胃癌诊断标志物及其应用

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种胃癌诊断标志物及其应用。

背景技术：

目前胃癌的诊断方法主要有x线、胃内窥镜、ct和实验室检查。其中，内镜(内窥镜)和病理检查是胃癌的金标准，但内镜检查术是一种侵入性检查，给患者带来不同程度的痛苦和心里压力，尤其是老年患者，更增加了检查的危险性；而病理检查具有侵袭性和不适性的缺陷，导致其在临床的广泛应用受到限制。且内镜和ct还存在检查费用高的缺陷，其检测结果分析需要有经验的医师诊断评价。

外泌体作为一种新的生物载体，负责在细胞间转运dna片段、rna、信使rna(mrna)、micrornas(mirnas)、长非编码rna(lncrnas)和蛋白质，它可以将致癌信号传递给细胞并调控各种细胞过程，如细胞分化、增殖、迁移、侵袭和凋亡，这些纳米载体在不同的体液(如血清、尿液和唾液)中均可检测到，具有提示生物体状态的可能。

而目前并没有公开关于外泌体作为标志物在胃癌中的应用。

技术实现要素：

基于此，有必要针对上述问题，提供一种胃癌诊断标志物，该标志物可作为胃癌诊断的生物标志物或作为预后指标使用。

一种胃癌诊断标志物，所述标志物为外泌体linc02465。

本发明通过实验证实，幽门螺杆菌感染胃癌患者和健康人(血清、血浆、尿液或唾液)中外泌体中蛋白linc02465表达水平方面存在明显差异，提示了linc02465能作为癌症的生物标志物，甚至作为预后指标。

在其中一个实施例中，所述胃癌由幽门螺旋杆菌感染导致。

本发明还公开了上述的胃癌诊断标志物在胃癌诊断和/或预后判断中的应用。

本发明还公开了上述的胃癌诊断标志物在开发和/或制备具有胃癌诊断和/或预后判断用途的产品中的应用。

可以理解的，上述产品可以是试剂盒，也可以是一体化检测设备。

本发明还公开了一种检测生物样本中上述的胃癌诊断标志物的试剂在制备胃癌诊断试剂和/或预后诊断设备中的应用。

本发明还公开了一种用于胃癌诊断和/或预判判断的检测试剂盒，包括用于检测上述的胃癌诊断标志物的试剂。

可以理解的，上述试剂可以是针对生物样本中包含上述的胃癌诊断标志物检测所设计的特异性试剂，也可以是能够实现检测生物样本中上述胃癌诊断标志物的常规试剂和/或上述特异性试剂的组合。

在其中一个实施例中，所述检测试剂盒采用qrt-pcr检测linc02465rna因表达量，包括以下检测引物对：

f：ggtgctgctggttactcttggttc(seqidno.1)

r：gcggagaatgtggggtgacttc(seqidno.2)。

本发明还公开了一种用于胃癌诊断的系统，包括：

样品处理装置：用于提取待测生物样本中外泌体，检测其中linc02465rna因表达量；

分析装置：用于获取待测生物样本中所述linc02465rna表达量，与预设标准进行比较，如待测生物样本中linc02465rna因表达量高于预设标准，则评估为胃癌高风险，如待测生物样本中linc02465rna因表达量低于预设标准，则评估为胃癌低风险；

输出装置：用于将上述评估结果输出。

在其中一个实施例中，所述待测生物样本为血清，按照以下方法检测其中linc02465rna因表达量：

提取外泌体：取血清，以300±50g离心10±2min，再2000±500g离心20±5min，再10000±2000g离心30±10min，随后取上清，0.22±2μm过滤，再以100000±20000g离心70±10min，弃上清，沉淀以pbs重悬后，再以100000±20000g离心70±10min，弃上清，沉淀以pbs重悬，即得外泌体；

