骨髓间充质干细胞联合单克隆抗体治疗癌症中的用途的制作方法

本发明涉及生物领域，更具体的，涉及骨髓间充质干细胞联合单克隆抗体治疗癌症中的用途。
背景技术：
：骨髓中含有一种非造血干细胞，随后这些细胞被命名为间充质干细胞。最初从骨髓中分离出来，而后在外周血、脐血、脐带结缔组织、脂肪组织等组织中皆可分离到，但骨髓仍然是其主要来源。骨髓间充质干细胞具有自我更新能力，其具有较强的端粒酶活性，可通过不对称分裂方式增殖，维持自身干细胞的数量。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在一定的体内外环境下可以分化为各种组织细胞，如成骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞、肝细胞和软骨细胞等。随着近几年对间充质干细胞的快速研究，骨髓间充质干细胞在其他组织与器官中也有广泛的应用。研究表明将人骨髓间充质干细胞注射到烧伤鼠模型皮肤上，结果发现伤口愈合速度明显加快，新生血管的数量和密度也明显增加，体质量和活动也恢复较快，并且没有发现肿瘤生长，这些结果表明了骨髓间充质干细胞移植能有效提高烧伤鼠模型的伤口愈合，使用骨髓间充质干细胞可能有助于未来烧伤患者的治疗。基于癌症的治疗难度，将骨髓间充质干细胞用于癌症的治疗也变得越来越受到关注。bmscs与肝癌细胞的增殖之间存在复杂的关系，它不仅会抑制肝癌细胞的增殖，亦可促进肝癌细胞的增殖。实验也表明hmscs条件培养液对h7402肝癌细胞的克隆形成和增殖具有抑制作用，并有多种基因的表达发生改变，如肝癌细胞中核转录调控因子p8、cdc42ep1、nf-kb2的表达发生了下调，另有9个mts成员同时发生上调，这些基因的表达改变可能参与了对上述肿瘤细胞的抑制。sun等的研究显示，通过直接与间接共培养的方法，bmscs上的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体均能够激活hepg2的dr5，从而促进hepg2细胞的凋亡。liu等即构建了以强力霉素为控制开关的重组腺病毒载体ad-tet-tre-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体感染bmscs，在体外与人肝癌细胞系smmc-7402共培养结果显示：改造后的bmscs上的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可以诱导肝癌细胞系smmc-7402的凋亡。bmscs除了可抑制肿瘤组织增殖生长外，还可以诱导肝癌组织的坏死。研究显示取12只8周龄balb／c小鼠，肝脏原位注射法建立小鼠h22原位肝癌移植模型，建模1周后随机分为mscs移植组和对照组，开腹直视下分别注射入肝癌组织和戚同一肝叶的正常组织内。观察到荷瘤小鼠mscs移植组平均生存期为25d(95％可信区间：22～28d，对照组平均生存期为21d(95％可信区间：20～23d)，但组间生存期差异无统计学意义。激光共聚焦显微镜观察到在肿瘤边缘和瘤体内可见cfse标记细胞有白蛋白表达；与对照组比较，mscs移植组肝癌组织内出现大片状坏死。肝癌易于转移，最早在肝内转移，易侵犯门静脉及其分支并形成癌栓，脱落后在肝内引起多发性转移，也可通过血行转移到肺、肾、骨等部位，通过淋巴转移至淋巴结。因此，如何降低肝癌细胞的转移潜能，对于延长肝癌患者的生存期有重要的作用。hmscs可进一步诱导肿瘤细胞的凋亡。肿瘤细胞的增殖能力下降可能引起肿瘤细胞的转移潜力下降。虽然目前将骨髓间充质干细胞用于肝癌的治疗已有研究，但是将干细胞与治疗抗体联用的技术还比较少，研究还需要进一步推行。技术实现要素：本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种改进的治疗肝癌的单克隆抗体及其治疗组合物。在一些实施方案中，抗肝癌的抗体包含以下（1）-（8）任一所述的重链可变区和轻链可变区序列：(1)与seqidno：1的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构区，和与seqidno：2的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构区；(2)与seqidno：3的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构区，和与seqidno:4的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构区；(3)与seqidno：5的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构区，和与seqidno:6的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构区；(4)与seqidno：7的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构区，和与seqidno：8的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构区；(5)与seqidno:9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构区，和与seqidno:10的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构区；(6)与seqidno:11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构区，和与seqidno:12的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构区；(7)与seqidno:13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构区，和与seqidno:14的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构区；(8)与seqidno:15的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构区，和与seqidno:16的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构区；在一些实施方案中，本文公开的抗体的重链或重链可变区、轻链或轻链可变区可以在上述所列举的各自对应的具体氨基酸序列的基础上取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且得到的变体仍保持结合cd40的活性。