一种环金属铱配合物敏化NiO阴极光电化学生物传感器的制备方法

本发明属于光电功能材料及生物分析领域，具体涉及一种用于检测dam甲基转移酶的环金属铱配合物敏化nio阴极光电生物传感器的制备方法。

背景技术：

dna甲基化是基因组的重要表观遗传修饰，它在各种人类疾病的基因表达、细胞分化和发病机理中起着关键作用。dna甲基化异常在肿瘤发生发展中起重要作用,可导致肿瘤细胞中基因表达异常。dna甲基化与dna甲基转移酶的活性密切相关。最近的研究表明，dna甲基转移酶已成为各种类型癌症中的预测性生物标志物和潜在的治疗靶标。因此，对dna甲基转移酶进行灵敏，准确的活性检测和抑制剂(抗甲基化药物)筛选对于临床诊断和治疗具有重要意义。

光电化学生物传感器融合了电化学和化学发光检测方法的优点，具有灵敏度高、设备简单、成本低廉、易于微型化和集成化等特点，在生物分析领域备受瞩目。一般来说，光电分析依靠光敏材料，该材料将光的输入转换为电流作为读出信号。因此，光敏材料的性能在光电分析中起着举足轻重的作用，光敏材料的合成被认为是性能优异的光电分析方法的最关键部分。近几十年来，已开发出多种光活性材料，包括无机半导体，金属配合物和有机小分子，用于构建光电分析系统。通常，光活性材料可根据电荷载体的形式分为n型和p型。诸如tio2，cds等的n型材料基于在其导带上的电子注入，而p型材料则通过在其价带(vb)中进行空穴注入来实现。目前，基于n型材料的光电阳极分析系统因其良好的检测灵敏度而在生物分析领域占据主导地位。相反，基于p型材料的光电阴极系统研究较少。近年来，阴极光电体系因能避免光阳极/电解液界面固有氧化反应的干扰而引起越来越多的关注。目前，研究最广泛的光电阴极体系是基于染料敏化的nio半导体。但其光电转换效率比n型半导体低得多，因此需要高效光敏剂来解决nio的缺陷。环金属铱配合物由于具有丰富且宽范围可调的光物性质和电化学性质近年来被广泛用于有机电致发光、电致化学发光、染料敏化太阳能电池等领域。目前阴极光电生物分析才刚刚起步，尤其是至今尚未报道ir(iii)配合物敏化nio用于生物分析的体系。本发明引入了一种可见光激发的环金属铱配合物作为光敏剂，构建了基于该材料敏化nio的光阴极生物传感器，用于一种dna甲基转移酶的检测。

技术实现要素：
：

鉴于现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于检测dna甲基转移酶的环金属铱配合物敏化nio阴极光电生物传感器的制备方法，具有高灵敏度、高特异性的特点。

基于上述目的，本发明所涉及的技术方案如下：

本发明提供一种基于[(c6)2ir(dppz)]⁺pf6^-(其中c6为香豆素-6，dppz为二吡啶并[3,2-a:2’,3’-c]吩嗪)敏化nio阴极光电生物传感器的制备方法，用于检测dna甲基转移酶活性。

包括以下步骤：

(1)nio纳米薄膜修饰ito电极的制备：首先将面积固定的ito电极按顺序依次放入无水乙醇、丙酮、无水乙醇、超纯水中清洗并干燥。将清洗后的ito电极浸入含有0.25mni(no3)2·6h2o和0.25m六亚甲基四胺的混合溶液中，在电热恒温鼓风干燥箱中90℃下加热60分钟，并自然冷却到室温。用超纯水对ito电极冲洗3次后，在氮气流下干燥。最后将ito电极放到马弗炉中300℃加热30分钟，待自然冷却至室温得到nio/ito电极。

(2)捕获电极的制备：将步骤(1)制备的nio/ito电极在室温下浸入含有h2o2，nh4oh和h2o(体积比为：1:1:5)的混合溶液中在电极表面形成羟基化层，清洗并在氮气流中干燥后，将电极浸入5％(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中孵育12小时，以形成富含nh2的自组装层。随后浸入金胶(aunps)溶液中孵育12小时，得到金纳米颗粒修饰的nio/ito电极(aunps/nio/ito)。与cp-dna的溶液孵育12小时后通过au-s键将其固定在电极上，然后滴加6-巯基1-己胺溶液至电极表面孵育2小时，得到cp-dna/aunps/nio/ito捕获电极。