基因检测：trizol法提取上述外泌体rna，反转录后以实时荧光定量pcr检测linc02465rna因表达量。

可以理解的，上述离心力的大小以g为单位，表示相对离心力，是指在离心场中，作用于对象的离心力相当于地球重力的倍数，其单位是重力加速度。

在其中一个实施例中，所述待测生物样本为组织，按照以下方法检测其中linc02465rna因表达量：

细胞培养：取胃部细胞，制成细胞悬液，加入带有血清的完全rpmi-1640细胞培养液中，进行细胞培养；待细胞生长至80％，吸出上清液，pbs洗涤后加入胰酶进行消化，之后加入完全培养液终止消化，反复吹打细胞，吸至离心管中，1000±200g离心15±5min，吸出上清，向沉淀中加入rpmi-1640培养液制成细胞悬液，再加入完全培养基，进行细胞培养；

提取外泌体：取上述细胞培养液，以300±50g离心10±2min，再2000±500g离心20±5min，再10000±2000g离心30±10min，随后取上清，0.22±2μm过滤，再以100000±20000g离心70±10min，弃上清，沉淀以pbs重悬后，再以100000±20000g离心70±10min，弃上清，沉淀以pbs重悬，即得外泌体；

基因检测：trizol法提取上述外泌体rna，反转录后以实时荧光定量pcr检测linc02465rna因表达量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种胃癌诊断标志物，以外泌体linc02465作为诊断标志物，利用外泌体linc02465在幽门螺杆菌感染胃癌患者和健康人(血清、血浆、尿液或唾液)生物样本中表达水平的差异，可作为胃癌中期诊断标志物。且血清/血浆等体液中外泌体蛋白的检测可以增加对肿瘤检测的敏感性和特异性，作为一种不受化疗影响的无细胞标志物具有额外的优势。

同时，上述样品采集，具有无创性、制备方法简单、成本较低的优势，适用于作为胃癌早期筛查手段广泛推广使用。

附图说明

图1为实施例1中外泌体鉴定图；

图2为实施例1中外泌体粒径鉴定图；

图3为实施例1中外泌体的westernblot示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例所用原料，如非特别说明，均为市售可得；以下实施例所用方法，如非特别说明，均为常规方法。

实验材料：

胃癌患者及健康人血清(来源：北华大学附属医院检验科，其中收集到胃癌患者血清样本286例，均为幽门螺旋杆菌携带者，健康人血清250例)，胃癌细胞sgc-7901(来源：北华大学基础医学院实验室)，rpmi-1640细胞培养液，胎牛血清(hyclone)，胰酶(hyclone)，bca试剂盒(碧云天)，ripa裂解液(碧云天)，6孔板，24孔板。引物(上海生工技术有限公司)，sybr(takara)，trizol试剂(takara)，总rna反转录试剂盒(takara)。

实验仪器：

洁净工作台，冰箱，低速台式离心机，超高速离心机(26616thermofisher)，台式高速微量离心机，二氧化碳培养箱，荧光显微镜，倒置荧光显微镜，纳米粒度分析仪(nanotracwaveii美国microtrac)。

实施例1

比较患者及健康人血清外泌体linc02465基因差异。

1、提取外泌体。

以超速离心法提取血清外泌体具体操作步骤：

取血清，依次300g离心10min，2000g离心20min，10000g离心30min，取上清，用0.22μm滤菌器滤到超离管，pbs补齐液量，100000g离心70min，弃上清，1毫升(或200μl，根据沉淀量)pbs重悬，100000g离心70min，弃上清，50-100μl重悬(不要超过200μl)，即得外泌体。

2、外泌体鉴定。

2.1电镜鉴别。

取上述获得的外泌体，进行电镜鉴定，方法如下：取外泌体pbs悬液20μl于塑料薄膜上，铜网倒扣于悬液表面，室温放置10min后吸干液体，1％戊二醛固定，双蒸水洗涤铜网两次，充分干燥后，于－80kv透射电镜下进行观察。