在某些实施方案中，本发明的抗体可以含有取代、缺失或添加并且保持活性不变。上述氨基酸取代、缺失或添加的数目为1-30个或1-30之间的任一数值，优选为1-20个，更优选为1-10个。在优选的实施方案中，序列变体与原氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在更优选的实施方案中，序列变体与原氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。在具体的实施方案中，所述氨基酸取代为保守性取代。在一些的实施方案中，本文公开的抗体为单克隆抗体。在具体的实施方案中，本文公开的抗体可以改造为人源化的抗体。人源化抗体使本来对非人类单克隆抗体或非人类衍生的单克隆抗体的免疫原性及过敏反应降至最低，因此可提高所施用抗体的效力与安全性。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分以高亲和性与肝癌细胞结合。在具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分以10-9至10-10m的kd特异性结合于肝癌细胞。在一些实施方案中，单克隆抗体可通过至少一种以下机制抑制或根除肿瘤：通过抑制癌细胞增殖来治疗肿瘤。在具体实施方案中，本文公开的抗体可以抑制鼠的皮下移植瘤的生长。在具体的实施方案中，上述抗体抑制肿瘤生长至少达60％，70％或80％。在一些实施方案中，在荷瘤个体接受本文公开的抗体处理后不就即可检测到抑制肿瘤生长的情形。在另一些实施方案中，在初次接受抗体处理后7天即可检测到抑制肿瘤生长的情形。本申请还提供了编码本文公开的抗体或其抗原结合部分的核苷酸分子、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、以及制备和纯化该抗体的方法。在一些实施方案中，编码所述抗体或其抗原结合部分的核苷酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。在一些实施方案中，本文公开的单克隆抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养宿主细胞，从而表达单克隆抗体；分离和纯化表达的单克隆抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质，例如在sds-page电泳上为单一条带。在一些实施方案中，可以利用亲和层析的方法对本文公开的抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变ph等方法洗脱结合在亲和柱上的抗体。在一些实施方案中，动物接种肝癌细胞后，可自动物体内得到抗体和/或产生抗体的细胞。产生抗体的永生化细胞系可由经免疫的动物体中分离出的细胞制备。免疫接种后，杀死动物，取淋巴结和/或脾脏b细胞进行永生化处理，经过致癌性化合物及诱变化合物处理，与永生化细胞(例如骨髓瘤细胞)融合，去除肿瘤抑制基因的活性。若使用骨髓瘤细胞进行融合时，该骨髓瘤细胞最好不分泌免疫球蛋白。优选实施方案中，初次筛选是利用酶联免疫分析法(elisa)进行。选取产生抗肝癌抗体的细胞例如杂交瘤进行克隆，再进一步筛选所需的特性，包括生长良好、抗体产量高、及具有所需抗体特性等。杂交瘤的筛选、克隆及扩增方法是本领域普通技术人员熟知的。在一些实施方案中，经免疫接种的动物为非人类动物，其中脾脏b细胞与来自与该非人类动物相同物种的骨髓瘤细胞系融合。在一些实施方案中，该经免疫接种的动物为balb/c小鼠且骨髓瘤细胞系为非分泌性小鼠骨髓瘤细胞sp2/0。本申请还提供了药物组合物，其包含本文公开的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。本文公开的上述抗肝癌抗体可以和药学上可接受的载体一起配制成药物制剂，从而更稳定地发挥疗效。在一些实施方案中，这些制剂可以保证本文公开的抗体在30℃下至少六个月保持稳定。本申请还提供了抗抗体与骨髓间充质干细胞一起在制备用于治疗肝癌的药物中的用途。本文公开的抗肝癌抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因个体的年龄和体重、疾病特性和严重性以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和综合情况，总给药量不能超过一定范围。抗体或其组合物的施用剂量和频率可根据对疾病进行预防或治疗而变化。在预防性应用中，向尚未处于疾病状态的患者施用含有本申请的抗体或其混合物的组合物以增强患者抵抗力，此量定义为“预防性有效剂量”。在此用途中，具体的剂量又视患者健康状况及全身免疫性而定。通常以相对不频繁的间隔施用相对较低剂量较长时间。在治疗性应用中，有时需要以相对较短间隔施用相对较高剂量直至疾病进展减缓或终止为止，且优选直至患者显示疾病症状部分或完全改善为止。此后，可向患者施用预防性方案。本领域普通技术人员可以容易地根据实际需要掌握具体的剂量和频率。有益效果本发明通过筛选获得了特异性针对肝癌的单克隆抗体，所述抗体具有较好的同时抑制肝癌细胞huh-7细胞和hepg2细胞增殖的效果，同时在小鼠模型试验中也证实了所述的单克隆抗体具有较好的抑制肿瘤在小鼠体内增殖的效果，并且这些抗体与骨髓间充质干细胞联合治疗肝癌产生了协同作用，具有较好的应用前景。