所述金胶溶液的制备方法为：将制备过程中所需的玻璃仪器、磁子及存放金纳米粒子的容器均用超纯水洗净，用王水浸泡过夜，之后用大量超纯水冲洗至ph值为中性，烘干备用。加入超纯水(95.88ml)至三口烧瓶中并安装回流装置。加热至沸腾时，迅速向三口烧瓶中注入氯金酸haucl4(1.0mm,100ml)，随后将柠檬酸三钠(38.8mm,10ml)快速添加到再次沸腾8s的上述溶液中，继续观察溶液由淡黄色慢慢变为深酒红色，继续回流20min，停止加热，边搅拌边自然冷却至室温，4℃避光保存。

所述cp-dna的序列为：5’-tttacaagggctaggttag-3’(5’端修饰-sh)。

优选的，所述cp-dna的稀释溶液为dp-bufferⅰ(20mmtris,100mmnacl,5mmmgcl2,6.7mmtcep,ph7.5)，cp-dna的浓度为1μm。

(3)甲基化反应及催化发夹自组装反应(cha)信号放大反应、杂交链式反应(hcr)信号放大：包含1μm发夹hdam、160μmsam、1×dambuffer(50mmtris-hcl(ph＝7.5)，10mmedta，5mm2-巯基乙醇)和不同浓度的dam甲基转移酶的甲基化反应混合液(20μl)在37℃下孵育1小时，然后加入10×cutsmart缓冲液(500mm乙酸钾，200mmtris-乙酸盐，100mm乙酸镁，1mg/ml牛血清白蛋白，ph＝7.9)和10udpni，37℃下进行酶切反应1小时，在80℃下反应20分钟灭活。最后，向酶切反应混合物中加入5μl发夹h1(1μm)和5μl发夹h2(1μm)，在37℃下孵育2小时。然后将此反应混合物(10μl)滴加至步骤(2)制得的捕获电极上，37℃孵育2小时。经清洗后加入发夹h3和h4的混合物继续孵育2小时，引发hcr，在ito工作电极上形成长的dna双链聚合物。

所述发夹hdam的序列为：5’-gtgaatagagtatgatccgacttctaacctagctcactgtggatcatactctattcac-3’

所述发夹h1的序列为：5’-cacagtgagctaggttagaagtcgccatgtgtacacgacttctaacctagcccttgt-3’

所述发夹h2的序列为：5’-atgtcgtgtacacatggcgacttctaacctagctcactgacagaagtcgccatgtgtgtta-3’

所述发夹h3的序列为：5’-gtcgccatgtgtgttacatcgttaacacacatggcgacttctgt-3’

所述发夹h4的序列为：5’-acgatgtaacacacatggcgacacagaagtcgccatgtgtgtta-3’

优选的，所述发夹h3和h4溶液均为dp-bufferⅱ(20mmtris,100mmnacl,5mmmgcl2,ph7.5)。发夹h3和h4溶液的浓度均为1μm。

(4)光敏剂的负载：向步骤(3)制备的电极滴加配合物[(c6)2ir(dppz)]⁺pf6^-的溶液孵化30分钟，冲洗后用于光电检测。

优选的，所述铱配合物[(c6)2ir(dppz)]⁺pf6^-溶液的溶剂为dmf：pbs(0.01m)(1:3)

(5)光电信号检测：将步骤(4)制备的光电传感器浸入0.01mpbs缓冲溶液中，采用490nm可见光进行激发，每20s开关光源一次，偏置电压为-0.1v进行光电流检测，实现对不同浓度dam甲基转移酶的信号响应。

优选的，所述pbs缓冲溶液的ph＝8.0。

本发明的有益效果：

(1)本发明公开了一种环金属铱配合物[(c6)2ir(dppz)]⁺pf6^-敏化nio阴极光电生物传感器的制备方法，该策略证明了铱(iii)配合物敏化的nio光阴极在pec生物分析中的可行性和有希望的前景。

(2)采用公开的环金属铱配合物敏化nio制备的光阴极生物传感器用于dam甲基转移酶的检测，具有灵敏度高、特异性好的特点，可用于筛选抑制剂。对于靶dam甲基转移酶，检测限低至0.0072u/ml。

