浓缩裂殖壶藻油脂中DHA的方法

本发明涉及一种脂肪酶水解浓缩裂殖壶藻油脂中dha的方法。

背景技术：

二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,dha)，是一种最常见的omega-3型多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids,pufas)，通常认为它对人的智力及视神经的发育起着至关重要的作用，而被广泛用于乳制品、营养保健品等领域，近年来我国dha的市场规模不断扩大，总市值已达到360亿元左右。目前dha主要来源是鱼类和微藻，鱼油中dha含量较低，仅为10％左右，而微藻脂质中dha含量因藻种和培养方式而异，最高约为40％。由于上述原料常含有色素及其它饱和脂肪酸等杂质，dha含量低且在脂质中存在形式呈现多样化，导致产品具有异味、易酸败等问题，而甘油三酯型产品更稳定、更易消化。由此看来，如果能够找到一种合适的技术对藻类油脂进行提纯除杂，获取高纯度、甘三酯型dha产品，则有望不仅可以提高产品品质，增加附加值，而且将极大地提高dha类产品的稳定性，延长货架期。

2010年利用裂殖壶菌生产dha藻油已经被卫生部批准为新资源食品。

传统的dha浓缩方法有尿素包合法、低温结晶法等。尿素包合法是尿素在体系中能包合短链饱和脂肪酸，而不能包合长链的不饱和脂肪酸，构象复杂的dha多被富集在溶液中。低温结晶法是低温条件下，由于脂肪酸分子量存在差异，因而结晶能力有所不同，分子量大、不饱和程度高的dha在溶剂中不易结晶，被富集在清液中。以上两种方法选择性较低，且需要大量使用有机溶剂，随着国家可持续发展战略的实施，需要开发环境友好型的工艺取代传统老旧工艺迫在眉睫。

近年来，随着国家可持续发展战略的实施，脂肪酶法由于条件温和、能耗低、环境友好等优点逐渐受到越来越多的关注。已有研究表明，部分脂肪酶对底物甘三酯甘油骨架上酯键的水解具有区域选择性，产自浅紫链霉菌的脂肪酶仅能水解鳕鱼肝油甘三酯甘油骨架sn-1,3位上的酯键，使得sn-2位上的脂肪酸被保留，dha能在单甘脂和甘二酯中被富集。另一类是脂肪酶对底物甘油三酯甘油骨架上相连的脂肪酸水解具有选择性，皱褶假丝酵母脂肪酶对骨架上短链脂肪酸(c18或以下)表现出特异性选择，会优先水解饱和和单不饱和脂肪酸，最后水解pufas，使得dha能在甘油酯中富集。由此可见，采用脂肪酶法富集浓缩dha主要是依赖于脂肪酶对底物水解的特异性选择，相比于其他传统富集方法更加温和、环保和高效。

裂殖壶藻油脂的来源是从裂殖壶藻发酵、分离制备得到，目前，针对裂殖壶藻油脂的dha浓缩工艺为低温结晶法和尿素包合法，该工艺存在的缺陷是选择性较低，均需要大量使用有机溶剂，对环境不友好。

本领域的技术人员希望找寻成本低廉，工艺快捷，选择性高的方法，提高富集dha的效果，形成一整套高效经济的dha浓缩工艺。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种选择性高、工艺便捷的浓缩裂殖壶藻油脂dha的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种浓缩裂殖壶藻油脂dha的方法，包括以下步骤：

1)、酶解反应：

在惰性气体(例如氮气)保护下，将裂殖壶藻油脂、0.1mol/lph7.0磷酸缓冲溶液、ao脂肪酶于35～45℃搅拌反应8～16小时；搅拌速率为140±20r/min；

ao脂肪酶的添加量为所述裂殖壶藻油脂质量的1.8～2.2％(优选2％)；裂殖壶藻油脂与磷酸缓冲溶液的料液比例为1g/(1±0.2)ml；

反应结束后，离心(加速分相)，收集上相清液；

2)、脂质的分离：

将上相清液通过制备级薄层层析法分离脂质，层析结束后分别收集各显色条带；各显色条带经二氯甲烷超声浸提、氮吹脱除溶剂(二氯甲烷)后获得含dha的单甘脂、含dha的甘油二酯和含dha的甘油三酯。

作为本发明的浓缩裂殖壶藻油脂dha的方法的改进：

ao脂肪酶的酶活力300,000u/g。

例如，可选用中国阿拉丁公司提供的产自米曲霉(aspergillusoryzae)的ao脂肪酶。

作为本发明的浓缩裂殖壶藻油脂dha的方法的进一步改进：

所述步骤1)中，反应时间到达后，将所得的反应液置于沸水浴10分钟，灭酶，从而结束反应，冷却至室温，在4℃、5000rpm的转速下离心10min(离心是为了加速分相)，收集上相清液。