附图说明图1单抗对肝癌huh-7细胞增殖的影响结果图图2单抗对肝癌hepg2细胞增殖的影响结果图图3单抗以及其余骨髓间充质干细胞的联合用药对肝癌小鼠模型的治疗结果图具体实施方式本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。上述公开内容总体上描述了本申请，以下实施例是对本申请作进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如参见sambrook，j.，fritsch，ef.andmaniais，t.(1989)molecularcloning：alaboratorymanual，2ndedition，coldspringharborlaboratorypress。本申请中的术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且具体地涵盖抗体(包括全长单克隆抗体)和抗体片段。抗体分子通过特异性结合位点结合抗原上的特异性抗原决定簇或表位。本申请中的术语“单克隆抗体”或“mab”或“mab”指基本上同源的抗体的群体，即除了可能少量存在的自然发生的突变之外，包含在氨基酸序列相同的群体中的抗体分子。与之相比，常规(多克隆)抗体制剂通常包括大量在它们的可变结构域，特别是它们的通常对不同表位具有特异性的互补决定区(cdr)中具有不同氨基酸序列的不同抗体。除非另有说明，否则“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的抗原结合片段，即保留与全长抗体结合的抗原特异性结合的能力的抗体片段，例如，保留一个或多个cdr区的片段。抗原结合片段的实例包括，但不限于，fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如，单链fv(scfv)；纳米抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1肝癌特异性单克隆抗体的制备（1）液氮冻存的肝癌huh-7细胞和hepg2细胞于30℃水浴中融化，分别移人离心管中加入10ml无血清rpmi1640培养基，1000r／min离心6min，弃上清。将细胞沉淀用rpmi1640完全培养基吹打后分别移至细胞培养瓶内，分别补齐培养基至8ml左右，37℃、5％co2培养箱中培养2d，分别收集细胞备用。肝癌细胞特异性单克隆抗体的制备方法如下：动物免疫：选择10周龄雌性balb/c小鼠。(1)初次免疫：150μg抗原(肝癌huh-7细胞：hepg2细胞=1:1)和弗氏完全佐剂按体积比1:1比例乳化后皮下多点注射；(2)二次免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量加弗氏不完全佐剂按体积比1:1比例乳化后皮下多点注射；(3)三次免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量加弗氏不完全佐剂皮下多点注射；(5)加强免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量不加佐剂腹腔注射；(6)3天后取脾脏融合。细胞融合：(1)取对数生长的骨髓瘤细胞sp2/0，用rpmi1640基础培养基使用前加入青霉素与链霉素，每100ml培养基加入1ml含100u青霉素与链霉素双抗洗涤，吹悬后计数；(2)取小鼠脾脏，用rpmi1640基础培养基洗涤、碾磨，制备单个脾细胞悬液，计数；(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按个数比1：15的比例混合在一起，1000rpm离心10min；(4)弃上清，用滴管吸尽残余液体，在37℃水浴条件下2min内加入1ml的分子量为2000的聚乙二醇(peg-2000)，静置120秒，5min内加入15mlrpmi1640基础培养基终止反应；(5)1000rpm离心10min，弃上清，用100ml10％(v/v)胎牛血清hat-rpmi1640轻轻混悬；滴加于预先铺有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔；37℃，5％(v/v)co2培养箱内培养。融合细胞的筛选与克隆化：(1)于细胞融合后第六天取细胞培养上清，用分别包被有100ng/孔灭活的免疫的二种肝癌细胞的elisa板进行间接elisa检测，阳性孔经过荧光法挑选出能够同时对二种肝癌细胞均为阳性的阳性细胞团；(2)将筛选到的阳性孔杂交瘤细胞进行有限稀释法克隆化，经过三次亚克隆筛选得到稳定的8株杂交瘤细胞株，分别命名为2d3，3e2，4d3，4d6，5a3，5d7，6f4，6g5。8种单克隆抗体的大量制备：(1)取10周龄雌性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂；(2)1周后于小鼠腹腔分别接种5*105个8种杂交瘤细胞，细胞接种10天后可诱生腹水；待腹水尽可能多时抽取腹水；(3)间隔2天，待腹水再生积聚后，同法再抽，抽取后腹水3000rpm离心10min，取上清备用。抗体的纯化：抗体纯化经饱和硫酸铵法初纯腹水后，将其稀释后15000×g离心5min，以0.02mol/lph值7.0pb溶液重新溶解沉淀，利用pd-10脱盐柱进行缓冲液的置换后，过unospheresupratm柱。利用ngc蛋白纯化系统，以0.02mol/lph值7.0pb溶液a为平衡缓冲液，流速1.0ml/min平衡，上样流速为0.8ml/min。以溶液b(0.1mol/lph值3.0gly-hcl)为洗脱缓冲液，a液和b液混合线性梯度洗脱，流速1.0ml/min，1mmol/lph值9.0tris-hcl作为中和缓冲液，按60～200μl中和缓冲液/1ml蛋白收集液进行蛋白峰的收集。将收集的蛋白样品经peg20000浓缩后经pd-10脱盐柱进行缓冲液的置换后，过enrichtmsec650分子筛柱。以0.01mol/lph值7.4pbs溶液为缓冲液，流速为0.8ml/min，收集主蛋白峰，合并样品甘油透析浓缩后分装，-20℃保存。