一种乙肝病毒表面蛋白突变体及其在抗乙肝病毒中的应用

文档序号：26139540发布日期：2021-08-03 14:23阅读：357来源：国知局

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种乙肝病毒表面蛋白突变体及其在抗乙肝病毒中的应用，具体地为乙肝病毒s蛋白突变体，其可抑制人乙肝病毒复制、抑制乙肝表面抗原表达及分泌。

背景技术：

人乙肝病毒(hbv)是慢性乙型肝炎(chb)的病原体。全球有hbv慢性感染者2.7亿人，每年约100万人死于与hbv感染相关的肝病，如肝硬化、肝衰竭和肝癌等，严重威胁着公众健康。慢性乙肝的“功能性治愈”指的是经过治疗，血清乙肝表面抗原(hbsag)和乙肝e抗原(hbeag)均转为阴性，并可能伴有乙肝表面抗体(hbsab)和乙肝e抗体(hbeab)转为阳性，以及血清中乙肝病毒dna载量低于临床检测下限。其中如何使hbsag转阴一直是困扰慢性乙肝治疗的难题。临床主要使用两类抗病毒药物：核苷(酸)类似物(nucleos(t)ideanalogues，nas)和聚乙二醇干扰素-α(pegylatedinterferon-α，peg-ifn-α)。这两类药物能有效抑制hbv复制，降低血清中hbvdna载量，长期使用可有效促进hbeag转阴，但难以实现以血清hbsag转阴为特征的“功能性治愈”。研发新型抗病毒药物是实现慢性乙肝“功能性治愈”的迫切需求。

hbv有三种包膜蛋白，分别是大表面蛋白(l)、中表面蛋白(m)和小表面蛋白(s)。这三种表面蛋白由同一个病毒基因(pres/s)编码。由于蛋白翻译的起始位置不同，因此l蛋白比m蛋白多了108或119个氨基酸(不同的hbv基因型长度不同)，而m蛋白又比s蛋白多了55个氨基酸。hbv包膜蛋白对病毒粒子的组装和病毒感染至关重要。hbv包膜蛋白也可组装形成球形或管状的不含病毒核酸的亚病毒颗粒，大量分泌至血清中以hbsag的形式存在，成为hbv慢性感染的主要血清学标志物，其中s蛋白是构成hbsag的主要蛋白。

hbv聚合酶缺乏校对功能，因此逆转录步骤导致病毒基因组中会包含具有几个突变的hbv准种。而且hbv基因组中开放阅读框相对重叠，导致了hbv基因组的巨大多样性，在hbv长期进化的背景下出现了多达十种基因型(基因型a-j)以及亚型、突变体、重组体，甚至病毒准物种。

s蛋白具有226个氨基酸，含四个跨膜结构域(tm1-tm4)。s蛋白的氨基端(6个氨基酸)、羧基端(3个氨基酸)、连接tm2和tm3的区段(氨基酸99-169，称为主要亲水区(mhr))位于hbsag和病毒粒子的膜外侧(外表面)，而分别连接tm1和tm2、tm3和tm4的区段则位于hbsag和病毒粒子的膜内侧。主要亲水区含有“α”决定簇，包含所有基因型的hbv都共有的b细胞表位簇。重组的hbsag已经被广泛用于乙肝疫苗制备。

由于病毒聚合酶缺乏校对功能，因此hbv的dna复制的错误率比其他dna病毒高得多。自然产生的突变体在宿主免疫系统或外部因素(包括抗病毒治疗)的抗病毒压力下不断演化。s蛋白的突变主要表现为对宿主免疫识别至关重要的表位的改变，如主要亲水区一些位点的突变，可造成对疫苗的免疫逃逸，以及hbsag检测的失败。另外，由于pres/s基因与编码hbv聚合酶的p基因重叠，因此pres/s基因的突变也可能使p基因突变，产生对直接抗病毒药物不敏感的耐药突变。

现有研究表明，慢性乙肝感染者血液中大量的hbsag具有免疫抑制作用，是导致感染者免疫紊乱、免疫功能受损从而有利于hbv慢性感染的关键因素之一。显著降低或清除hbsag有利于重建抗hbv的体内免疫环境，从而有效地控制或清除hbv的慢性感染。寻找特异性抑制hbv复制并抑制hbsag表达和分泌的方法是实现慢性乙肝“功能性治愈”的关键。

