和/或乙醇。
21.本发明的一种实施方式中，所述润肤剂包含辛酸/癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯、异壬酸异壬酯、棕榈酸乙基己酯和/或乙二醇二硬脂酸酯。
22.本发明的一种实施方式中，所述乳化剂包含椰油基葡糖苷、聚甘油
‑
2二聚羟基硬脂酸酯和/或聚山梨醇酯
‑
60。
23.在本发明的一种实施方式中，所述药品为涂抹型药品。
24.在本发明的一种实施方式中，所述涂抹型药品含有上述动物双歧杆菌的细胞、发酵上清液或胞内物中的一种或多种。
25.在本发明的一种实施方式中，所述涂抹型药品中还含有附加剂。
26.在本发明的一种实施方式中，所述涂抹型药品的剂型为霜、乳液、爽肤水及膏。
27.在本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含软膏剂、防腐剂和/或抗氧化剂。
28.在本发明的一种实施方式中，所述软膏剂包含单甘脂、硬脂酸、十八醇、丙三醇、白凡士林和/或尼帕金乙酯。
29.在本发明的一种实施方式中，所述防腐剂包含苯甲酸和/或乙醇。
30.在本发明的一种实施方式中，所述抗氧化剂为亚硫酸钠。
31.在本发明的一种实施方式中，所述涂抹型药品的剂型为膏剂、膜剂或凝胶剂。
32.在本发明的一种实施方式中，所述动物双歧杆菌的制备方法为：将动物双歧杆菌接种于添加了碳源、氮源、无机盐和微量元素的增殖培养基中进行发酵，得到动物双歧杆菌发酵液。
33.在本发明的一种实施方式中，所述动物双歧杆菌发酵上清液的制备方法为：将动物双歧杆菌接种于增殖培养基中进行发酵，活菌数达到4～6
×
109cfu/ml后，以8000
‑
10000g，15～20min条件离心，通过0.22
‑
0.45μm滤膜过滤除菌后，得到发酵上清液。
34.在本发明的一种实施方式中，所述动物双歧杆菌胞内物的制备方法为：由上述方法制备的动物双歧杆菌，以8000
‑
10000g，15～20min条件离心，添加适量pbs后，利用液氮反复研磨直至形成粉末状，添加适量pbs后，以100～500w，5～15min超声，再以8000
‑
10000g，15～20min条件离心，通过0.22
‑
0.45μm滤膜过滤除菌后，得到所需的动物双歧杆菌胞内物。
35.在本发明的一种实施方式中，所述增殖培养基中碳源为10～40g/l葡萄糖，氮源为
5～25g/l酵母浸粉、胰蛋白胨或大豆蛋白胨，无机盐为0.1～0.5g/l硫酸镁，0.1～0.5g/l硫酸锰，微量元素为1～5g/l无水乙酸钠，1～5g/l柠檬酸氢二铵，1～5g/l磷酸二氢钾，0.25～0.75g l
‑
半胱氨酸盐酸盐和吐温80 0.5～1.5ml/l。
36.有益效果：
37.本发明提供了一株动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)ccfm1155，此动物双歧杆菌ccfm1155能够缓解缓解皮肤细胞氧化损伤，具体体现在：
38.(1)提高h2o2诱导的hacat细胞的存活率；
39.(2)显著改善h2o2诱导的hacat细胞氧化损伤程度；
40.(3)能够提高h2o2诱导的hacat细胞的抗氧化能力；
41.(4)能够激活激活nrf2抗氧化信号通路，提高分泌nrf2能力，从而明显缓解和修复h2o2诱导的hacat细胞氧化造成的伤害；
42.可见，动物双歧杆菌ccfm1155在制备预防或治疗皮肤氧化损伤的产品中，具有巨大的应用前景。
43.生物材料保藏
44.一株动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)ccfm1155，分类学命名为bifidobacterium animalis，已于2021年2月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：61495，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
45.图1：不同组别促进h2o2诱导的hacat细胞增殖的效果对比。
46.图2：不同组别提高h2o2诱导的hacat细胞t
‑
aoc抗氧化能力的效果对比。
47.图3：不同组别提高h2o2诱导的hacat细胞中sod酶活力水平的效果对比。
48.图4：不同组别提高h2o2诱导的hacat细胞分泌nrf2能力的效果对比。
具体实施方式