以分离胶浓度为12%的sdspage蛋白电泳，对蛋白纯度进行鉴定。间接elisa法检测小鼠腹水纯化抗体效价：以2μg/ml的huh-7癌细胞抗原以100μl/孔包被elisa酶标板，37℃孵育1h，4℃孵育过夜后，含0.05%tween-20的0.01mol/lph7.4值pbst溶液洗涤3次;用5%的脱脂奶粉37℃条件下封闭2h，弃去封闭液，pbst洗涤3次;2倍比稀释纯化后的抗体依次加入96孔酶标板中，37℃条件下作用1h后，以pbst溶液洗涤3次;加入带hrp标记的羊抗鼠igg(h+l)二抗(1∶5000稀释)，以pbst溶液洗涤3次;tmb显蓝色5min，2mh2so4终止反应，测定纯化后抗体在450nm波长下的吸光值。空白对照不加一抗二抗并设只加二抗对照，阴性对照为接种sp2/0细胞的blab/c小鼠腹水。结果如下表1所示。表1抗体的效价抗体名称抗体效价2d35.12×1063e22.56×1064d35.12×1064d65.12×1065a32.56×1065d75.12×1066f42.56×1066g55.12×106结果腹水效价大于106，具有较好的效果。同时，单抗腹水经纯化后，测定蛋白浓度均分别达到了1.50mg/ml。实施例2westernblot鉴定纯化后单抗的特异性将二种肝癌细胞分别裂解提取蛋白，以人表皮细胞和hela细胞裂解蛋白作为对照，经还原型sds-page电泳后，以120ma恒流电泳转膜30min，将蛋白条带转印至pvdf膜上，用5%的脱脂奶粉(tbst配置，现配现用)室温条件下封闭2h，弃去封闭液，tbst洗涤3次;纯化的8种单抗以5%的脱脂奶粉按1∶250稀释，4℃孵育过夜，tbst洗涤3次;加入带hrp标记的羊抗鼠igg(h+l)二抗(1∶5000稀释)，室温条件下摇床孵育1h，tbst洗涤3次;适量化学发光液孵育5min后，利用amershamimager600超灵敏多功能成像仪扫描成像。结果显示，以纯化后的8种腹水单抗均可特异性识别二种肝癌细胞的蛋白，不与人表皮细胞和hela细胞反应，这充分说明这8种单抗均具有相应的癌细胞特异性。实施例3通过spr进行单抗的亲和力测定抗体通过spr测定使用biacoretmt-200来表征它们的结合动力学。分析表面等离子体共振信号的变化以通过使用一对一langmuir结合模型计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以koff/kon的比率计算平衡解离常数(kd)。具体的单抗与肝癌huh-7细胞结合亲和力概况示于表2。表2.通过spr比较抗体结合亲和力抗体名称kd（nm）2d30.233e20.564d30.294d60.315a30.585d70.456f40.626g50.34从表2可以看出，所述八种单抗均具有较好的亲和力。实施例5抗体序列鉴定采用本领域熟知的单抗测序方法，所述抗体的可变区基因包括重链可变区基因和轻链可变区基因；具体的轻链可变区和重链可变区分别如下所述：（1）2d3单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区分别为:seqidno：1：重链可变区序列evklvesggglvkpggslklscaasgftfssaamrwvrqipekrlewvarieeggsayfpdsvlvrftisrdnarnicylqmnslrsddtamyycarsrespagyfklwgqgttltvssseqidno：2：轻链可变区序列divltqspaslavslgqratisccasesvhpygtslamwyqqkpgqppklliyassrvepgvparfsgsgsgtdfslnihpveeddiamyfcsssgqvparfgagtklelk（2）3e2单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区分别为:seqidno：3：重链可变区序列evklvesggglvkpggslklscaasgftfsnsamrwvrqipekrlewvaviraggslyfpdrvksrftisrdnarnicylqmnslrsddtamyycargreadggyfdywgqgttltvssseqidno：4：轻链可变区序列divltqspaslavslgqratiscaaserreyygtslaswyqqkpgqppklliyarsnveygvparfsgsgsgtdfslnihpveeddiamyfcgssmkrplrfgagtklelk（3）4d3单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区分别为:seqidno：5：重链可变区序列evklvesggglvkpggslklscaasgftfsasaqswvrqipekrlewvalqsrsgslyfpasvkqrftisrdnarnicylqmnslrsddtamyycarsreasggyidewgqgttltvssseqidno：6：轻链可变区序列divltqspaslavslgqratiscsasesggyygtslmnwyqqkpgqppklliystsneekgvparfsgsgsgtdfslnihpveeddiamyfcgqsmkrplrfgagtklelk（4）4d6单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区分别为:seqidno：7：重链可变区序列evklvesggglvkpggslklscaasgftfsqyrmgwvrqipekrlewvaeissasslyfpdsvksrftisrdnarnicylqmnslrsddtamyycarareadnvyfdawgqgttltvssseqidno：8：轻链可变区序列divltqspaslavslgqratiscsqsesgtyygtslamwyqqkpgqppklliyaasnvesgvparfsgsgsgtdfslnihpveeddiamyfctasmkaplrfgagtklelk（5）5a3单