一种工程化核糖激酶、其编码基因、表达载体、工程菌及其应用的制作方法

1.本发明属于生物制药与生物转化领域，具体涉及一种工程化核糖激酶及其应用。


背景技术：

2.烟酰胺单核苷酸(nmn)参与人体细胞内重要辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的合成，在细胞能量生成中扮演重要角色。近年来，nmn因其在抗衰老及年龄相关退行性病变方面的应用受到广泛关注，其制备方法也成为各大医药公司的研究热点。从催化剂的角度，nmn的合成主要分为化学催化和生物催化，其中生物催化具有绿色环保、高效、副产物少等特点占据优势地位。
3.多家公司也报道了生物催化合成nmn的方法。例如，尚科生物(cn108949865a)公开了一种固定化细胞催化5
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磷酸核糖和烟酰胺反应生成nmn的方法，固定化细胞可重复利用，反应浓度可达到13.3g/l，但是，5
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磷酸核糖价格较高。邦泰生物(us2018162895a1)公开了一种核糖激酶、焦磷酸合成酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶三酶串联一锅法合成nmn，并对其中的烟酰胺磷酸核糖转移酶进行分子改造，得到了较好的反应收率，而对该串联反应第一步(核糖激酶催化生成5
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磷酸核糖)没有进一步的研究。
4.因此，无论是分步法还是一锅法，对于改进核糖激酶催化活性的研究具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种经过分子改造的工程化核苷激酶(rbk)，还提供了工程化核糖激酶的基因，含有该基因的表达载体，工程菌株及其制备方法，以及使用该工程化核糖激酶制备5
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磷酸核糖的反应工艺。
6.一种工程化核糖激酶，所述工程化核糖激酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。本发明人的实验对象是一个来源于escherichia coli的野生型核糖激酶，其氨基酸序列如序列1所示。但野生型的催化活性并不理想。发明人通过定向进化技术对该核糖激酶进行改造，得到一种工程化核糖激酶，意外地发现将42位的甘氨酸突变成苯丙氨酸后，突变株g42f具有更好的催化活性，其氨基酸序列如序列2所示。
7.本发明通过理性设计结合定向进化的方法对核糖激酶进行分子改造，改良后的酶在催化活性上得到提升。首先，本发明通过分析核糖激酶的晶体结构，在活性中心附近筛选出多个关键氨基酸，并通过引物设计和pcr扩增序列，分别将关键氨基酸突变成体积不同的丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸；接着，用基因工程技术将序列与pet28a质粒连接；最后转化构建工程菌，表达核糖激酶。
8.所述的工程化核糖激酶的制备方法，包括以下步骤：
9.a核糖激酶基因序列引物设计、pcr扩增；
10.b核糖激酶基因片段与克隆载体连接，得到携带核糖激酶基因的重组表达载体；
11.c重组表达载体转化到宿主细菌中，得到重组体细菌；
12.d重组体细菌培养、提取得到含有核糖激酶的粗酶液
13.本发明还是提供了一种编码基因，核苷酸序列与所述的工程化核糖激酶的氨基酸序列具有对应关系。
14.本发明还提供了一种重组表达载体，包含载体pet28a和所述的编码基因。
15.本发明还提供了一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因包含所述的(r,s)
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羰基还原酶的编码基因。
16.所述的表达载体适合在大肠杆菌中表达，因此，所述宿主细胞优选为大肠杆菌。
17.本发明还进一步提供了一种5
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磷酸核糖的制备方法，包括：
18.在所述的工程化核糖激酶的催化下，核糖和atp进行反应得到5
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磷酸核糖。其工艺路线如下：
[0019][0020]
作为优选，反应的温度为25～35℃，反应时间为10～15小时。
[0021]
作为优选，反应溶剂为乙腈。
[0022]
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0023]
本发明通过在野生型核糖激酶进行改造，经过大量的筛选，发现将42位的甘氨酸突变成苯丙氨酸后，突变株g42f具有更好的催化活性，提高催化反应的收率。
附图说明
[0024]
图1为本发明的质粒连接模式示意图。
具体实施方式
[0025]
下面结合具体实施例和附图进一步阐述本发明。以下实施例是对本发明的解释，但本发明并不局限于以下实施例。
[0026]
实施例1：基因克隆和表达载体的构建