作为本发明的浓缩裂殖壶藻油脂dha的方法的进一步改进：

步骤1)中，反应时间为12小时，反应温度(酶解温度)为40℃。

本发明的脂质分离，具体如下：

将60mg的上相清液溶于1.1±0.2ml二氯甲烷中，对20cm×10cm制备型薄层层析板进行点样，展开剂为正己烷-无水乙醚-冰乙酸(70:30:0.5,v/v)；从点样处从下往上共得到四条显色条带：单甘脂、甘油二酯、游离脂肪酸和甘油三酯。

将上述各脂质条(即，四条显色条带)分别各自进行如下操作：

刮取条带粉末，利用二氯甲烷进行超声浸提2～3次(每次浸提时，二氯甲烷的体积量是5ml、浸提时间为10分钟)，将所得的浸提液离心(4℃、5000rpm离心10min)，收集上清液；合并每次浸提所得的上清液，氮吹脱除溶剂(即，二氯甲烷)；从而分别得到对应的酯类。

本发明还包括如下的脂质的鉴定：

将所得的各类脂质(获得含dha的单甘脂、含dha的甘油二酯和含dha的甘油三酯)通过气相色谱鉴定其dha含量，将所得的含dha的甘油三酯通过核磁共振碳谱分析酶解产物中甘油三酯的甘油骨架上脂肪酸分布。通过上述内容能证明在反应过程中dha在甘油三酯骨架上的富集效应及其他脂肪酸在甘油三酯骨架上的含量随时间变化在减少的现象。

本发明中，通过对不同反应时刻的ao脂肪酶水解产物进行了脂质分离及组成实时分析，通过薄层层析法检测酶解反应过程中产物中的脂质组成变化，对酶解时间进行调节；采用气相色谱法进一步测定了酶解产物中甘油三酯脂肪酸含量及组成；为了更直观的观测到酶解时间对浓缩富集dha的影响，采用核磁共振碳谱分析随水解时间变化下甘油三酯的甘油骨架上dha含量变化。

本发明中，脂肪酶ao作为生物催化剂，价格低廉，提取工艺绿色环保，提取后的dha富集在甘油三酯的甘油骨架上，产物稳定。

在本发明的最佳酶解反应时间下，所得反应产物中甘油三酯型dha浓缩了1.58倍，回收率高达68.2％。超过最佳酶解反应时间，dha的浓缩和回收程度会下降。因此，控制ao脂肪酶催化藻油的反应时间，当反应达到平衡时，dha可以被富集在甘油三酯中。

本发明所得反应产物甘油三酯经气相色谱法分析后可知，甘油三酯除了含有目标物dha以外，还含有三种饱和脂肪酸和四种不饱和脂肪酸。随着酶解反应的进行，甘油三酯中dha含量显著升高，而饱和脂肪酸的含量则不断降低，其它不饱和脂肪酸含量则基本不变。反应至最佳反应时间时，产物甘油三酯中的dha含量达到最大值，此后甘油三酯上dha含量降低。

本发明的ao脂肪酶富集浓缩裂殖壶藻油脂中dha的方法，具有如下技术优势：

1)、操作条件温和、具有选择性、得到的产物甘油三酯型dha稳定；

2)、采用的脂肪酶价格低廉，工艺快捷；

3)、采用生物催化剂绿色环保、能效高。

4)、基于酶解反应的dha富集工艺简单，操作条件温和，不需要使用有机溶剂，绿色环保。

本发明的制备富含dha的甘油三酯的方法，选择性地使用ao脂肪酶水解裂殖壶藻油脂，并采用薄层层析法分离出富含dha的甘油三酯。该方法具有操作条件温和、选择性强、绿色环保、工艺快捷、价格低廉等优点，且一定程度的提高了dha富集的效率，有效的避免获取的dha不稳定。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为不同反应时间下酶解过程中产物甘油三酯各脂肪酸含量的变化；

1～9分别代表：1.十五烷酸2.棕榈酸3.十七烷酸4.亚油酸5.油酸6.α-亚麻酸7.二十碳五烯酸8.二十二碳五烯酸9.二十二碳六烯酸。

根据该图1，可获得以下总结性结论：在酶解过程中，大分子多不饱和脂肪酸dha不易被ao脂肪酸酶水解，更倾向于留在甘油三酯的甘油骨架上，而其他的小分子脂肪酸则更易被水解，从而造成了dha在产物甘油三酯中被富集。

图2为13c-nmr分析酶解产物中甘油三酯上甘油骨架上的脂肪酸分布。

图3为ao脂肪酶水解裂殖壶藻油脂不同反应时刻产物的脂质分离及组成分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，即，提供了一种制备富含dha的甘油三酯的方法，但本发明的保护范围并不仅限于此：