技术实现要素：

为了克服现有技术中的缺陷，本发明以有效抑制hbv复制并清除血清hbsag为目的，发现并构建了一种乙肝病毒表面蛋白突变体(具体为s蛋白突变体)，并将其应用于慢性乙肝的治疗。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种乙肝病毒s蛋白突变体，其与野生型乙肝病毒s蛋白相比，包括突变位点：第13位氨基酸突变为精氨酸(r)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)或赖氨酸(k)中的一种；其中，所述野生型乙肝病毒s蛋白包含a、b、c、d、e、f、g、h、i、j所有基因型的人乙肝病毒的s蛋白。上述第13位氨基酸为野生型的亮氨酸(s-l13)，上述突变可简写为：s-l13r/d/e/k。

为了进一步优化上述技术方案，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述野生型乙肝病毒s蛋白的氨基酸序列包括seqidno：1～8。具体地，seqidno：1所示序列为a型乙肝病毒s蛋白序列，seqidno：2所示序列为b型乙肝病毒s蛋白序列，seqidno：3所示序列为c型乙肝病毒s蛋白序列，seqidno：4所示序列为d型乙肝病毒s蛋白序列，seqidno：5所示序列为e型乙肝病毒s蛋白序列，seqidno：6所示序列为f型乙肝病毒s蛋白序列，seqidno：7所示序列为g型乙肝病毒s蛋白序列，seqidno：8所示序列为h型乙肝病毒s蛋白序列。

进一步地，基于b型乙肝病毒s蛋白，所述乙肝病毒s蛋白突变体的氨基酸序列为seqidno：9～12中的一种。

进一步地，所述乙肝病毒s蛋白突变体包括其变体，所述变体包含所述乙肝病毒s蛋白突变体的突变位点且与所述乙肝病毒s蛋白突变体的氨基酸序列的相似性不小于95％，例如上述相似性至少为95％、至少为96％、至少为97％、至少为98％或至少为99％，即其差异为仅存在几个至十几个氨基酸的置换、添加或缺失，所述变体保留了蛋白突变体的功能(抑制人乙肝病毒复制，和/或，抑制乙肝表面抗原表达及分泌)；或者，所述变体包含所述乙肝病毒s蛋白突变体的突变位点且野生型乙肝病毒s蛋白的序列间同位置互相突变(即其在野生型乙肝病毒s蛋白的氨基酸序列的基础上单个氨基酸互相替换组合，且与形成的新序列的相似性可小于95％)，所述变体保留了蛋白突变体的功能(抑制人乙肝病毒复制，和/或，抑制乙肝表面抗原表达及分泌)；其中，所述突变位点包括：第13位氨基酸突变为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或赖氨酸中的一种。具体地，以b型乙肝病毒s蛋白的突变体为例，其变体包含上述突变位点且与序列seqidno：9～12的相似性不小于95％。

本发明的第二个方面是提供一种与任一上述的乙肝病毒s蛋白突变体(s-l13r/d/e/k)相关的生物材料，其选自下述a)～c)中的一种：

a)编码所述乙肝病毒s蛋白突变体的核酸分子；

b)含有所述乙肝病毒s蛋白突变体或a)中所述核酸分子的重组载体、重组微生物、重组细胞系；

c)构建所述乙肝病毒s蛋白突变体所使用的突变引物。

可理解的是，上述核酸分子可以是dna分子，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna分子，如mrna或hnrna。其中，dna分子为包含能形成上述乙肝病毒s蛋白突变体的基因，dna分子也包括能够在宿主细胞中表达乙肝病毒s蛋白突变体的dna分子。其中，所述mrna分子基于所述dna分子转录，其在进入体内后可以编码上述乙肝病毒s蛋白突变体。

可理解的是，上述重组载体、重组微生物、重组细胞系均为本领域常规使用的各种形式，其均可采用本领域常规方法制备；例如，重组载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体(例如重组腺相关病毒载体)等，重组微生物可为酵母、细菌、藻或真菌等，重组细胞系可为将重组载体导入细胞(例如dh5α感受态细胞、huh7细胞)所得到的重组细胞。