鉴定结果如图1所示，图1为上述外泌体的电镜照片图，从图中可以看出，提取得到的纯化外泌体呈现典型的外泌体结构，为粒径为30～160nm的盘状囊泡样结构。

2.2粒径测量。

取上述获得的外泌体，测量其粒径，方法如下：

2.2.1用溶解外泌体的pbs将纳米粒度分仪调零；

2.2.2将提取好的外泌体稀释至200μl，涡旋振荡器震荡15min充分分散后加入纳米粒度分析仪样品室内；

2.2.3设置测量时间为90s，三次，通过数据图分析颗粒直径大小。

结果如图2所示，图2为上述外泌体的粒径分布图，从图中可以看出，外泌体粒径均在30nm至120nm之间。

2.3westernblot检测表面标志。

取上述获得的外泌体，以westernblot检测其表面标志，方法如下：

将外泌体蛋白样品经sds-page凝胶电泳、转膜、5％脱脂奶粉封闭，加入hsp70(1∶1000)单克隆抗体、tsg101(1∶1000)单克隆抗体，4℃过夜孵育，室温摇床孵育二抗60min。在膜上滴加适量ecl化学发光液，通过全能型化学发光成像系统进行分析。

采用bca法测定ripa裂解液提取外泌体总蛋白浓度。具体方法为：取30μg蛋白与蛋白上清液均匀混合后，100℃煮沸5min，进行sds-page半干法进行转膜，将目的蛋白转印至pvdf膜上。用含5％脱脂奶粉的于摇床室温封闭2h，使用一抗稀释液(1∶1000)于4℃孵育pvdf膜过夜，tbst洗膜3次，10min/次。二抗37℃孵育1h，tbst洗膜3次。加入ecl化学发光液后，显影、曝光拍照。应用imagej软件对条带进行灰度值分析。分析结果表示，提取出的外泌体蛋白浓度检测，浓度约在1.0μg/ml。

图3为上述外泌体的westernblot示意图，westernblot成像后显示hsp70和tsg101均有条带出现，综上可以鉴定外泌体成功提取。

3.比较linc02465rna基因表达差异。

3.1特异性引物

设计针对linc02465rna基因的特异性引物，如下所示：

f：ggtgctgctggttactcttggttc(seqidno.1)；

r:gcggagaatgtggggtgacttc(seqidno.2)。

并同时采用以下引物对扩增内参gapdh基因：

f：5-tgagattggcatggcttt-3(seqidno.3)；

r：5-ccttcaccgttccagttt-3(seqidno.4)。

3.2trizol法提取血清外泌体rna

以trizol法，提取上述步骤1获得的血清外泌体rna，具体方法如下：

采用trizol试剂，每管中加1ml，混匀，1min后管中的液体变粘稠，将液体转移至1.5ml的无酶管中，向无酶管中加提前预冷氯仿0.2ml，上下轻摇混匀；混匀10s后，将无rna酶管放进4℃冰盒，静置2min，取出12000rpm4℃离心15min。取上清层的无色水相大约0.6ml移到新的无rna酶ep管中，加入提前预冷异丙醇0.5ml，摇匀后放回冰盒静置5min；将无rna酶管从冰盒取出，12000rpm4℃离心10min，离心后能看到管底的白色沉淀即为提取出的rna，吸出上液清，加1ml由depc水配制的75％乙醇1ml洗涤(需要提前遇冷，现用现配)7500rpm4℃离心5min；吸出上清液后将无rna酶ep管倒扣在吸水滤纸上，等待管壁上多余的乙醇挥发至干燥，向ep管中加入20μl的depc水，上下混匀。55-60℃水浴10分钟溶解总rna,测od值。

3.3linc02465rna基因逆转录

对上述rna进行逆转录，具体方法如下：

按照总rna反转录试剂盒(takara)操作，以一步法逆转录进行。

逆转录体系用量：

逆转录酶4微升

总rna1.5微升

rnase-freeddh2o14.5微升

42℃30min，随后95℃3min。

将反转录完成后产物cdna放回-20℃冰箱冷冻备用。

3.4实时荧光定量pcr检测linc02465rna因表达量

以3.1的引物对，检测linc02465rna因表达量，具体如下：

对上述得到的反转录产物进行扩增，扩增体系如下：

将上述体系置于无酶八联管中，瞬时离心确定无气泡后放入荧光定量pcr仪中。扩增条件如下：

预变性：95℃10min熔解曲线55℃30s

pcr：95℃15s95℃1min

(40cycle)55℃30s20℃10min

72℃30s。

3.5相对定量法计算linc02465rna基因表达差异

通过上述检测得到胃癌患者血清和正常人血清外泌体中linc02465基因mrna，计算linc02465rna基因在胃癌患者及健康人血清中的表达差异，结果如下所示。