以下案例中，

ao脂肪酶的酶活力300,000u/g。例如，可选用中国阿拉丁公司提供的产自米曲霉(aspergillusoryzae)的ao脂肪酶。

固定化脂肪酶的酶活力11800u/g。例如，可选用北京高瑞森科技有限公司的novozym435型号/代号的固定化脂肪酶435。

裂殖壶藻油脂，购自中国湖北欣和生物科技有限公司；裂殖壶藻油脂中dha含量约为35.1％(w/w)。

实施例1、ao脂肪酶12h水解裂殖壶藻油脂，依次进行以下步骤：

步骤1)、将裂殖壶藻油脂、0.1mol/lph7.0磷酸缓冲溶液、ao脂肪酶加入到搅拌釜反应器中，各物质混合均匀后，充入氮气，封口后置于40℃、搅拌速率为140r/min，反应12小时；

ao脂肪酶的添加量为裂殖壶藻油脂质量的2％；裂殖壶藻油脂与磷酸缓冲溶液的料液比例为1g/1ml；

步骤2)、酶解时间到达后，将步骤1)所得的反应液置于沸水浴10分钟，灭酶，从而结束反应，然后冷却至室温，在4℃、5000rpm的转速下离心10min(加速分相)，收集上相清液；

步骤3)、脂质的分离：

将步骤2)中收集到的上相清液通过制备级薄层层析法分离脂质，层析结束后分别收集各显色条带。

具体如下：将60mg的上相清液溶于1.1ml二氯甲烷中，对20cm×10cm制备型薄层层析板进行点样，展开剂为正己烷-无水乙醚-冰乙酸(70:30:0.5,v/v)；从点样处从下往上共得到四条显色条带：单甘脂、甘油二酯、游离脂肪酸和甘油三酯。

将上述各脂质条(即，四条显色条带)分别进行如下操作：

刮取条带粉末，利用二氯甲烷进行超声浸提2～3次(每次浸提时，二氯甲烷的体积量是5ml、浸提时间为10分钟)，将所得的浸提液离心(4℃、5000rpm离心10min)，收集上清液；合并每次浸提所得的上清液，氮吹脱除溶剂(即，二氯甲烷)；从而分别得到对应的酯类。

具体如下：

从下端的点样点向上数：

第一条条带对应所得为含dha的单甘脂；

第二条条带对应所得为含dha的甘油二酯；

第四条条带对应所得为含dha的甘油三酯，

将上述得到的酯类分别进行称重。

说明：第三条条带对应所得为游离脂肪酸。

步骤4)：将步骤3)所得到的各类脂质(各酯类)通过气相色谱鉴定其dha含量，其中得到的甘油三酯(即，含dha的甘油三酯)通过核磁共振碳谱分析酶解产物中甘油三酯的甘油骨架上脂肪酸分布，所得结果如图2所述，根据图2可得知：甘油三酯上甘油骨架sn-1(3)位上饱和脂肪酸含量随着酶解反应的进行不断下降，dha含量则逐渐升高；而甘油骨架sn-2位上主要是dha，其含量在反应过程中保持不变；当反应12h后，虽然甘油骨架sn-1(3)位上饱和脂肪酸已完全水解，但sn-1(3)和sn-2位上的dha含量也开始下降，说明酶解反应时间过长也会导致甘油骨架上的dha缓慢水解。

反应12h后甘油三酯回收率：41.10％；甘油三酯中dha的含量：55.4％，与原油中dha含量相比，浓缩了1.58倍。

对比例1、将实施例1步骤1)的ao脂肪酶反应时间由12小时改为8小时，其余等同于实施例1。

所得结果为：反应8h后甘油三酯回收率：54.50％；甘油三酯中dha的含量：38.10％，与原油中dha含量相比，浓缩了1.09倍。

对比例2、将实施例1步骤1)的ao脂肪酶反应时间由12小时改为16小时，其余等同于实施例1。

所得结果为：反应16h后甘油三酯回收率：42.30％；甘油三酯中dha的含量：36.08％，与原油中dha含量相比，浓缩了1.03倍，与12h相比明显降低。

对比例3、将实施例1步骤1)的ao脂肪酶改为固定化脂肪酶435，反应时间仍为12h，其余等同于实施例1。

所得结果为：反应12h后甘油三酯回收率：51.82％；甘油三酯中dha的含量：43.37％，与原油中dha含量相比，浓缩了1.46倍。

综合上述数据可知，裂殖壶藻油脂经酶法水解和薄层层析处理后，可以有效的富集浓缩甘油三酯型dha的含量，将裂殖壶藻油脂中甘油三酯型dha的含量从35.31％富集提高到50％～55％，浓缩比例最高达1.58倍。

因此，可以看出，当采用本发明的方法，选择性地使用ao脂肪酶来水解裂殖壶藻油脂，在最适宜的反应时间、最适宜的反应温度内，可以显著地提高甘油三酯型dha的富集效果，并且同时还显著提高富含甘油酯型dha的产率。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。