49.皮肤覆盖于人体表面，是人体最大的器官之一。皮肤由表皮和真皮两部分组成，其中表皮的关键功能是在生物体和外界之间形成屏障，对人体有重要的保护作用。皮肤角质形成细胞(keratinocytes,kcs)是表皮的主要组成部分，而人永生化皮质形成细胞(hacat细胞)属于成人表皮细胞自发转化而来的细胞系，它与人体正常的角质形成细胞有相同的增殖、分化特性和遗传稳定性，常被用于生物医学领域，作为体外研究的细胞系，比如皮肤修复愈合、防晒和抗衰老等研究。并且，角质形成细胞是研究皮肤氧化损伤重要组成部分。因此，下述实施例中使用经h2o2诱导处理的人永生化皮质形成细胞作为氧化损伤细胞模型进行细胞实验。
50.下述实例中涉及的人永生化皮质形成细胞(hacat细胞)购自中国典型培养物保藏中心；下述实例中涉及的dmem培养基购自赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司；下述实例中涉及的胎牛血清(fbs)、青霉素、链霉素和胰蛋白酶购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；下述实例中涉及的mtt购自北京索莱宝科技有限公司；下述实例中涉及的人因子e2相关因子2(nrf2)elisa试剂盒(货号：sbj
‑
m0807)购自上海森贝伽生物技术有限公司；下述实施例中涉及的t
‑
aoc(货号：s0119)和sod(货号：s0101s)的试剂盒购自上海碧云天科技有限公
司。
51.下述实施例中涉及的培养基如下：
52.mrs液体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h20 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温
‑
80 1ml/l，ph 7.0。
53.双歧杆菌1号发酵培养基配方：葡萄糖：20g；酵母浸粉：10g；na2hpo4：3.5g；mgso4‑
7h2o：0.25g；mnso4‑
h2o：0.1g；柠檬酸氢二铵：2g；kh2po4：3.5g；l
‑
半胱氨酸盐酸盐：0.5g；吐温80 1ml；ph调致6.8。(初始渗透压在325左右)。
54.双歧杆菌2号发酵培养基配方：葡萄糖：20g；胰酪蛋白胨(胰蛋白胨)：15g；na2hpo4：3g；mgso4‑
7h2o：0.25g；mnso4‑
h2o：0.1g；柠檬酸氢二铵：2g；kh2po4：3g；l
‑
半胱氨酸盐酸盐：0.5g；吐温80 1ml；ph调致6.8。
55.下述实施例中涉及的动物双歧杆菌培养发酵液和胞内物的制备方法如下：
56.1、菌株的活化与培养
57.所有容器和工具灭菌。取菌种保藏管震荡均匀后用无菌接种环蘸取少量菌液在mrs固体培养基划线纯化。静置一段时间后，将平板倒置于37℃恒温厌氧培养箱中48h。培养结束后挑取单菌落接种于5ml的mrs液体培养基中，静置于37℃恒温厌氧培养箱中培养12
‑
18h。即得菌株的种子液。连续活化两代，接种量为2％(v/v)。将上述种子液以2％(v/v)的接种量接种到mrs液体培养基中，置于37℃恒温厌氧培养箱中培养12
‑
18h。重复操作1次。
58.mrs培养基可以替换为双歧杆菌1号发酵培养基或双歧杆菌2号发酵培养基，培养条件与方法相同。
59.2.外用益生菌样品的制备
60.(1)益生菌发酵上清液：取培养好的益生菌8000r离心15min取上清；调节ph至7.2～7.4；0.22μm一次性滤器过滤除菌，分装后于
‑
20℃冰箱保存。
61.(2)益生菌胞内物：取10ml培养好的益生菌离心收集菌泥，添加1ml pbs溶液溶解；加液氮研磨破碎，收集菌泥悬液；添加1ml pbs溶液溶解，超声破碎；8000r离心10min收集上清液；0.22μm一次性滤器过滤除菌，分装后于
‑
20℃冰箱保存(0.1g湿菌泥得到1ml的胞内上清液)。
62.完全培养基：5％胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素、95％dmem培养基。
63.实施例1：菌株的筛选与鉴定
64.具体步骤如下：
65.1、筛选
66.以来源于江苏无锡地区的人体粪便为样本，将样本经预处理后，在20％甘油中保存于
‑
80℃冰箱，取出解冻后，混匀并吸取0.5ml样本加到4.5ml生理盐水中，以含有0.05g/l半胱氨酸的9g/l生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在mrs固体培养基上，于37℃培养48h，挑取动物双歧杆菌的典型菌落至mrs固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至mrs液体培养基(含有0.05g/l半胱氨酸)增菌，30％甘油保藏，得到菌株；其中，动物双歧杆菌的典型菌落呈乳白色、不规则型、圆形凸起、光滑。
67.2、鉴定