进一步地，编码野生型乙肝病毒s蛋白的核酸分子的核苷酸序列包括seqidno：13～20(分别对应于编码a、b、c、d、e、f、g、h型乙肝病毒s蛋白)，在seqidno：13～20所示序列的基础上设计编码所述乙肝病毒s蛋白突变体的核酸分子，以实现野生型乙肝病毒s蛋白的第13位氨基酸突变为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或赖氨酸中的一种。

进一步地，编码所述乙肝病毒s蛋白突变体的核酸分子的核苷酸序列为seqidno：21～24中的一种。具体地，seqidno：21所示序列的核酸分子编码seqidno：9所示序列的s蛋白突变体(b型s-l13r突变体)，seqidno：22所示序列的核酸分子编码seqidno：10所示序列的s蛋白突变体(b型s-l13d突变体)，seqidno：23所示序列的核酸分子编码seqidno：11所示序列的s蛋白突变体(b型s-l13e突变体)，seqidno：24所示序列的核酸分子编码seqidno：12所示序列的s蛋白突变体(b型s-l13k突变体)。

进一步地，构建所述乙肝病毒s蛋白突变体所使用的突变引物中的上游引物的核苷酸序列为seqidno：25～28中的一种，下游引物的核苷酸序列为seqidno：29。具体地，b型s-l13r突变体采用的突变引物序列为seqidno：25和seqidno：29，b型s-l13d突变体采用的突变引物序列为seqidno：26和seqidno：29，b型s-l13e突变体采用的突变引物序列为seqidno：27和seqidno：29，b型s-l13k突变体采用的突变引物序列为seqidno：28和seqidno：29。

上述涉及的野生型乙肝病毒s蛋白、乙肝病毒s蛋白突变体的氨基酸序列以及编码其的核酸分子、采用的突变引物的具体序列信息如下表所示：

进一步地，所述重组载体包括重组质粒、重组腺相关病毒载体。

进一步地，所述重组质粒的构建步骤包括：构建ps-wt重组质粒；以ps-wt重组质粒为模板采用对应的突变引物进行相应突变位点的突变，分别构建ps-l13r、ps-l13d、ps-l13e、ps-l13k重组质粒。具体地，包括步骤：(1)采用pcdna3载体构建ps-wt重组质粒：pcr扩增获得s-wt基因片段，通过对pcr产物和pcdna3质粒利用酶切和连接的方法，将hbvb6毒株的s基因插入到bamhi和noti之间，构建ps-wt重组质粒，其pcr扩增采用的引物序列为s-f(5’-cgcggatccatggagaacatcgcatcaggact-3’seqidno：30)和s-r(5’-atttgcggccgcttaaatgtatacccaaagacaa-3’seqidno：31)；(2)以ps-wt为模板进行了l13r，l13d，l13e，l13k点突变，其对应的突变引物序列如下：上游引物seqidno：9～12，下游引物seqidno：13，通过pcr扩增、产物消化后进行连接构建重组质粒ps-l13r，ps-l13d，ps-l13e，ps-l13k。

进一步地，所述重组腺相关病毒载体的构建步骤包括：将s-wt和s-l13r基因插入pav-fhaav载体，获得重组pav-s-wt，pav-s-l13r；将pav-s-wt，pav-s-l13r和pav-fh分别和padhelper质粒和paav-rep/cap质粒共转hek293t细胞，制得重组腺相关病毒载体。

本发明的第三个方面是提供一种任一上述的乙肝病毒s蛋白突变体或任一上述的生物材料在制备抗乙肝病毒药物中的应用，或在抗乙肝病毒中的应用，或在治疗慢性乙肝中的应用。

进一步地，在所述应用中，所述乙肝病毒s蛋白突变体抑制乙肝病毒复制，和/或，抑制乙肝表面抗原表达和分泌。更进一步地，所述乙肝病毒s蛋白突变体对乙肝表面抗原表达和分泌的抑制作用呈剂量依赖性。在一具体实施方式中，上述s蛋白突变体可以快速清除慢性乙型肝炎感染小鼠模型血液中hbsag；更具体地，在adv/prcccdna小鼠模型中，通过单次尾静脉注射携带s-l13r基因的重组腺相关病毒(aav-s-l13r)，两周内所有小鼠血中hbsag转阴，注射7周内7只小鼠中有4只小鼠出现了乙肝表面抗体(hbsab)，hbeag和hbvdna也逐步降低至检测下限，并且没有引起明显的alt上升。

