一种间充质干细胞分泌肽及其应用的制作方法

1.本技术涉及皮肤修复与改善领域，具体涉及一种源自间充质干细胞分泌肽及其相关用途。


背景技术：

3.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)是一类来源于发育早期中胚层的多能干细胞，是目前研究最多、最重要的成体干细胞之一。mscs广泛存在于全身多种组织中，并可在体外培养扩增，可在特定条件下分化为包括神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞在内的多种细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。与其他来源的mscs相比，来源于脐带的mscs具有采集方便、无伦理争议、免疫原性低、自我更新快、倍增速度稳定和增殖能力强等特点。因此，脐带mscs适合用于临床研究和应用，是细胞治疗和再生医学的首选。
4.根据www.clinicaltrials.gov网站统计的数据表明，截至2018年10月,全球已注册705项基于mscs的临床试验,80％以上的临床试验处于临床ⅰ期和ⅱ期,15％左右处于临床ⅲ期阶段。目前的实验结果表明：mscs用于多种疾病的治疗是安全和有效的,这些疾病类型包括移植物抗宿主病、脊髓损伤、自身免疫性疾病、心血管疾病、骨及软骨损伤修复、克罗恩病、糖尿病及其并发症等。目前,全球已有11种间充质干细胞药物获批用于上述疾病的临床治疗；然而,mscs在疾病治疗过程中发挥作用的机制尚不明确,仍需深入的研究和探索。
5.大量的证据表明，间充质干细胞(msc)可以通过旁分泌或自分泌发挥治疗作用，其疗效与血管生成、免疫调节及细胞凋亡有关。msc分泌组即msc所分泌的生物活性分子的总和，包括细胞因子、趋化因子和生长因子等多种活性成分，对损伤组织的修复、再生及功能恢复等许多生理过程具有调控作用。在创伤治疗领域，基于msc分泌组研制的制剂极有可能成为替代msc治疗的新疗法，具有广阔的发展前景(王强等，间充质干细胞分泌组:创伤愈合的替代疗法，中国生物工程杂志2017,vol.37issue(4):104-109)，然而目前基于间充质干细胞(msc)分泌肽的研究仍处于比较初级的阶段，目前的研发成果难以满足消费者的多样化需求。此外，目前关于msc分泌组正式用于临床之前，还需要更多的体内实验和体外实验，获得商业化前景更好的生物活性肽。