[0027]
源自于escherichia coli的野生型核糖激酶的氨基酸序列，可从ncbi上检索得到，如序列1所示，然后通过本领域的常见技术合成出对应的核酸并克隆到表达载体pet28a上。将重组表达质粒转化到e.coil bl21(de3)的感受态细胞中，转化条件42℃，热击90秒，转化液涂布到含有氯霉素的lb平板上，37℃倒置培养过夜，即获得重组转化体。
[0028]
实施例2：核糖激酶的表达和酶液的制备
[0029]
取冻存的rk菌液5μl转入5ml(含50μl/ml硫酸卡那霉素)lb培养基中，过夜活化。
[0030]
活化后的菌液接入500ml lb培养基中，37℃条件下培养至od600约0.7左右，预冷至20℃。
[0031]
加入终浓度为0.2mm的iptg诱导剂，随后放入20℃摇床中培养20h。
[0032]
将培养好的菌液离心，并用ph 8.0，50mm tris
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his缓冲液(含100mm浓度的nacl)洗涤三次
[0033]
将洗涤好的菌用ph 8.0，50mm tris
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his缓冲液(含100mm浓度的nacl)重新悬浮，
超声裂解。取出裂解后的破碎菌液离心，取上清，用于后续反应。
[0034]
实施例3：核糖激酶突变文库的建立
[0035]
根据核糖激酶的晶体结构，选取活性中心周围的关键氨基酸(14，16，42，46，143，265，273)，分别突变成典型代表小
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中
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大体积的丙氨酸(a)、亮氨酸(l)、苯丙氨酸(f)。具体方法如下：
[0036]
pcr体系为：10xbuffer 5μl，2mm dntps5μl，质粒dna模板1μl(50ng/μl)，上下游引物各取2μl(10μm)，高保真酶0.5μl，dmso 1μl，ddh2o 34μl。pcr引物在突变位置的密码子如下：
[0037]
突变株引物序列n14actgggtagcgttgcggcagatcatgttcn14lctgggtagcgttctgtgcagatcatgttcn14fctgggtagcgtttttgcagatcatgttcd16agttaatgcagcgcatgttctgd16lgttaatgcactgcatgttctgd16fgttaatgcatttcatgttctgg42agttattccgggtgcgaaaggcgcaaatcg42lgttattccgggtctgaaaggcgcaaatcg42fgttattccgggttttaaaggcgcaaatck43aattccgggtggtgcgggcgcaaatcaggck43lattccgggtggtctgggcgcaaatcaggck43fattccgggtggttttggcgcaaatcaggce143actgatgcagctggcgaccccgctggatgge143lctgatgcagctgctgaccccgctggatgge143fctgatgcagctgtttaccccgctggatggd255actgcagccggtgcgacctttaatggtgd255lctgcagccggtctgacctttaatggtgd255fctgcagccggttttacctttaatggtgs273atgcctctggaagcggcaattaaatttgs273ltgcctctggaactggcaattaaatttgs273ftgcctctggaatttgcaattaaatttg
[0038]
pcr扩增步骤为：(1)94℃，预变性3min；(2)98℃，变性10s；(3)64℃退火30s；(4)68℃延伸4min；步骤(2)～(3)重复29次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。在pcr产物中加入2μldpni，37℃过夜酶切消除质粒模板。酶切后的pcr产物用电击法转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，涂布到含硫酸卡那霉素的lb平板上即得目标残基位置的饱和突变文库。
[0039]
实施例4：工程化核糖激酶催化生成5
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磷酸核糖
[0040]
反应条件：将含有5mg核糖的50μl乙腈加入1ml粗酶液中，30℃条件下反应12h。
[0041]
突变株产率(％)
a
wt71.6n14a10.0
n14l22.8n14f25.2d16a19.8d16l59.2d16f41.7g42a35.1g42l69.9g42f87.3k43a30.5k43l29.6k43f45.9e143a26.3e143l39.4e143f43.7d255a23.9d255l41.7d255f50.4s273a37.6s273l42.1s273f62.5
[0042]
a
上述产率为hplc产率。
[0043]
由上述结果可知，最佳突变株位g42f，反应产率从野生型的71.6％提升到87.3％。