一种铜绿假单胞菌及其应用

本发明涉及农业微生物技术领域，涉及一种铜绿假单胞菌及其应用。

背景技术：

烟草是一种经济植物，在我国的主要烟草种植地区，由于长期不合理的种植方式以及化学药剂的施用，使得烟草上的病害越来越严重，严重影响了烟叶的品质并且造成严重的经济损失，其防治面临着巨大的挑战。烟草黑胫病由烟草疫霉病原菌引起，是烟草种植过程中非常常见的一种病害，在我国的主要烟草种植地区均有发生，某些地区甚至出现了高抗性病株，已经成为威胁烟叶生产的主要病害，现阶段对于这种病害有效的防治措施还是以化学防治为主，而化学农药在防治植物病害时，由于长期积累会造成植物农药残留、产生抗药性以及病害猖獗等问题，并会导致烟叶的质量下降，从而影响烟农经济收入水平以及烟草业的可持续性发展。

近年来，为响应烟草绿色防控的号召，避免使用大量化学农药造成的“3r”问题，发挥持续防治、保护生态环境以及对人畜低毒安全等优势，生物防治方法在植物病害治理的舞台上扮演着愈来愈关键的角色，所以探索有效的生物防治途径已经成为当前的研究热点，对烟草种植具有举足轻重的意义。相应地，针对烟草黑胫病的微生物农药研发也成为近年来烟草黑胫病防治领域的一个主要方向，但目前主要从植物及根际土壤中筛选黑胫病的生防菌，但其它来源的生防菌涉及很少。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌及其应用，该菌可以明显的抑制烟草疫霉，将其活体或者代谢产物作为主要成分用于烟草疫霉的防控上，效果好且成本低。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa，其保藏编号为cgmccno.21856，保藏时间为2021年3月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明还提供了所述的铜绿假单胞菌在制备抑制烟草疫霉的生物制剂中的应用。

本发明还提供了所述的铜绿假单胞菌在抑制烟草疫霉病原菌生长中的应用。

本发明还提供了一种所述的铜绿假单胞菌的发酵液的制备方法，包括以下步骤：

将铜绿假单胞菌接种于lb液体培养基上，在28-32℃，转速180-220rpm震荡培养18-24h，制备种子液；将所述种子液以1％-3％接种量接种于ysp液体培养基，于35-40℃、220-250rpm、初始ph6-7条件下震荡培养48-60h，获取铜绿假单胞菌发酵液。

进一步地，所述lb培养基包括以下组分：蛋白胨1.00g，酵母浸粉0.50g，氯化钠1.00g，蒸馏水100ml。

所述ysp培养基包括以下组分：蛋白胨1.00g，酵母浸粉0.50g，蔗糖2.00g，蒸馏水100ml。

本发明还提供了由所述的制备方法获取的铜绿假单胞菌发酵液。

本发明还提供了所述的发酵液在制备抑制烟草疫霉的生物制剂中的应用。

本发明还提供了所述的发酵液在抑制烟草疫霉病原菌生长中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明从鳞翅目昆虫幼虫消化道中分离得到了一种铜绿假单胞菌，以该铜绿假单胞菌活体或者其代谢产物为主要活性成分制备生物制剂，应用于烟草疫霉的防控，其抑制率达77.1％；同时，通过室内烟草黑胫病防治试验发现，该铜绿假单胞菌可以明显减轻烟草黑胫病的病情指数，具有明显的防治效果。因此，本发明提供的铜绿假单胞菌可以成为替代化学药物的潜在生防菌，以为烟草疫霉和黑胫病的防控提供新的生防菌和防治方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同培养基对铜绿假单胞菌hz15生长的影响；