技术实现要素：

6.基于以上现有技术的不足，本技术发明人通过收集细胞培养液，通过30kd超滤后送质谱检测，从质谱数据中获得多肽后进行筛选。我们从msc分泌物中筛选获得一系列多肽，并进行了细胞学实验进行功能验证。获得了具有显著抗衰老、抗氧化以及抗炎症反应多重功效的生物活性肽。本发明的目的在于提供一种生物活性多肽及其制备方法和应用。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：本发明第一方面，提供一种生物活性多肽lq-17，其氨基酸序列为
lsdqvpdtesetxillq,x选自k或r。本发明第二方面，提供了所述生物活性多肽lq-17的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，更直接通过化学合成制备。本发明第三方面，提供了所述生物活性多肽lq-17在制备具有抗炎功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。本发明第四方面，提供了所述生物活性多肽lq-17在制备具有抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。本发明第五方面，提供了所述生物活性多肽lq-17在制备具有抗氧化功能的食品、保健品或药物中的应用。本发明第六方面，提供了一种产品，包括所述生物活性多肽lq-17或所述生物活性多肽lq-17的衍生物；所述生物活性多肽lq-17的衍生物，是指在生物活性多肽lq-17的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物，同时不影响其生物学活性。
附图说明
7.图1：cck-8/mtt测定细胞相对增值率实验
8.图2：lq-17和dr-13稀释后细胞相对增值率实验
9.图3：lq-17ros抑制率效果实验
10.图4：lq-17降低炎症反应效果实验
11.图5：lq-17对细胞正常代谢活动影响实验
12.图6：lq-17对细胞uva损伤的缓解效果实验
13.图7：lq-17减少细胞由于uva照射胶原蛋白损伤效果实验
14.图8：lq-17减少由于紫外照射带来的胶原流失效果实验
具体实施方式
15.筛选原理：
16.本技术相关多肽的获得采用以下流程：
17.以msc分泌组为实验材料，通过lc-ms液相色谱质谱联用仪筛选分子量小于30kda的多肽，结合核糖体图谱技术筛选获得656种生物活性肽，再根据基于机器学习和生物物理的蛋白质-肽相互作用预测方法(hsm ppi prediction)进一步筛选获得10个生物活性肽，具体如下：namesequencesde-16dgqvinetsqhhddleey-13ealelrdndktrysk-13snpvdiltyvawknn-16ntggsrypgqgspggnat-17apefaalgesgssssktlq-17lsdqvpdtesetkillqdr-13danleagnvketr
dg-13deaesledlgfkgvr-16vqelqkhqetaektkrtt-8tdltkvht针对上述筛选后的多肽进行下面功能验证实验。实验步骤：细胞活性检测hacat细胞复苏传代，镜检细胞状态良好后，收集细胞，调整细胞浓度为0.5-1.0*105个/ml，按照100μl/孔进行96孔铺板。培养箱培养24h(37℃，5％co2)后添加一定浓度的受试物，孵育24h。移去上清液，使用cck8检测试剂盒测定细胞的cck8值。抗氧化能力检测hacat细胞复苏传代，镜检细胞状态良好后，收集细胞。细胞96孔板铺板48h，控制细胞数量0.8-1.0*104个/孔。去除原有培养基，用pbs洗涤1～2次，添加含10μm h2o2的培养基进行诱导2h后，去培养基，重新添加含有一定浓度受试物的培养基，培养24h。使用ros检测试剂盒测定细胞内ros水平。抗炎症能力检测raw264.7细胞复苏传代，镜检细胞状态良好后，收集细胞，调整细胞浓度为1.0-1.5*105个/ml，按照2ml/孔进行12孔铺板。培养箱培养24h(37℃，5％co2)，细胞培养至融合度80％左右时，弃去培养基，加入含有lps的dmem高糖培养基，同时加入一定浓度的受试物，孵育24小时。每孔收集上清培养基，4度12000g离心1min，取上清，使用no检测试剂盒检测细胞内no浓度。胞内atp含量检测hacat细胞复苏传代，镜检细胞状态良好后，收集细胞，按照6*10^5个/孔细胞密度加入6孔板。培养箱培养24h(37℃，5％co2)，细胞培养至融合度80％左右时，弃去培养基，加入含有一定浓度受试物的培养基，孵育24小时。每孔弃去上清，加入200μl裂解液，收集细胞裂解产物，4度12000g离心1min，取上清，使用atp检测试剂盒检测atp浓度。抗紫外能力检测人包皮成纤维细胞hff细胞复苏传代，镜检细胞状态良好后，收集细胞，按照2.0-2.5*104个/孔细胞密度加入96孔板。培养箱培养24h(37℃，5％co2)，弃去培养基，加入含有一定浓度受试物的培养基，用一定计量的uva诱导，控制照射总量相同且介于5-15j/cm2。弃去上清，加入含有一定受试物的培养基，培养24h后使用相应试剂盒测定ros含量、cck8、羟脯氨酸含量等指标。实验结果：1.人角质形成细胞hacat细胞无损伤情况下，添加浓度100ppm的多肽，检测cck8变化，判断细胞活力。nc，阴性对照，仅含细胞，不添加样品。与nc比较，使用unpaired t-test进行统计学分析(mean
±
sd，n＝6)。细胞活性检测结果(如图1)表明：lq-17和dr-13能够增强细胞活性。针对lq-17和dr-13，降低浓度进行梯度实验(100、50、10ppm)。重复cck8检测实验。nc，阴性对照，仅含细胞，不添加样品。与nc比较，使用unpaired t-test进行统计学分析(mean
±
sd，n＝6)。实验结果(参见图2)表明：在各个浓度，lq-17的抗衰老效果均优于dr-13，即使在10ppm的极低浓度水平，仍能提升约10％的细胞活性。
2.使用双氧水诱导hacat细胞使其氧化水平升高。添加多肽浓度10ppm。vc，阳性对照组，维生素c浓度100μm；ck，空白对照组，仅含细胞无诱导处理；nc，阴性对照组，细胞做双氧水诱导处理。与nc比较，使用unpaired t-test进行统计学分析(mean
±
sd，n＝6)。实验结果表明(如图3)：lq-17能够显著降低细胞内ros水平，优于其他多肽，且作用强度与vc相当。3.使用终浓度1μg/ml的lps诱导raw264.7细胞内炎症反应。添加多肽浓度10ppm。pc，阳性对照，添加lps+地塞米松(100μg/ml)；nc，阴性对照，添加lps；ck，空白对照，仅添加细胞。与nc比较，使用unpaired t-test进行统计学分析(mean
±
sd，n＝2)。实验结果表明：lq-17能够显著降低no浓度(与阴性对照相比，下降约20％)，显著缓解炎症反应(参见图4)。4.向hacat细胞中添加10ppm的lq-17。egf，阳性对照，添加浓度1nm；ck，空白对照，仅添加细胞。与nc比较，使用unpaired t-test进行统计学分析(mean
±
sd，n＝2)。实验结果表明(参见图5)：lq-17对atp的生成没有影响，即lq-17不会影响细胞主要的能量代谢活动。5.向uva诱导的人包皮成纤维细胞hff细胞和hacat细胞添加10ppm lq-17肽。vc，阳性对照组，维生素c浓度100μm；tgf-β，阳性对照组，100ng/ml；ck，空白对照组，仅含细胞无诱导处理；nc，阴性对照组，细胞做uva诱导处理。与nc比较，使用unpaired t-test进行统计学分析(mean
±
sd，n＝3)。实验结果表明：1.与阴性对照相比，lq-17可显著提高紫外照射后细胞的存活率，具体参见图6。其中，左图，hff细胞；右图，hacat细胞。2.与阴性对照相比，lq-17可显著降低由紫外照射增加的ros浓度，具体参见图7。其中，左图，hff细胞；右图，hacat细胞。向uva诱导后的hff细胞中添加10ppm lq-17多肽。tgf-β，阳性对照组，100ng/ml；ck，空白对照组，仅含细胞无诱导处理；nc，阴性对照组，细胞做uva诱导处理。与nc比较，使用unpaired t-test进行统计学分析(mean
±
sd，n＝6)。实验结果显示(参见图8)：lq-17肽能够促进uva照射损伤的细胞提升胞外羟脯氨酸的含量，减少由于紫外照射带来的胶原流失，延缓皮肤衰老和减少皮肤损伤。综合上述实验数据，lq-17肽在抗衰老、抗氧化、减少炎症反应以及减少皮肤损伤方面具有极好的效果，并且无毒副作用。此外，本系列实验使用的lq-17多肽为lsdqvpdtesetkillq，其人源lq-17肽(lsdqvpdtesetrillq)经过上述实验获得类似的抗衰老、抗氧化、减少炎症反应以及减少皮肤损伤方面的效果。