表1.各组血清外泌体中linc02465基因mrna扩增结果分析

*代表所标注组与其他两组之间的△ct差异有统计学意义。

ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，ct值越小。该实验△ct代表血清外泌体中linc02465基因基因mrna扩增循环数与相应细胞内参gapdh扩增循环数的差值。

从上述结果中可以看出，采用方差分析分析胃癌血清和正常血清外泌体中linc02465基因mrna的△ct之间具有差异性，且组间的差异具有统计学意义，提示我们可将血清外泌体linc02465作为区分辨别胃癌的候选标志物。

实施例2

比较正常胃上皮细胞及胃癌sgc-7901细胞培养液上清中外泌体linc02465基因差异。

1、细胞培养。

1.2细胞复苏：

将冻存的正常胃上皮细胞(来源：北华大学药学院)和sgc-7901细胞从-80℃冰箱中取出，快速放入37.5℃温水中，细胞融化后快速将液体吸至离心管1000g转速离心5min后弃上清，再将沉淀用1ml的rpmi-1640培养液吹打混匀制成细胞悬液。

提前向培养瓶中加入4ml带有血清的完全rpmi-1640细胞培养液，50μl的青霉素和链霉素双抗，再将上述1ml细胞悬液均匀加入培养瓶中，轻轻分散细胞后放入37℃湿度饱和的细胞培养箱中培养，co2浓度为5％。

1.2细胞传代：

待细胞生长至80％，吸出上清液，pbs洗涤两次，向培养瓶中加入1ml胰酶，混匀后放回培养箱，消化1.5min。

加1ml完全培养液终止消化，反复吹打细胞，吸至15ml离心管中，离心1000g15min，吸出上清，向管底沉淀中加入1mlrpmi-1640培养液吹打混匀制成细胞悬液，最后向培养瓶中加入完全培养基4ml，将上述细胞悬液均匀地加入皿培养瓶中，轻轻混匀细胞，37℃湿度饱和的细胞培养箱中培养，co2浓度为5％。

(1)细胞总rna提取

①采用trizol试剂，每孔中加1ml裂解液，使细胞充分被裂解液裂解，将含有细胞的裂解液移入ep管内，室温静置5min；

②ep加入提前预冷0.2ml氯仿，充分振荡，室温静置5min；

③12000rmp4℃离心15min，取上层清亮的液体加入新ep管内，然后加入与上清液等体积的异丙醇，充分震荡，室温静置10min；

④12000rmp4℃离心10min，弃上清，向沉淀中加入80％预冷的乙醇1ml充分洗涤沉淀；

⑤12000rmp4℃离心5min，弃上清，将ep管放入超净台中，使沉淀物充分干燥；

⑥向ep管中加入7μldepc水，使rna充分溶解，-20℃保存。

(2)荧光定量pcr

①逆转录：按照takaraprimescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser逆转录试剂盒说明书进行操作(全程冰上进行)

表2.逆转录体系

反应条件：37℃15min，85℃5s，-20℃保存。

②荧光定量pcr检测linc02465基因的表达检测，每组设3个复孔。

表3.荧光定量pcr检测反应体系

反应条件：95℃15min，95℃10s，63℃10s，40cycles。

采用实施例1中针对linc02465rna基因的特异性引物以及gapdh基因作为扩增内参进行检测。

计算方法：以gapdh为内参，取三孔cq值平均值，通过计算方法分析各样本中目的基因mrna的相对含量。

表4.各组细胞上清液外泌体中linc02465基因mrna扩增结果分析

*代表所标注组与其他两组之间的△ct差异有统计学意义。

从上述结果中可以看出，采用方差分析分析胃癌细胞和正常细胞外泌体中linc02465基因mrna的δct之间具有差异性，且组间的差异具有统计学意义，同样提示我们可将外泌体linc02465作为区分辨别胃癌的候选标志物。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>北华大学

<120>胃癌诊断标志物及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggtgctgctggttactcttggttc24

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcggagaatgtggggtgacttc22

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgagattggcatggcttt18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccttcaccgttccagttt18