一株产脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌

本发明属于微生物及生物技术领域，具体涉及一株产脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌。

背景技术：

脂肽(surfactin，又称为表面活性素)是一类两亲性环脂肽型生物表面活性剂，分子量约为1000da，通常由含七个氨基酸残基(l-谷氨酸、l-亮氨酸、d-亮氨酸、l-缬氨酸、l-天冬氨酸、d-亮氨酸、l-亮氨酸)的肽环与链长为13～16个碳原子的β-羟基脂肪酸以内酯键结合而成，是目前研究最多，也最具市场应用前景的生物表面活性剂之一。脂肽具有良好的表/界面活性，其临界胶束浓度在20mg/l左右，可将水的表面张力从72mn/m降至27mn/m，亲水亲油平衡(hlb)值为14，乳化指数(e24)高达67.6％。同时，surfactin结构稳定，在121℃高温和高盐的环境也仍然保持表面活性。surfactin作为一种阴离子表面活性剂，在酸性条件下易被质子化从而沉淀出来，其pka值为5.6，因此在ph为6～10的溶液中溶解度更高。此外，脂肽还具有良好的广谱抑菌活性，可以抑制多种细菌或真菌，且对病毒、支原体等也具有显著的抑制效果。更为重要的是，与化学表面活性剂相比，脂肽具有低毒、易生物降解、良好的环境相容性等优点，在医药、农业、食品、化妆品、石油开采等方面可替代化学表面活性剂，具有很大的应用潜力。

尽管脂肽是最具潜力的生物表面活性剂之一，具有广泛的应用潜力。然而，目前脂肽的发酵生产存在产量低和规模小等问题，导致其生产成本高昂，无法与化学表面活性剂竞争。因此筛选脂肽的高产新菌株，优化发酵生产工艺以提高脂肽的发酵生产水平具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一株产脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌bacillussubtilis50499，该菌株可用于脂肽类生物表面活性剂。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明公开的一株产脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌，分类命名为bacillussubtilis50499，保藏编号为cgmccno.22013，已于2021年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述枯草芽孢杆菌的16srrna的基因序列如seqidno.1所示。

所述的一株产脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌应用于发酵生产脂肽中的。

进一步地，发酵生产脂肽的步骤为：

(1)种子培养：将枯草芽孢杆菌50499接种到灭菌后的种子培养基中，在20-40℃摇床震荡培养1-2天形成种子培养液，所述摇床的转速为160-260rpm，摇瓶装液量为总体积的20-40％；

(2)接种和发酵：按体积比为0.5％-20％的接种量将种子培养液接种到灭菌后的发酵培养基中，发酵时间24～72h，发酵温度20-40℃；

(3)培养产脂肽：将接种后的培养液置于20-40℃摇床中进行培养产脂肽，所述摇床的转速为160-260rpm，摇瓶装液量为总体积的20-40％。

进一步地，所述种子培养基优选为lb培养基。

进一步地，所述发酵培养基的组成为：40g/l葡萄糖、5.75g/lnh4h2po4、1.7g/lnano3、3.0g/lkno3、0.1g/lmgso4、0.777mg/lcacl2、0.08mmfeso4、ph＝7.0。

进一步地，所述发酵培养基的组成优选为：40g/l葡萄糖、5.75g/lnh4h2po4、1.7g/lnano3、3.0g/lkno3、0.1g/lmgso4、0.777mg/lcacl2、0.2mmfeso4、ph＝7.0。

进一步地，所述步骤(1)和步骤(2)中的种子培养和发酵温度均优选为37℃。

进一步地，所述步骤(1)和步骤(3)中摇床的转速均优选为200rpm。

进一步地，所述步骤(1)和步骤(3)中的摇瓶装液量优选为总体积的30％。

进一步地，所述步骤(2)中的接种量优选为3％。

与现有技术相比，本发明的优点是：bacillussubtilis50499的surfactin产量高于目前大多数野生型枯草芽孢杆菌，为大规模的发酵生产提供可能性。

附图说明

图1为bacillussubtilis50499菌的显微镜照片。

具体实施方式

本发明所述的枯草芽孢杆菌50499是从被原油污染的土壤中分离获得的，该菌株于37℃在lb固体培养基上平板上生长，菌落为淡黄色，菌落边缘粗糙。分离后得到的纯种菌株进行了16srrna测序，该菌株的16srrna基因序列见序列表。经过与genbank的对比确定是属于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的新型菌株，命名为枯草芽孢杆菌50499。

实施例1：新型枯草芽孢杆菌bacillussubtilis50499的分离筛选及鉴定

1)菌株富集筛选

将20g取自被原油污染的土壤，加入60ml的无菌水，至于37℃恒温摇床上培养15分钟，取2ml上清液放入60ml筛选培养基进行富集培养24h。筛选培养基的组成为：3％玉米油，4g/lnano3，0.2g/lmgso4，1.0g/lnacl，1.0g/lkcl，0.04g/lcacl2，5ml/l85％h3po4；ph＝7.0。

培养24小时后，将培养液进行梯度稀释，并涂于筛选固体培养基中，在37℃的培养箱中培养24小时，得到30个单菌落，筛选培养基为lb固体培养基(g/l)的组成为：蛋白胨10，酵母提取物5，nacl10，琼脂粉15，ph＝7.0。挑选生长旺盛的单菌落，在相同的培养条件下反复进行筛选培养，由此可以获得纯种菌株，命名为枯草芽孢杆菌50499。

2)对菌株产物进行初步检测

将上述获得的纯种菌株在60mllb液体培养基中进行富集培养24h后，取2ml扩大培养后的液体放入60ml的发酵培养基中进行培养。发酵培养基配方为：40g/l葡萄糖,5.75g/lnh4h2po4,1.7g/lnano3,3.0g/lkno3,0.1g/lmgso4,0.777mg/lcacl2，0.02mmfeso4，ph＝7.0。

培养48小时后，离心去除菌体，取发酵液，进行hplc(高效液相色谱)、fitr(傅立叶红外)、tlc(薄层层析)和lc-ms(液相-质谱联用)分析。以sigma公司购买的脂肽为标准品，经过比对和鉴定，确定发酵液中的主要产物为脂肽，产量为0.57g/l。

hplc分析的测定条件如下：

色谱柱：thermorp-c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：a：超纯水(含0.05％三氟乙酸(trifluoroaceticacid，tfa))；

b：乙腈(acetonitrile，acn)；

等度洗脱：洗脱比例a：b＝10％：90％

流速：1ml/min；

柱温：常温；

进样量：20μl；

检测时间：20min；

检测波长：205nm

3)菌株的分类学鉴定

采用分子生物学的方法对筛选得到的菌株进行鉴定，测得其16srrna序列为是seqidno.1所示的基因序列，在genbank核酸数据库中进行比对，通过序列比对确认为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)50499，并于2021年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为cgmccno.22013。如图1所示为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis50499)菌的显微镜照片。

实施例2：枯草芽孢杆菌bacillussubtilis50499的发酵能力测定

(1)种子培养和发酵：将分离的枯草芽孢杆菌50499接种到灭菌后的lb种子培养基中，在37℃摇床震荡培养1天形成种子培养液，所述摇床的转速为200rpm，摇瓶装液量为总体积的30％；

(2)接种：按体积比为3％的接种量将种子培养液接种到灭菌后的发酵培养基中，所述发酵培养基的组成为40g/l葡萄糖、5.75g/lnh4h2po4、1.7g/lnano3、3.0g/lkno3、0.1g/lmgso4、0.777mg/lcacl2、0.08mmfeso4、ph＝7.0，发酵时间72h，发酵温度37℃；

(3)培养产脂肽：将接种后的培养液置于37℃摇床中进行培养产脂肽，所述摇床的转速为200rpm，摇瓶装液量为摇瓶总体积的30％。

检测得到脂肽的产量为2.24g/l

实施例3：枯草芽孢杆菌bacillussubtilis50499的发酵能力测定

(1)种子培养和发酵：将分离的枯草芽孢杆菌50499接种到灭菌后的lb种子培养基中，在20℃摇床震荡培养2天形成种子培养液，所述摇床的转速为160rpm，摇瓶装液量为总体积的40％；

(2)接种：按体积比为0.5％的接种量将种子培养液接种到灭菌后的发酵培养基中，所述发酵培养基的组成为40g/l葡萄糖、5.75g/lnh4h2po4、1.7g/lnano3、3.0g/lkno3、0.1g/lmgso4、0.777mg/lcacl2、0.08mmfeso4、ph＝7.0，发酵时间48h，发酵温度37℃；

(3)培养产脂肽：将接种后的培养液置于20℃摇床中进行培养产脂肽，所述摇床的转速为160rpm，摇瓶装液量为摇瓶总体积的20％。

检测得到脂肽的产量为2.08g/l

实施例4：枯草芽孢杆菌bacillussubtilis50499的发酵能力测定

(1)种子培养和发酵：将分离的枯草芽孢杆菌50499接种到灭菌后的lb种子培养基中，在40℃摇床震荡培养1天形成种子培养液，所述摇床的转速为260rpm，摇瓶装液量为总体积的20％；

(2)接种：按体积比为20％的接种量将种子培养液接种到灭菌后的发酵培养基中，所述发酵培养基的组成为40g/l葡萄糖、5.75g/lnh4h2po4、1.7g/lnano3、3.0g/lkno3、0.1g/lmgso4、0.777mg/lcacl2、0.08mmfeso4、ph＝7.0,发酵时间24h，发酵温度37℃；

(3)培养产脂肽：将接种后的培养液置于40℃摇床中进行培养产脂肽，所述摇床的转速为260rpm，摇瓶装液量为摇瓶总体积的40％。

检测得到脂肽的产量为1.98g/l

实施例5：脂肽发酵工艺条件的优化

(1)种子培养和发酵：将分离的枯草芽孢杆菌50499接种到灭菌后的lb种子培养基中，在37℃摇床震荡培养1天形成种子培养液，所述摇床的转速为200rpm，摇瓶装液量为总体积的30％；

(2)接种：按体积比为3％的接种量将种子培养液接种到灭菌后的发酵培养基中。以葡萄糖为唯一碳源，分别研究葡萄糖浓度、feso4浓度、温度、装液量等参数对脂肽发酵产量的影响。所述发酵培养基的组成最优选为5.75g/lnh4h2po4,1.7g/lnano3,3.0g/lkno3,0.1g/lmgso4,0.777mg/lcacl2，0.2mmfeso4，ph＝7.0，发酵时间72h，发酵温度37℃；

(3)培养产脂肽：将接种后的培养液置于37℃摇床中进行培养产脂肽，所述摇床的转速为200rpm，摇瓶装液量为摇瓶总体积的30％。

检测得到脂肽的产量可高达5.2g/l

以上所述，仅为本发明专利的较佳示例而已，并非用于限定本发明专利的保护范围。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变化形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

<120>一株产脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌

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