进一步地，所述应用为将所述乙肝病毒s蛋白突变体或其生物材料导入肝细胞内以进行s-l13r/e/d/k突变体的表达。

本发明的第四个方面是提供一种组合物，其包含任一上述的乙肝病毒s蛋白突变体(s-l13r/d/e/k)或任一上述的生物材料。

进一步地，所述组合物包括能在肝细胞表达所述乙肝病毒s蛋白突变体(s-l13r/d/e/k)的核苷酸序列。

进一步地，所述组合物为抑制乙肝病毒复制，和/或，抑制乙肝表面抗原表达和分泌的药物组合物，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。即上述药物组合物可用于制备治疗乙肝的药物。可理解的是，可选的，上述药学上可接受的载体为可在体内体外表达该s蛋白突变体的表达载体。上述载体和赋形剂均可为本领域常规使用的试剂类型。

本发明的第五个方面是提供一种抗hbv复制，和/或，抑制hbsag表达及分泌的方法，其使用任一上述的乙肝病毒s蛋白突变体或任一上述的生物材料或由两者之一制备的组合物。

本发明的第六个方面是提供一种治疗慢性乙肝的方法，其使用任一上述的组合物或由其制备的药物，具体步骤包括将有效量的上述组合物或由其制备的药物施用给受试者。上述受试者可为人或动物。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

本发明首次发现并构建的乙肝病毒s蛋白突变体s-l13r，s-l13k，s-l13e，s-l13d在细胞水平对hbv的复制和hbsag的表达和分泌有明显的抑制作用，且动物实验结果显示血液hbsag转阴，在血液中可出现表面抗体hbsab，hbeag水平和血清中hbvdna水平也实现转阴，并且在转阴过程中没有引起明显的alt上升，证明了该蛋白突变体的使用安全性，且s蛋白突变体对不同基因型hbv的hbsag的分泌均有显著影响，不同基因型s蛋白突变体对同一基因型hbv的hbsag的分泌也均有显著影响，这为临床治疗慢性化乙肝提供了新的思路和方法。

附图说明

图1为本发明一实施例中乙肝病毒s蛋白突变体s-l13r/d/e/k在huh7细胞中的表达验证结果示意图。

图2为本发明一实施例中乙肝病毒s蛋白突变体s-l13r/d/e/k抑制hbv的复制以及抑制hbsag的表达及分泌的结果示意图。

图3为本发明一实施例中乙肝病毒s蛋白突变体s-l13r/d/e/k对野生型s蛋白的表达和分泌的影响结果示意图。

图4为本发明一实施例中乙肝病毒s蛋白突变体s-l13r对不同基因型hbv复制子hbsag表达和分泌的影响结果示意图。

图5为本发明一实施例中不同基因型s蛋白突变体对同一基因型hbv复制子hbsag分泌的影响结果示意图。

图6为本发明一实施例中小鼠模型上验证aav-s-l13r对乙肝慢性化小鼠的影响结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

实施例1：ps-wt以及突变重组质粒的构建和表达验证

本实施例以b型乙肝病毒s蛋白为例进行其重组质粒的构建及表达验证。

重组质粒的构建，其包括步骤：

1.在pcdna3载体的骨架上构建ps-wt重组质粒。利用酶切和连接的方法，将hbvb6毒株的s基因插入到bamhi和noti之间，具体如下：将phbvb61.3复制子作为模板，通过pcr扩增实验、胶回收的方式获得s-wt基因片段。pcr引物为s-f和s-r。

s-f：5’-cgcggatccatggagaacatcgcatcaggact-3’(seqidno：30)

s-r：5’-atttgcggccgcttaaatgtatacccaaagacaa-3’(seqidno：31)

pcr反应体系如下：

pcr反应条件如下：98℃3min；98℃15s、60℃15s、72℃1min，共35个循环，72℃10min后进行胶回收。

通过对pcr产物和pcdna3质粒进行bamhi和noti双酶切，回收目的片段及线性化载体片段，用t4dna连接酶连接，构建重组表达质粒ps-wt，转化dh5α感受态细胞，使用氨苄抗性平板筛选阳性克隆，对菌液pcr鉴定阳性的菌液提取重组质粒进行序列测定，将鉴定正确的质粒命名为：ps-wt。