68.提取菌株ccfm1155的基因组，将菌株ccfm1155的16s rdna进行扩增和测序(由苏州金唯智生物科技有限公司进行，ccfm1155的16s rdna核苷酸序列如seq id no.1所示)，将该序列在ncbi中进行核酸序列比对，结果显示菌株ccfm1155为动物双歧杆菌，命名为动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)ccfm1155。
69.实施例2：动物双歧杆菌对h2o2诱导的hacat细胞存活的影响
70.具体步骤如下：
71.(1)细胞培养
72.将冻存的hacat细胞37℃复温后，1000rpm离心5min，取沉淀；将沉淀用完全培养基洗涤一次后，用完全培养基重悬细胞并计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液接种至10cm培养皿，于37℃、气相含5％(v/v)co2的细胞培养箱中培养，次日更换完全培养基继续于37℃、气相含5％(v/v)co2的细胞培养箱中培养。细胞生长至培养皿的70％～80％密度时进行传代。
73.选取生长状态良好的hacat细胞，将hacat细胞经浓度为2.5g/l的胰蛋白酶消化后离心、用完全培养基重悬，进行细胞计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液按照5
×
103个/孔接种于96孔培养板中，每孔100μl，将96孔培养板置于37℃、气相含5％(v/v)co2的细胞培养箱中培养24h；更换含50μm h2o2的完全培养基处理细胞1h。
74.(2)发酵液、活菌或胞内物对h2o2诱导的hacat细胞存活的影响
75.设置正常对照组(空白对照)、动物双歧杆菌mrs培养基发酵液实验组d1、双歧杆菌1号发酵培养基发酵上清液实验组d2、双歧杆菌2号发酵培养基发酵液实验组d3、动物双歧杆菌活菌实验组d4、动物双歧杆菌胞内物实验组d5、干酪乳杆菌实验组l1和戊糖片球菌发酵上清液实验组l2(副干酪乳杆菌和戊糖片球菌均是和动物双歧杆菌ccfm1155同批筛选得到的其他菌)。
76.使用mrs培养基、双歧杆菌1号发酵培养基或双歧杆菌2号发酵培养基培养动物双歧杆菌至菌浓达5
×
109cfu/ml，离心并收集上清，分别记作实验组d1、d2和d3的孵育上清；选取使用mrs培养基培养动物双歧杆菌的发酵液离心获得活菌，用完全培养基重悬致菌浓达5
×
109cfu/ml，记作实验组d4的孵育上清；选取使用mrs培养基培养动物双歧杆菌的发酵液离心获得活菌，制备胞内物，记作实验组d5的孵育上清；使用mrs培养基分别培养干酪乳杆菌实验组l1和戊糖片球菌实验组l2至菌浓达5
×
109cfu/ml，离心并收集上清，分别记作实验组l1和l2的孵育上清。
77.将d1、d2、d3、d4、d5和l1、l2的孵育上清分别与完全培养基混合(5％:95％)，并各吸取100μl培养步骤(1)中经h2o2处理过的hacat细胞24h。对照组添加100μl的完全培养基，每组设置5个复孔，mtt法检测细胞存活率。
78.由图1可知，以正常对照组增殖存活率为61.80％，而动物双歧杆菌显著促进了细胞的增殖(p＜0.001)，动物双歧杆菌mrs培养基发酵液实验组d1细胞存活率为82.74％，双歧杆菌1号发酵培养基发酵液实验组d2细胞存活率为76.52％，双歧杆菌2号发酵培养基发酵液实验组d3细胞存活率为77.91％，动物双歧杆菌活菌实验组d4细胞存活率为78.46％，动物双歧杆菌胞内物实验组d5细胞存活率为85.36％，且较之副干酪乳杆菌(细胞存活率＝52.09％)、戊糖片球菌(细胞存活率＝45.22％)，增殖效果更好。
79.可见，相比于副干酪乳杆菌、戊糖片球菌，动物双歧杆菌ccfm1155更能够显著促进
hacat细胞生长，缓解细胞氧化损伤。
80.实施例3：动物双歧杆菌对h2o2诱导的hacat细胞t
‑
aoc抗氧化能力影响
81.具体步骤如下：
82.选取生长状态良好的hacat细胞，将hacat细胞经浓度为2.5g/l的胰蛋白酶消化后离心、用完全培养基重悬，进行细胞计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液按照106个/孔接种于10cm培养皿中，每孔8ml，将10cm培养皿置于37℃、气相含5％(v/v)co2的细胞培养箱中培养24h；更换含50μm h2o2的完全培养基处理细胞1h。
83.对照组添加100μl的完全培养基，实验组使用与实施例2相同浓度的孵育上清，将d1、d2、d3、d4、d5和l1、l2的孵育上清分别与完全培养基混合(5％:95％)，并各吸取100μl分别培养经h2o2处理过的hacat细胞24h。pbs溶液洗涤细胞两次，然后将细胞刮入4℃pbs溶液中。超声以充分破碎细胞并释放胞内物，4℃、12000g离心5min，
‑
80℃保存上清待测。aoc使用测定试剂盒进行测定。
84.由图2可知，动物双歧杆菌能够提高细胞的抗氧化能力。t
‑
aoc法又称abts法。abts
+
是一种能够相对稳定存在于水溶液中的自由基，其可以通过电子转移被清除。由于不易受外界因素干扰，abts
+
法能够较为准确地体现样品的抗氧化活性。由图2显示，动物双歧杆菌mrs培养基发酵液实验组d1、双歧杆菌1号发酵培养基发酵液实验组d2、双歧杆菌2号发酵培养基发酵液实验组d3、动物双歧杆菌活菌实验组d4、动物双歧杆菌胞内物实验组d5对abts
+
自由基的清除效果高于阳性对照组，而副干酪乳杆菌、戊糖片球菌并没有提高细胞的抗氧化能力。
85.因此，动物双歧杆菌ccfm1155具有良好的抗氧化效果，同时能以抗氧化的方式来保护hacat细胞。
86.实施例4：动物双歧杆菌对h2o2诱导的hacat细胞sod酶活力水平的影响
87.具体步骤如下：
88.培养与h2o2处理细胞的具体实施方式同实施例3。对照组添加100μl的完全培养基，实验组使用与实施例2相同浓度的孵育上清，将d1、d2、d3、d4、d5和l1、l2的孵育上清分别与完全培养基混合(5％:95％)，并各吸取100μl分别培养中经h2o2处理过的hacat细胞24h。pbs溶液洗涤细胞两次，然后将细胞刮入4℃pbs溶液中。超声以充分破碎细胞并释放其中氧化物质，4℃、12000g离心5min，
‑
80℃保存上清待测。sod使用测定试剂盒进行测定。
89.由图3可知，常规hacat细胞的sod酶活力为2.63u/mg。加入动物双歧杆菌mrs培养基发酵液、双歧杆菌1号发酵培养基发酵液、双歧杆菌2号发酵培养基发酵液、动物双歧杆菌活菌、动物双歧杆菌胞内物、副干酪乳杆菌和戊糖片球菌分别处理24h后，sod酶活力分别为6.47、6.25、6.28、5.46、7.04、2.68、1.91u/mg，从数据分析结果可知，动物双歧杆菌加入细胞培养24h后，其sod酶活力相比常规hacat细胞提高了108.42％，细胞的抗氧化酶活力提高后，进一步检验了其抗氧化能力，而副干酪乳杆菌、戊糖片球菌并没有提高细胞sod酶活力。
90.实施例5：动物双歧杆菌对h2o2诱导的hacat细胞分泌nrf2影响
91.具体步骤如下：
92.培养与h2o2处理细胞的具体实施方式同实施例3，pbs溶液洗涤细胞两次，然后将细胞刮入4℃pbs溶液中。通过反复冻融的方法处理细胞悬浮液以破坏细胞。4℃、1000
×
g离心5min，
‑
80℃保存上清待测。
93.nrf2/ho
‑
1使用elisa测定试剂盒进行测定。将细胞分为正常对照组、阳性对照组、动物双歧杆菌mrs培养基发酵液实验组d1、双歧杆菌1号发酵培养基发酵液实验组d2、双歧杆菌2号发酵培养基发酵液实验组d3、动物双歧杆菌活菌实验组d4、动物双歧杆菌胞内物实验组d5、干酪乳杆菌实验组l1和戊糖片球菌实验组l2(副干酪乳杆菌和戊糖片球菌均是和动物双歧杆菌ccfm1155同批筛选得到的其他菌)。
94.由图4可知，动物双歧杆菌ccfm1155作用24h后，能明显促进hacat细胞分泌nrf2的量，与正常对照组和阳性对照组相比，具有极显著性差异(p<0.05)。由此可知，动物双歧杆菌ccfm1155能够激活hacat细胞分泌nrf2的量，也能提高分泌nrf2能力，较对照组nrf2的分泌量提高了40％，从而明显缓解和修复h2o2诱导的hacat细胞氧化造成的伤害，而副干酪乳杆菌、戊糖片球菌并没有促进hacat细胞分泌nrf2的量。
95.实施例6：动物双歧杆菌的应用
96.(1)动物双歧杆菌ccfm1155可用于制备身体乳，身体乳的具体制备过程如下：
97.将10份动物双歧杆菌ccfm1155培养上清、0.3份保湿剂、0.3份润肤剂、0.1份乳化剂、0.5份防腐剂、油相基质30份、水相基质60份混合，得到身体乳。
98.(2)动物双歧杆菌ccfm1155可用于制备沐浴露，沐浴露的具体制备过程如下：
99.将10份动物双歧杆菌ccfm1155培养上清、10份表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸盐、5份乳化剂辛烯基琥珀酸淀粉糖、5份增稠剂聚乙二醇、10份清洁剂十二烷基硫酸钠(月桂醇硫酸钠)、0.3份防腐剂乙内酰脲、0.5份香精，60份水相基质混合，得到身体乳。
100.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。