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区分别为:seqidno：9：重链可变区序列evklvesggglvkpggslklscaasgftfsryamswvrqipekrlewvaaissggslyfpdsvkgrftisrdnarnicylqmnslrsddtamyycargreadggyfdywgqgttltvssseqidno：10：轻链可变区序列divltqspaslavslgqratiscsasescyyygtslaqwyqqkpgqppklliyklsnvrggvparfsgsgsgtdfslnihpveeddiamyfcrqpmkvplkfgagtklelk（6）5d7单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区分别为:seqidno：11：重链可变区序列evklvesggglvkpggslklscaasgftfsdaamrwvrqipekrlewvasisslislyfpdsvesrftisrdnarnicylqmnslrsddtamyycargaeasggyfdqwgqgttltvssseqidno：12：轻链可变区序列divltqspaslavslgqratiscsasehpeyygtslmawyqqkpgqppklliyassnvetgvparfsgsgsgtdfslnihpveeddiamyfcqvsmkrpldfgagtklelk（7）6f4单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区分别为:seqidno：13：重链可变区序列evklvesggglvkpggslklscaasgftfsqyaslwvrqipekrlewvaaisgqgslyfpdsvctrftisrdnarnicylqmnslrsddtamyycargaaadggyfdtwgqgttltvssseqidno：14：轻链可变区序列divltqspaslavslgqratiscsasesvefsgtsltrwyqqkpgqppklliyasqnveggvparfsgsgsgtdfslnihpveeddiamyfccysmkvpprfgagtklelk（8）6g5单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区分别为:seqidno：15：重链可变区序列evklvesggglvkpggslklscaasgftfsayamtwvrqipekrlewvaaisptgslyfpgsvsgrftisrdnarnicylqmnslrsddtamyycargveadsqyfdkwgqgttltvssseqidno：16：轻链可变区序列divltqspaslavslgqratisccasgsvenygtsldiwyqqkpgqppklliyarsnvcrgvparfsgsgsgtdfslnihpveeddiamyfcqksmkqpsnfgagtklelk实施例6单抗对肝癌huh-7细胞增殖的影响细胞培养与实验分组huh-7细胞在含10％胎牛血清，60u／ml青霉素，100u／ml链霉素的dmem完全培养基，37摄氏度含5％co2的培养箱中培养，取生长良好的对数期细胞进行实验。实验分成无抗体对照组（pbs）和8组抗体组(10μg/ml)；阳性对照阿霉素组(10μg/ml)，共l0组。mtt法检测抗体及对肝癌细胞增殖的影响。取对数生长期细胞，以每孔5×103个接种于96孔板，37摄氏度5％co2培养12h后，加入药物。每个剂量设6个复孔。培养24h后每孔加人mtt20μl，继续培养4h。终止培养，弃上清液，每孔加入dmso150μl，振荡10min使结晶物溶解，全波长酶标仪测定a570和a630，计算细胞抑制率。抑制率(％)=(对照组(a570-a630)-实验组(a570-a630))／对照组(a570-a630)×100%。结果如图1所示。从图1可以看出，单独加入抗体以及阿霉素对huh7细胞增殖均具有较好的抑制作用。作用24h后，2d3对huh7细胞增殖的抑制率最大达(68.0±1.0)％，8种单抗的抑制效果均比阿霉素的(48.6±2.9)％抑制效果要好。实施例7单抗对肝癌hepg2细胞增殖的影响细胞培养与实验分组hepg2细胞在含10％胎牛血清，60u／ml青霉素，100u／ml链霉素的dmem完全培养基，37摄氏度含5％co2的培养箱中培养，取生长良好的对数期细胞进行实验。实验分成无抗体对照组（pbs）和8组抗体组(10μg/ml)；阳性对照阿霉素组(10μg/ml)，共l0组。mtt法检测抗体及对肝癌细胞增殖的影响。取对数生长期细胞，以每孔5×103个接种于96孔板，37摄氏度5％co2培养12h后，加入药物。每个剂量设6个复孔。培养24h后每孔加人mtt20μl，继续培养4h。终止培养，弃上清液，每孔加入dmso150μl，振荡10min使结晶物溶解，全波长酶标仪测定a570和a630，计算细胞抑制率。抑制率(％)=(对照组(a570-a630)-实验组(a570-a630))／对照组(a570-a630)×100%。结果如图2所示。从图2可以看出，单独加入抗体以及阿霉素对huh7细胞增殖均具有较好的抑制作用。作用24h后，2d3对huh7细胞增殖的抑制率最大达(69.3±2.1)％，8种单抗的抑制效果均比阿霉素的(50.2±1.1)％抑制效果要好。实施例8骨髓间充质干细胞的分离及制备将采集到的抗凝骨髓.经低糖的dmem稀释后，等量分为两份，用percoll分离。percoll分离时，将比重为1.073g/ml的percoll先置于试管的底部，然后按照1∶1比例缓慢滴加稀释后的骨髓，900g离心30min。离心后，收获分离的单个核细胞，dmem洗两次，接种于24孔板内，浓度为2.0×105/cm2，各孔内加入10%新生牛血清的低糖dmem。48h后除去非贴壁细胞，更换新鲜的培养液，37℃、5%co2孵育，待细胞生长至瓶底90%融合时，0.05%胰蛋白酶消化，传代培养，备用。用0.05%胰蛋白酶消化收获细胞，用饱和浓度的标记抗体室温30min，pbs洗涤两次后与fitc标记的二抗避光作用15min。