2.随后以ps-wt为模板进行了l13r，l13d，l13e，l13k点突变，突变引物如下：

pcr体系如下(以l13r突变为例)：

反应条件为：94℃2min，98℃10s，55℃30s，68℃7min，共7个循环，随后4℃保存。

将pcr样品中加入1μldpni，37℃消化1h。然后进行连接，连接体系如下：

转化dh5α感受态细胞，使用氨苄抗性平板筛选阳性克隆，对菌液pcr鉴定阳性的菌液提取重组质粒进行序列测定，将鉴定正确的质粒分别命名为：ps-l13r，ps-l13d，ps-l13e，ps-l13k。

重组质粒的表达验证，其包括步骤：

将ps-wt，ps-l13r，ps-l13d，ps-l13e，ps-l13k，pcdna3质粒(pctrl)分别转染huh7细胞，48小时后进行elisa验证，转染方法、elisa方法如下：

(1)转染：转染前一天，将huh7细胞消化进行铺板，并轻微振荡均匀，待细胞密度达到80～90％，进行转染。用无血清的dmem按照1μg/100μl配制含质粒dna的转染液，并按照1：2比例加入转染试剂turbofect。快速吹打20下，并静置15-20min。将含质粒dna和转染试剂的转染液均匀加入细胞上清中，轻微晃动。随后放入培养箱进行培养。48h后收集样品进行elisa检测。

(2)elisa检测hbsag：hbsag检测试剂盒购自上海科华。细胞上清直接检测，而细胞用预冷的pbs溶液洗两遍，按照每10mm培养皿加入400μl细胞裂解缓冲液，冰上静置20min。细胞裂解缓冲液配方：1％np40，1mmedta，50mmnacl，10mmtris-hcl，ph7.9。在反应孔中加入50μl待测样品，选取两个孔分别滴加阳性对照和阴性对照，轻微震荡均匀后滴加50μl酶结合物，轻微震荡混匀，覆盖封片纸防止挥发，37℃培养箱孵育30min。孵育结束后，甩去孔内混合液体，加入工作浓度的洗涤液，重复洗涤5次，并甩干。在反应孔中各滴加一滴显色液a和显色液b，轻微震荡混匀，封片纸覆盖后，37℃培养箱继续孵育15-20min。各孔滴加一滴终止液，轻微震荡混匀，用酶标仪在450nm波长下读取od450值。

结果如图1所示：ps-wt在转染huh7细胞后，elisa方法在细胞内和细胞上清中检测到s蛋白的表达，而ps-l13r，ps-l13k，ps-l13e，ps-l13d在转染huh7细胞后，只能在细胞内检测到s蛋白，而在细胞上清中检测不到，而且细胞内的蛋白表达水平明显低于ps-wt。

实施例2：s-l13r/d/e/k突变体在细胞水平对hbv复制子phbvb61.3的复制和hbsag表达和分泌的影响

利用southernblot检测hbv复制能力，利用elisa检测hbsag的表达和分泌

1.将phbvb61.3分别和按照实施例1的方法构建的ps-wt、ps-l13r、ps-l13k、ps-l13e、ps-l13d以及pcdna3(pctrl)按照1：2共同转染huh7细胞，转染72h后收集细胞上清和细胞裂解液进行southernblot检测hbv复制能力，利用elisa(步骤与实施例1中检测方法相同)检测hbsag的表达和分泌。

2.southernblot方法检测细胞核心颗粒内hbvdna。方法如下：

(1)细胞裂解：采用与实施例1相同的细胞裂解方法将细胞进行裂解。

(2)dnaseⅰ处理：将细胞裂解液进行收集并剧烈振荡30s，12000g离心10min，收集上清，按照每400μl裂解缓冲液加入4μl1mmgac2，4μl10mg/mldnaseⅰ和4μl10mg/mlrnasea，于37℃水浴，反应1h。

(3)peg沉淀：12000g离心2min，收集上清，按照每400μl裂解缓冲液加入12μl0.5medta和125μl35％peg8000/1.75mnacl，4℃旋转过夜。

(4)dnaseⅰ再处理：12000g离心10min，弃上清，并重悬于100μldnaseⅰ溶液(10mmmgac2，100μg/mldnaseⅰ，10mmtris-hcl，ph7.9)，37℃水浴30min以除去残留的质粒dna。

(5)蛋白酶k裂解病毒核衣壳。按下表配方配制sds/蛋白酶k溶液：

每个样品加入300μl，55℃处理过夜。

(6)dna抽提纯化：然后以等体积的酚/氯仿抽提2次，离心取水层，加入1/10体积的3mnaac(ph5.2)溶液和等体积异丙醇，-20℃沉淀过夜，15000g离心15min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗两遍并离心弃尽上清乙醇，开盖静置待残留乙醇挥发后，用25μl灭菌去离子水溶解，待下步电泳实验。

(7)琼脂糖凝胶电泳：将提取的dna进行1％琼脂糖凝胶电泳(120v，1h)，电泳缓冲液为1×tae；

(8)变性：将电泳后的整块凝胶浸泡于现配的变性液中，摇床上缓慢晃动1h。变性液配方为：1.5mnacl，0.5mnaoh。

(9)中和：待变性结束后，加入现配的中和液，摇床上缓慢晃动45min，然后弃中和液，加入新的中和液，继续作用45min。中和液配方：1.5mnacl，1mtris-hcl，ph7.4。

(10)转膜：本方法利用向下毛细管转移法，所有的材料首先在20×ssc溶液中浸泡，由下至上分别是：10cm后的吸水纸层、parafilm膜、3层3mm滤纸(比尼龙膜的长、宽各大1cm)、尼龙膜(比琼脂糖凝胶长、宽各大1cm)、电泳后的琼脂糖凝胶、3层3mm滤纸、长条形滤纸形成的盐桥。其中尼龙膜剪去左上角进行方向标记，并保证琼脂糖凝胶和尼龙膜之间没有气泡，parafilm膜的作用是防止短路。常温转膜过夜。20×ssc溶液配方：3mnacl和0.3m柠檬酸钠。

(11)dna交联：转膜结束后，将尼龙膜置于2×ssc溶液浸泡10min，并用滤纸进行夹心吸干残存液体，再将尼龙膜置于干净的滤纸上面，正面朝上，在紫外灯下交联2min，室温保存待southernblot。

(12)预杂交：将膜放入杂交管中，加入杂交液10ml，42℃预杂1h。

(13)探针变性和杂交：取适量探针，于100℃沸水浴变性中5min，然后迅速将变性的探针放置于冰上5min。回收预杂交液，换入新鲜的杂交液10ml，加入变性好的探针。42℃杂交过夜。

(14)洗去除未结合的探针：先用高盐洗液室温洗2遍，每遍5min；再用低盐洗液68℃洗2遍，每遍15min；高盐洗液配方：2×ssc，0.1％sds(w/v)，0.45μm滤器过滤；低盐洗液配方：0.5×ssc和0.1％sds(w/v)，0.45μm滤器过滤。

(15)免疫学检测dig：

免疫检测中涉及到的几种溶液及其配方：

(16)封闭：用maleicacidbuffer将10×blockingsolution稀释至使用浓度作为封闭液，弃掉低盐洗液，加入10ml封闭液，37℃封闭30min-1h。

(17)孵育抗体：将anti-digap按10000rpm离心5min，用10ml新配制的封闭液按1：10000稀释抗体，弃封闭液并加入抗体，37℃孵育30min。

(18)洗去未结合抗体：用washingbuffer洗膜2次，37℃每次15min。

(19)显色：首先用detectionbuffer平衡膜5min，将平衡好的尼龙膜置于parafilm膜上，正面朝上，均匀滴加cspd显色液，再盖一层parafilm膜，去除尼龙膜正面的气泡和多余的显色液，避光室温放置5min，用化学发光检测仪器检测累积信号，保存结果。

结果如图2所示：将hbv复制子phbvb61.3分别与表达质粒共转huh7细胞，结果显示，与pctrl和ps-wt相比，ps-l13d，ps-l13e，ps-l13k，ps-l13r明显降低细胞内核心颗粒内dna水平(图2a)，表明ps-l13d，ps-l13e，ps-l13k，ps-l13r明显抑制hbv的复制。而elisa结果显示，与pctrl和ps-wt相比，转染ps-l13d，ps-l13e，ps-l13k，ps-l13r后，细胞上清中检测不到hbsag，而细胞内的hbsag水平明显降低(图2b)，而上清中hbeag的水平没有明显差异(图2c)。上述结果表明着s蛋白突变体对hbv复制子的hbsag的表达和分泌也有明显的抑制作用。