图2为不同碳源对铜绿假单胞菌hz15生长速度的影响；

图3为不同氮源对铜绿假单胞菌hz15生长的影响；

图4为接菌量对铜绿假单胞菌hz15生长的影响；

图5为通气量对铜绿假单胞菌hz15生长速度的影响；

图6为ph对铜绿假单胞菌hz15生长速度的影响；

图7为转速对铜绿假单胞菌hz15生长速度的影响；

图8为温度对铜绿假单胞菌hz15生长的影响；

图9为培养时间对铜绿假单胞菌hz15生长的影响；

图10为光照时间对铜绿假单胞菌hz15生长的影响；

图11为根据铜绿假单胞菌hz1516srrna鉴定结果构建的菌株进化树；

图12为铜绿假单胞菌hz15对烟草疫霉的平板对峙结果；其中，a.对照；b.平板对峙。

具体实施方式

现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1铜绿假单胞菌hz15的分离筛选

一、分离筛选

某鳞翅目昆虫幼虫是云南农业大学植物保护学院在云南省普洱市思茅区南屏镇“云南省小粒咖啡良种苗木繁育基地”采集得到。采用如下方法步骤获菌株：

1、将幼虫体表以75％酒精漂洗3次，每次2分钟，再用无菌水漂洗3次后解剖，获得完整的幼虫消化道。

2、灭菌：所用培养皿、离心管、试管，枪头等实验器材及无菌水均采用高压灭菌，0.1mpa，121℃，灭菌30分钟。

3、研磨：将所得幼虫消化道剪碎后，放入无菌离心管中，加入1ml无菌水，用研磨棒充分研磨。

4、梯度稀释：取研磨后的汁液1ml，放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10^-1稀释度的菌液，再从10^-1稀释度的菌液中取1ml放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10^-2稀释度的菌液，以此类推制成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释度的菌液。

5、分离培养基为牛肉膏蛋白胨培养基(na培养基)：

na培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂18g，水1000ml，ph7.0-7.2，121℃灭菌20min。

纯化培养基为lb培养基：

lb培养基：蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；琼脂15g；蒸馏水1l；ph7.0，121℃灭菌20min。

倒平板，每个培养皿倒大约15ml的培养基，平放静置，待冷却备用。

6、涂布：将稀释菌液10^-4、10^-5、10^-6、10^-7分别涂布于平板上，每个梯度涂3皿，并在皿底做上标记。

7、培养：倒置平皿于28℃培养箱中培养3-5天。

8、菌的纯化：在无菌条件下用挑针将na培养基上长出的单菌落挑取于lb培养基上划线培养；纯化3-4次可得纯化后的单菌落，命名为hz15。

二、菌种鉴定

1、培养特征

lb培养基纯化后的菌落为菌落直径1-7mm，不规则，由黄褐色渐变为褐绿色，扁平，产色素，表面光滑湿润。菌体椭球形，0.56-1.27μm，无芽孢。

2、生理生化指标测定

采用常规试验方法，进行革兰氏染色反应、淀粉水解实验、油脂水解实验、石蕊牛奶实验、明胶实验、尿素实验、葡萄糖氧化发酵实验、吲哚实验、柠檬酸盐实验、甲基红染色实验、硫化氢实验，以测定相关的生理生化指标。

结果显示：革兰氏阴性菌，淀粉水解实验阴性，油脂水解实验阳性，石蕊牛奶实验阳性，明胶液化阳性，尿素实验阴性；发酵葡萄糖阳性，吲哚实验阳性，柠檬酸盐实验阳性，甲基红阳性，硫化氢实验阴性。

3、16srrna鉴定

通过16srrna基因对比分析，并构建菌株进化树(见图11)，确定本发明菌株hz15为铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa。

实施例2铜绿假单胞菌的发酵培养条件的筛选

将铜绿假单胞菌hz15菌液接种于ysp培养基上，在温度36℃、ph值为7、转速220r/min、装液量40ml、接种量2.5％、时间48h、光照12h的条件下培养，获得铜绿假单胞菌hz15发酵液，用于以下发酵培养条件的优化。

1、培养基优选

采用ysp、nybd、na、lb和cm五种培养基对菌株进行培养。

蛋白胨酵母蔗糖培养基(ysp)，包括以下组分：蛋白胨1.00g，酵母浸粉0.50g，蔗糖2.00g，蒸馏水100ml；

牛肉膏酵母葡萄糖培养基(nybd)，包括以下组分：牛肉浸膏0.80g，酵母浸粉0.50g，葡萄糖1.00g，蒸馏水100ml；

营养琼脂培养基(na)，包括以下组分：牛肉膏0.30g，蛋白胨1.00g，氯化钠0.50g，蒸馏水100ml；

细菌基础培养基(lb)，包括以下组分：蛋白胨1.00g，酵母浸粉0.50g，氯化钠1.00g，蒸馏水100ml；

完全培养基(cm)，包括以下组分：葡萄糖0.50g，硫酸铵0.20g，柠檬酸钠0.10g，七水合硫酸镁0.02g，磷酸氢二钾0.40g，磷酸二氢钾0.60g，蒸馏水100ml。

如图1可知，铜绿假单胞菌hz15在ysp培养基上生长速度最快，od值为2.70，其次是lb培养基，od值为2.69。

2、不同碳源对菌株生长速度的影响

以ysp培养基为基础培养基，固定氮源种类，采用麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉等五种碳源对菌株进行培养，观察菌株生长状况。

如图2可知，铜绿假单胞菌hz15的最适碳源为蔗糖，菌液od值2.55。

3、不同氮源对菌株生长的影响

以ysp培养基为基础培养基，固定蔗糖为碳源，采用氯化铵、谷氨酸、硝酸铵、酪氨酸、蛋白胨五种氮源对菌株进行培养，观察菌株生长状况。

如图3可知，铜绿假单胞菌hz15在蛋白胨上的生长速度最快。

4、接种量对菌株生长的影响

在上述优化培养基的基础上，分别采用0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、2.5％的接菌量进行接菌，观察菌株生长状况。

如图4可知，接菌量为2.5％时，hz15细菌的生长速度最快。

5、装液量对菌株生长速度的影响

在上述优化培养基的基础上，菌株培养装液量设置了5个处理，分别为20ml、40ml、80ml、120ml、160ml，观察菌株生长状况。

如图5可知，铜绿假单胞菌hz15最适装液量为20ml。

6、ph对菌株生长速度的影响

在上述优化培养基的基础上，菌株培养初始ph设置7个处理，分别为ph4、ph5、ph6、ph7、ph8、ph9、ph10，观察菌株生长状况。

如图6可知，铜绿假单胞菌hz15最适生长ph值是7。

7、转速对菌株生长速度的影响

在上述优化培养基的基础上，菌株培养转速设置了5个处理，分别为140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min、240r/min，观察菌株生长状况。

如图7可知，铜绿假单胞菌hz15在转速为240r/min时，细菌生长速度最快。

8、温度对菌株生长的影响

在上述优化培养基的基础上，菌株培养温度设置5个处理，分别为20℃、24℃、28℃、32℃、36℃、40℃，观察菌株生长状况。

如图8可知，铜绿假单胞菌hz15在最适生长温度36℃。

9、时间对菌株生长的影响

在上述优化培养基的基础上，菌株培养时间设置如下处理：2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h和144h，观察菌株生长状况。

如图9所示，随着培养时间增加，铜绿假单胞菌hz15生长量增大，在48h时生长速度达到最大值；继续延长培养时间摇床培养，细菌生长速度开始减慢，od值下降。

10、光照时间对菌株生长的影响

在上述优化培养基的基础上，菌株培养光照时间设置为每天光照0h、4h、8h、12h、16h、20h以及24h，观察菌株生长状况。

如图10所示，铜绿假单胞菌hz15光照培养12h/d，细菌生长速度最快，生长量最多。

根据以上试验结果得出，本发明分离的铜绿假单胞菌hz15最优的发酵培养基为ysp培养基，其包括以下组分：蛋白胨1.00g，酵母浸粉0.50g，蔗糖2.00g，蒸馏水100ml。

最优的发酵培养条件为：以20ml/250ml的装液量装入灭菌ysp培养基，并将种子液按照接菌量2.5％进行接种，然后在36℃、240r/min、ph7、12h/d光照培养条件下，发酵培养48h，获取铜绿假单胞菌发酵液。

实施例3铜绿假单胞菌hz15发酵液对烟草疫霉病原菌的抑制作用

采用平板对峙法，用无菌打孔器(5mm)在病原菌平板上打孔，将菌块接入新配制的oa平板中央，再用无菌接菌环挑取拮抗菌分别在距oa平板中央2.5cm的四周等距接种拮抗菌4次，设置3个重复，28℃培养5d后测量处理平板菌落直径，取平均值计算其抑菌率，测定其抑制作用。以不接种拮抗菌作为对照。

如图12所示结果显示：处理平板菌落直径约为2.01cm，铜绿假单胞菌hz15对烟草疫霉phytophthoranicotianae的抑制率约为77.1％。

实施例4铜绿假单胞菌hz15发酵液对烟草疫霉室内防治效果的测定

以拮抗细菌处理土壤后，移栽烟草苗人工接种寄生疫霉烟草致病型病原体，以土壤不做任何处理的盆栽苗为空白对照，以杀菌剂处理的为阳性对照。按照烟草黑胫病分级标准调查病株数和发病级数，计算发病率、病情指数及防治效果。设置3个重复，每处理10盆烟苗。

病害分级标准：调查发病分级标准参考《中华人民共和国国家标准农药田间药效实验准则(二)gb/t23222－2008》。

0级全株无病；

1级茎部病斑不超过茎围的1/3，或1/3以下叶片凋萎；

3级茎部病斑环绕茎围1/3～1/2，或1/3～1/2叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑；

5级茎部病斑超过茎围的1/2，但未全部环绕茎围，或1/2～2/3叶片凋萎；

7级茎部病斑全部环绕茎围，或2/3以上叶片凋萎；

9级病株基本枯死。

相关计算公式如下：

表2铜绿假单胞菌hz15对黑胫病的防治效果

结果如表2所示，铜绿假单胞菌hz15能够明显的防治黑胫病，降低病害发生。与空白对照相比，本发明提供的铜绿假单胞菌hz15对黑胫病的生防效果比化学药物杀毒矾更优，因此，本发明提供的铜绿假单胞菌hz15可以成为替换化学药物进一步开发生物制剂的生防菌。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。