将洗涤后的细胞悬于pbs中，经流式细胞术分析，经流式细胞仪检测，mscs均一地表达cd13、cd29，hla-2，阳性率分别为99.96％，98.68％和94.59％；而cd34、cd45和hla-dr阴性，阳性率分别为5.01％，1.21％和3.03％。说明成功的分离得到了骨髓间充质干细胞。将所述的间充质干细胞富集后备用。实施例9单抗的小鼠模型试验动物实验：(1)裸鼠肝癌模型建立：对数生长期的肝癌细胞株hepg2，浓度6×107／ml，0.1ml裸鼠背部皮下注射，建立裸鼠皮下瘤模型，2周后当肿瘤直径超过5mm时为成瘤标准。(3)药物对裸鼠肝癌的治疗作用：磷酸盐缓冲液(pbs，空白对照组)、8种抗体组、8种抗体与干细胞联合治疗组、干细胞组和阿霉素阳性对照组，每组10只。干细胞组按照5*109个/kg/d体重的剂量皮下注射给药；抗体和干细胞联合治疗给药方式为按照抗体5mg/kg/d体重的剂量、干细胞按照1*109个/kg/d体重的剂量一起皮下注射给药；空白对照pbs给药；抗体组治疗给药方式为按照抗体5mg/kg/d体重的剂量给药。连续给药2周后，测量肿瘤体积，观察肿瘤抑制效果。结果如图3所示。从图3可以看出，对照组的肿瘤体积达到了（2500±50）mm3，采用本发明的8种抗体均能够有效的抑制肿瘤的生长，最小肿瘤体积只有2d3抗体的（350±10）mm3，而且与阿霉素对照相比，其抑制效果也较好。另外，通过单抗与干细胞联合使用后，可以发现最小肿瘤体积为2d3抗体联合干细胞后的肿瘤体积只有（175±20）mm3，比单独使用干细胞和抗体的效果要远远好，说明二者具有协同的治疗效果，具有较好的应用前景。应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。序列表<110>北京广未生物科技有限公司<120>骨髓间充质干细胞联合单克隆抗体治疗癌症中的用途<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>119<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gluvallysleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheserserala202530alametargtrpvalargglnileproglulysargleuglutrpval354045alaargileglugluglyglyseralatyrpheproaspservalleu505560valargphethrileserargaspasnalaargasnilecystyrleu65707580glnmetasnserleuargseraspaspthralamettyrtyrcysala859095argserarggluserproalaglytyrphelysleutrpglyglngly100105110thrthrleuthrvalserser115<210>2<211>111<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercyscysalasergluservalhisprotyr202530glythrserleualamettrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyralaserserargvalgluproglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythrasppheserleuasnilehis65707580provalglugluaspaspilealamettyrphecyssersersergly859095glnvalproalaargpheglyalaglythrlysleugluleulys100105110<210>3<211>119<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gluvallysleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheserasnser202530alametargtrpvalargglnileproglulysargleuglutrpval354045alavalileargalaglyglyserleutyrpheproaspargvallys505560serargphethrileserargaspasnalaargasnilecystyrleu65707580glnmetasnserleuargseraspaspthralamettyrtyrcysala859095argglyargglualaaspglyglytyrpheasptyrtrpglyglngly100105110thrthrleuthrvalserser115<210>4<211>111<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercysalaalasergluargargglutyrtyr202530glythrserleualasertrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyralaargserasnvalglutyrglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythrasppheserleuasnilehis65707580provalglugluaspaspilealamettyrphecysglysersermet859095lysargproleuargpheglyalaglythrlysleugluleulys100105110<210>5<211>119<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gluvallysleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheseralaser202530alaglnsertrpvalargglnileproglulysargleuglutrpval354045alaleuglnserargserglyserleutyrpheproalaservallys505560glnargphethrileserargaspasnalaargasnilecystyrleu65707580glnmetasnserleuargseraspaspthralamettyrtyrcysala859095argserargglualaserglyglytyrileaspglutrpglyglngly100105110thrthrleuthrvalserser115<210>6<211>111<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercysseralasergluserglyglytyrtyr202530glythrserleumetasntrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyrserthrserasngluglulysglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythrasppheserleuasnilehis65707580provalglugluaspaspilealamettyrphecysglyglnsermet859095lysargproleuargpheglyalaglythrlysleugluleulys100105110<210>7<211>119<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gluvallysleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheserglntyr202530argmetglytrpvalargglnileproglulysargleuglutrpval354045alagluileserseralaserserleutyrpheproaspservallys505560serargphethrileserargaspasnalaargasnilecystyrleu65707580glnmetasnserleuargseraspaspthralamettyrtyrcysala859095argalaargglualaaspasnvaltyrpheaspalatrpglyglngly100105110thrthrleuthrvalserser115<210>8<211>111<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercysserglnsergluserglythrtyrtyr202530glythrserleualamettrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyralaalaserasnvalgluserglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythrasppheserleuasnilehis65707580provalglugluaspaspilealamettyrphecysthralasermet859095lysalaproleuargpheglyalaglythrlysleugluleulys100105110<210>9<211>119<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gluvallysleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheserargtyr202530alametsertrpvalargglnileproglulysargleuglutrpval354045alaalaileserserglyglyserleutyrpheproaspservallys505560glyargphethrileserargaspasnalaargasnilecystyrleu65707580glnmetasnserleuargseraspaspthralamettyrtyrcysala859095argglyargglualaaspglyglytyrpheasptyrtrpglyglngly100105110thrthrleuthrvalserser115<210>10<211>111<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>10aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercysseralaserglusercystyrtyrtyr202530glythrserleualaglntrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyrlysleuserasnvalargglyglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythrasppheserleuasnilehis65707580provalglugluaspaspilealamettyrphecysargglnpromet859095lysvalproleulyspheglyalaglythrlysleugluleulys100105110<210>11<211>119<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gluvallysleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheseraspala202530alametargtrpvalargglnileproglulysargleuglutrpval354045alaserileserserleuileserleutyrpheproaspservalglu505560serargphethrileserargaspasnalaargasnilecystyrleu65707580glnmetasnserleuargseraspaspthralamettyrtyrcysala859095argglyalaglualaserglyglytyrpheaspglntrpglyglngly100105110thrthrleuthrvalserser115<210>12<211>111<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>12aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercysseralasergluhisproglutyrtyr202530glythrserleumetalatrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyralaserserasnvalgluthrglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythrasppheserleuasnilehis65707580provalglugluaspaspilealamettyrphecysglnvalsermet859095lysargproleuasppheglyalaglythrlysleugluleulys100105110<210>13<211>119<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gluvallysleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheserglntyr202530alaserleutrpvalargglnileproglulysargleuglutrpval354045alaalaileserglyglnglyserleutyrpheproaspservalcys505560thrargphethrileserargaspasnalaargasnilecystyrleu65707580glnmetasnserleuargseraspaspthralamettyrtyrcysala859095argglyalaalaalaaspglyglytyrpheaspthrtrpglyglngly100105110thrthrleuthrvalserser115<210>14<211>111<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>14aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercysseralasergluservalglupheser202530glythrserleuthrargtrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyralaserglnasnvalgluglyglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythrasppheserleuasnilehis65707580provalglugluaspaspilealamettyrphecyscystyrsermet859095lysvalproproargpheglyalaglythrlysleugluleulys100105110<210>15<211>119<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>15gluvallysleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheseralatyr202530alametthrtrpvalargglnileproglulysargleuglutrpval354045alaalaileserprothrglyserleutyrpheproglyservalser505560glyargphethrileserargaspasnalaargasnilecystyrleu65707580glnmetasnserleuargseraspaspthralamettyrtyrcysala859095argglyvalglualaaspserglntyrpheasplystrpglyglngly100105110thrthrleuthrvalserser115<210>16<211>111<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>16aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercyscysalaserglyservalgluasntyr202530glythrserleuaspiletrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyralaargserasnvalcysargglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythrasppheserleuasnilehis65707580provalglugluaspaspilealamettyrphecysglnlyssermet859095lysglnproserasnpheglyalaglythrlysleugluleulys100105110当前第1页12