实施例3：s-l13r/d/e/k突变体在细胞水平对野生型s蛋白的表达和分泌的影响

为了验证s-l13r/d/e/k突变体对野生型s蛋白的表达和分泌是否有直接的抑制作用，本实施例将ps-wt和ps-l13r等质粒分别按1：0、1：1、1：2、1：4、1：8的比例共同转染huh7细胞，其中ps-wt的转染量恒定，ps-l13r的转染量随比例增加，用pcdna3质粒补齐总转染量。转染48h后收集细胞上清和裂解液用elisa方法(步骤与实施例1中检测方法相同)对胞内和上清中hbsag进行测定。

结果如图3所示，elisa结果显示随着ps-l13r转染量的增加，上清中hbsag水平逐渐降低(图3a)，转染比例为1：4时hbsag水平接近cut-off值。而胞内hbsag水平并没有随着转染比例的变化而出现明显变化。这提示在huh7细胞内，s-l13r抑制s-wt蛋白的表达和分泌，并且这种抑制作用呈剂量依赖性。与ps-l13d，ps-l13k，ps-l13e等共转获得类似的结果，表明s-l13r/d/e/k突变体均可直接抑制s-wt的表达和分泌。

实施例4：验证s-l13r对不同基因型hbv复制子hbsag表达和分泌的影响

本实施例以s-l13r为例，验证s蛋白突变体对不同基因型hbv复制子的hbsag的表达和分泌的影响。选取ncbi数据库中8株不同基因型的hbv，genbank序列号分别为a型(ap007263)，b型(kr232337)，c型(af461363)，d型(ab267090)，e型(ap007262)，f型(lt935663)，g型(ab625342)，h型(ab298362)，并通过将基因组插入puc18载体，获得pa，pb，pc，pd，pe，pf，pg，ph复制子。将ps-l13r分别与不同基因型hbv复制子按1：1共转huh7细胞，转染48小时后，检测细胞上清中hbsag。

结果如图4所示，elisa结果显示，与ps-wt和pctrl相比，转染ps-l13r后，不同基因型复制子的上清中均检测不到hbsag。上述结果表明，s蛋白突变体对不同基因型hbv的hbsag的分泌均有显著影响。

实施例5：验证不同基因型s蛋白突变体对同一基因型hbv复制子hbsag分泌的影响

以b型复制子phbvb61.3为例，以s-l13r为例，验证不同基因型s蛋白突变体对同一基因型hbv复制子hbsag分泌的影响。将上述复制子的s基因插入pcdna3载体，分别命名为pa-s-wt，pb-s-wt，pc-s-wt，pd-s-wt，pe-s-wt，pf-s-wt，pg-s-wt，ph-s-wt。然后在以上质粒中引入l13r突变，分别命名为pa-s-l13r，pb-s-l13r，pc-s-l13r，pd-s-l13r，pe-s-l13r，pf-s-l13r，pg-s-l13r，ph-s-l13r。将不同基因型s蛋白突变体质粒与phbvb61.3按1：1共转huh7细胞，转染48小时后检测细胞上清中hbsag水平。

结果如图5所示，elisa结果显示，与pctrl相比，转染不同基因型ps-l13r后，上清中均检测不到hbsag。上述结果表明，不同基因型s蛋白突变体对同一基因型hbv的hbsag的分泌均有显著影响。

实施例6：验证突变s蛋白对乙肝慢性化小鼠的影响

本实施例利用aav(腺病毒相关病毒，adeno-associatedvirus)载体，并以s-l13r为例验证了该系列突变蛋白对乙肝慢性化小鼠的影响，检测aav-s-l13r清除rcccdna小鼠血清中的hbsag，具体步骤包括：

1.构建分别携带野生型s和s-l13r基因的重组aav载体aav-s-wt和aav-s-l13r。

按照实施例1重组质粒的构建方法将s-wt和s-l13r基因插入pav-fhaav载体，获得重组pav-s-wt，pav-s-l13r。然后将pav-s-wt，pav-s-l13r和pav-fh分别和padhelper质粒和paav-rep/cap质粒共转hek293t细胞，感染72小时之后收毒。分别收获培养基上清和细胞沉淀，细胞上清用peg8000沉淀，然后通过碘克沙醇法对病毒进行纯化，并利用qpcr方法检测病毒滴度，获得包装好的病毒。

2.将alb-cretg小鼠按照1.5×10⁹pfu/只的剂量尾静脉注射adv/prcccdna。注射4周后采集血液，分离血清，进行hbsag和hbeag检测。将双阳性小鼠(乙肝慢性化)随机分成3组(每组n＝7)，按照2×10¹¹geq/只的剂量分别尾静脉注射aav-s-l13r，aav-hbs-wt和aav-ctrl，并取注射后的不同时间点进行血液采集，分析aav-s-l13r对慢性化小鼠体内的hbsag、hbeag、hbvdna水平的影响，同时检测血清中alt和hbsab水平。hbsag和hbeag以及hbsab检测均采用上海科华相关试剂盒。hbvdna水平和alt水平检测由上海艾迪康公司检测完成。

结果如图4所示，aav-s-l13r组小鼠在注射后1周已经有3只小鼠血清中hbsag被快速清除。注射后2周，该组所有小鼠均实现hbsag转阴，持续观察到注射aav后16周，hbsag均保持阴性(图6a)。aav-s-l13r组小鼠血清中hbeag水平也明显下降，在注射6周后实验全部转阴(图6b)。而且，伴随着hbsag的快速清除，在注射后4周(hbsag转阴后2周)有一只小鼠出现hbsab，在注射后7周(hbsag转阴后5周)共有4只出现hbsab，实现血清学转化，并且hbsab水平逐步升高(图6c)。该组小鼠血清中hbvdna水平也逐渐降低，在注射6-7周基本达到检测下限值(图6d)。而且重要的是在整个实验过程中没有检测到很明显的alt水平的变化(图6e)，表明s-l13r在清除血清hbsag，hbeag和hbvdna的过程中没有引起明显的肝损伤。而aav-hbs-wt组小鼠在注射7周后有1只小鼠hbsag转阴，aav-ctrl组小鼠分别在注射9周和13周后有1只小鼠hbsag转阴，两组的大部分小鼠血清中hbsag水平持续保持强阳性，没有hbsab的出现，hbeag和hbvdna也持续阳性。以上结果说明s-l13r确实可以显著抑制hbsag，甚至实现解除慢性化小鼠对hbsag的免疫耐受，实现血清学转化。

由上述实施例可知，本发明发现乙肝病毒s蛋白突变体s-l13r，s-l13k，s-l13e，s-l13d可以在细胞水平对hbv的复制和hbsag的表达和分泌有明显的抑制作用，动物实验结果显示单次注射aav-s-l13r可以在2周内清除血清中hbsag，并且在7周内实现hbvdna以及hbeag转阴，而且有部分小鼠出现hbsab，这表明在实现hbsag转阴的同时，可解除慢性化小鼠对hbsag的免疫耐受，实现血清学转化，且s蛋白突变体对不同基因型hbv的hbsag的分泌、不同基因型s蛋白突变体对同一基因型hbv的hbsag的分泌均具有显著影响，这为临床治疗慢性化乙肝提供了新的思路和方法。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。

序列表

<110>复旦大学

<120>一种乙肝病毒表面蛋白突变体及其在抗乙肝病毒中的应用

<160>31

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>226

<212>prt

<213>a型s蛋白(hepatitisbvirus)

<400>1

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151015

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65707580

ileilepheleupheileleuleuleucysleuilepheleuleuval

859095

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serthrthrthrserthrglyprocyslysthrcysthrthrproala

115120125

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145150155160

tyrleutrpglutrpalaservalargphesertrpleuserleuleu

165170175

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tyrile

225

<210>2

<211>226

<212>prt

<213>b型s蛋白(hepatitisbvirus)

<400>2

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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210215220

tyrile

225

<210>3

<211>226

<212>prt

<213>c型s蛋白(hepatitisbvirus)

<400>3

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225

<210>4

<211>226

<212>prt

<213>d型s蛋白(hepatitisbvirus)

<400>4

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210215220

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225

<210>5

<211>226

<212>prt

<213>e型s蛋白(hepatitisbvirus)

<400>5

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serserthrthrserthrglyprocysargthrcysthrthrleuala

115120125

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<211>226

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<213>h型s蛋白(hepatitisbvirus)

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145150155160

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<213>编码b型s-l13d突变体的核酸分子(artificialsequence)

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