附图说明：

图1光电阴极生物传感器制备示意图；

图2环金属配合物[ir(c6)2(dppz)]⁺pf6^-敏化nio/ito电极的光电流响应示意图；

图3传感器对不同浓度靶标dam甲基转移酶的光电流响应示意图；

图中所示a-g依次代表的dam甲基转移酶浓度为0.01,0.05,0.1,1,10,50,100u/ml。

图4传感器对靶标dam甲基转移酶浓度的线性关系图。

图中对应的dam甲基转移酶浓度从左到右依次为0.01,0.05,0.1,1,10,50,100u/ml。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

cp-dna/aunps/nio/ito捕获电极的制备：

将沉积上nio纳米薄膜的ito电极浸入含有h2o2，nh4oh和h2o(体积比为1:1:5)的混合溶液中，在室温下反应30分钟。取出的电极经超纯水清洗三次后在n2气氛下吹干，随之将电极再次浸入5％aptms的乙醇溶液中反应过夜。然后，用无水乙醇冲洗电极并放入烘箱中110℃干燥15分钟。自然冷却至室温，得到了表面含有-nh2的自组装电极，以便与下一步aunps形成稳定的金-氨键。接下来，将组装好的电极浸入aunps(13nm)溶液中孵育12小时，待修饰金纳米粒子后，再次用超纯水进行冲洗并在氮气下干燥。将10μl经过tcep活化的cp-dna(1μm)滴加在电极表面，在37℃下孵育12小时，所处环境保持一定湿润。随后，用0.01mpbs缓冲溶液轻微冲洗后，在电极表面滴加10μl1mm的mch溶液，反应持续2小时，以防止非特异性吸附的发生。用0.01mpbs缓冲溶液再次轻微冲洗。得到孵育好的cp-dna/aunps/nio/ito电极，为接下来甲基化引发的一系列dna链置换反应做准备。

实施例2

甲基化及催化发夹组装反应(cha)

该反应需要dam甲基转移酶、s-腺苷甲硫氨酸(sam)和dpnⅰ参与的两个连续反应触发开启。反应之前需要将hdam、h1和h2折叠成了稳定的发夹结构。发夹底物的甲基化过程是在20μl反应混合物中进行的。20μl反应混合物包含1μmhdam、160μmsam、1×dambuffer(50mmtris-hcl(ph＝7.5),10mmedta，5mm2-巯基乙醇)和各种各样浓度的dam甲基转移酶，将混合物在37℃下孵育1小时。接着在上述溶液中添加10×cutsmart缓冲液(500mm乙酸钾，200mmtris-乙酸盐，100mm乙酸镁，1mg/mlbsa，ph＝7.9)和10udpni，在37℃下进行裂解反应1小时，然后在80℃下失活20分钟结束反应。最后，向甲基化后的反应混合物中添加10μl包含1μmh1和1μmh2的cha原料混合物，在37℃下孵育2小时得到了cha产物。

实施例3

用于dam甲基转移酶检测的光电化学生物传感器的制备：

将实施例2的cha反应产物滴加到实施例2制备的ito工作电极上，37℃孵育2小时，以触发与cp-dna的杂交，得到了dna的复合物。接着0.01mpbs缓冲溶液(ph＝7.4)轻微冲洗三次后，将10μl包含有1.0μmh3和1.0μmh4的混合溶液滴加在含dna复合物的改性ito电极上，在37℃下仍然反应2小时。继续用0.01mpbs缓冲溶液(ph＝7.4)轻轻地冲洗三次后，在修饰电极上滴加10μl[ir(c6)2(dppz)]⁺pf6^-的dmf/pbs(体积比为1:3)溶液并孵育30分钟。为了防止非特异性吸附配合物和增加背景值，用dmf/pbs(体积比为1:3)缓冲溶液轻微冲洗电极。得到了能够检测dam甲基转移酶的pec生物传感器平台。

实施例4

将实施例3制备好的传感器浸入0.01mpbs缓冲溶液中(ph＝8.0)，采用饱和ag/agcl为参比电极；铂丝为对电极；由光电化学分析仪记录和检测光电流。采用490nm可见光进行激发，每20s自动开关光源一次。光电流强度与dam甲基转移酶的浓度在0.01to100u/ml范围内成线性关系，线性方程为i＝27.7853cdam+94.3593，r²＝0.9908，其中i为光电流强度(na)，c为dam甲基转移酶浓度(u/ml)。检测限为0.0072u/ml。

序列表

<110>李春香

林小家

宗成雪

王欢

张迎涛

<120>一种环金属铱配合物敏化nio阴极光电化学生物传感器的制备方法

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