羊肚菌提取物及其制备方法和用途

本发明属于真菌提取物技术领域，具体涉及一种羊肚菌提取物及其制备方法和用途。

背景技术：

羊肚菌(morchelladeliciosafr.)是一种野生名贵食药用真菌，最早收录于李时珍的《本草纲目》。中医认为其性平，味甘寒，无毒，具有益肠胃、消化助食、化痰理气、补肾、壮阳、补脑、提神之功能。现代研究发现，羊肚菌具有很高的营养和药用价值，特别是羊肚菌多糖具有降血脂、调节免疫功能、抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤等作用，并能减轻癌症患者放化疗引起的毒副作用。

cn110452311a公开了一种羊肚菌多糖及其制备方法和应用，所述多糖是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖。制备方法包括如下步骤：(1)取羊肚菌子实体粉末，热水浸提，所得水提物依次经浓缩、醇沉、除蛋白得到粗多糖；(2)将步骤(1)所得粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液；(3)将步骤(2)所得洗脱液用透析袋进行透析浓缩；(4)将步骤(3)完成后的透析袋内液体离心，取上清液，冷冻干燥，得到羊肚菌多糖。该多糖具有显著的免疫调节活性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的羊肚菌多糖的制备方法以及应用。

本发明首先提供了一种羊肚菌多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)将羊肚菌粉碎，水提，料液比为1：20～1：40，过滤，得浸提液，浓缩至液体总体积的25％；

(2)将浓缩后的羊肚菌浸提液醇沉，羊肚菌浸提液与乙醇的体积比为1：3～1：4，静置后离心，将离心后的沉淀烘干，再用水溶解后离心，取上清液，于-80℃冻实后进行真空冷冻干燥，得羊肚菌多糖样品。

其中，上述的制备方法，步骤(1)满足以下至少一项：

a将羊肚菌粉碎成超微粉；

b水提所用的水为反渗透水；

c水提的次数≥2；

d水提时的温度为90-100℃。

其中，上述的制备方法，步骤(2)中，静置的时间为3～12h；离心的条件为8000rpm，15min。

其中，上述的制备方法，还包括以下步骤：

(3)将步骤(2)中第二次离心所得的上清液经deae-cellulose洗脱，上样、洗脱流速为1-3ml/min，再分别用50mm、150mm、1m的nacl溶液洗脱，采用硫酸-苯酚法测定洗脱液中多糖含量，收集od值＞0.5的50mmnacl溶液洗脱液；

(4)将收集到的50mmnacl洗脱液透析后进行步骤(2)剩余的步骤。

其中，上述的制备方法，还包括以下步骤：在步骤(2)第二次离心所得的上清液中加入氯仿-正丁醇混合液，充分震荡15min除蛋白，静置3-6h后收集水溶液部分，透析后离心，取上清液重复步骤(3)、(4)，得到羊肚菌多糖粉末，然后将羊肚菌多糖粉末溶解于反渗透水中，终浓度为10mg/ml，采用分子筛柱梯度洗脱，收集最大洗脱峰的洗脱液，经过-80℃冻实后冷冻干燥，得到最终的羊肚菌多糖样品。

其中，上述的制备方法，所述透析是指选用孔径为30kda的透析膜将溶液先用自来水流水透析1-2天；再用反渗透水透析，每隔12h换水，透析2天。

其中，上述的制备方法，上清液与氯仿-正丁醇混合液的体积比为4：1，其中氯仿与正丁醇的体积比为5：1。

本发明还提供了上述制备方法制备的羊肚菌多糖；优选的，所述羊肚菌多糖的重均分子量为28.7～47.738kda；更优选的，所述羊肚菌多糖的重均分子量为35.54kda。

本发明还提供了上述羊肚菌多糖在制备治疗肝损伤药物中的用途。

本发明还提供了上述羊肚菌多糖在制备治疗调节肠道菌群药物中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的羊肚菌多糖对急性肝损伤有明显的治疗作用，同时还可以调节肠道菌群；为羊肚菌多糖的进一步开发作出了显著的贡献。

附图说明

图1为本发明实施例3羊肚菌多糖的红外光谱图；

图2为cn110452311a羊肚菌多糖的红外光谱图；

图3为实施例3(高剂量羊肚菌多糖mips)、对比例1(正常normal组)、对比例2(造模control组)的小鼠肠道菌群数量venn图；

图4为实施例3(高剂量羊肚菌多糖mips)、对比例1(正常normal组)、对比例2(造模control组)的小鼠肠道菌群组成pcoa图；

图5为实施例3(高剂量羊肚菌多糖mips)、对比例1(正常normal组)、对比例2(造模control组)的门水平小鼠肠道菌群top15的组成变化；

图6为实施例3(高剂量羊肚菌多糖mips)、对比例1(正常normal组)、对比例2(造模control组)中菌群staphylococcus、lactobacillus、jeotgalicoccus、gordonibacter的显著变化；

图7为实施例3(高剂量羊肚菌多糖mips)、对比例2(造模control组)菌群代谢物(正离子模式)plsda比较图；

图8为实施例3(高剂量羊肚菌多糖mips)、对比例2(造模control组)菌群代谢物(负离子模式)plsda比较图；

图9为实施例3(高剂量羊肚菌多糖mips)、对比例2(造模control组)菌群显著差异代谢物(正离子模式)热图；

图10为实施例3(高剂量羊肚菌多糖mips)、对比例2(造模control组)菌群显著差异代谢物(负离子模式)热图；

图11为实施例3(高剂量羊肚菌多糖mips)、对比例2(造模control组)菌群代谢物(正离子模式)kegg富集通路；

图12为实施例3(高剂量羊肚菌多糖mips)、对比例2(造模control组)菌群代谢物(负离子模式)kegg富集通路。

具体实施方式

具体的，一种羊肚菌多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)将羊肚菌粉碎，水提，料液比为1：20～1：40，过滤，得浸提液，浓缩至液体总体积的25％；

(2)将浓缩后的羊肚菌浸提液醇沉，羊肚菌浸提液与乙醇的体积比为1：3～1：4，静置后离心，将离心后的沉淀烘干，再用水溶解后离心，取上清液，于-80℃冻实后进行真空冷冻干燥，得羊肚菌多糖样品。

其中，上述的制备方法，步骤(1)满足以下至少一项：

a将羊肚菌粉碎成超微粉；

b水提所用的水为反渗透水；

c水提的次数≥2；

d水提时的温度为90-100℃。

其中，上述的制备方法，步骤(2)中，静置的时间为3～12h；离心的条件为8000rpm，15min。

进一步的，本发明羊肚菌多糖的制备方法还包括以下步骤：

(3)将步骤(2)中第二次离心所得的上清液经deae-cellulose洗脱，上样、洗脱流速为1-3ml/min，再分别用50mm、150mm、1m的nacl溶液洗脱，采用硫酸-苯酚法测定洗脱液中多糖含量，收集od值＞0.5的50mmnacl溶液洗脱液；

(4)将收集到的50mmnacl洗脱液透析后进行步骤(2)剩余的步骤。

进一步的，本发明羊肚菌多糖的制备方法还包括以下步骤：在步骤(2)第二次离心所得的上清液中加入氯仿-正丁醇混合液，充分震荡15min除蛋白，静置3-6h后收集水溶液部分，透析后离心，取上清液重复步骤(3)、(4)，得到羊肚菌多糖粉末，然后将羊肚菌多糖粉末溶解于反渗透水中，终浓度为10mg/ml，采用分子筛柱梯度洗脱，收集最大洗脱峰的洗脱液，经过-80℃冻实后冷冻干燥，得到最终的羊肚菌多糖样品。

其中，上述的制备方法，所述透析是指选用孔径为30kda的透析膜将溶液先用自来水流水透析1-2天；再用反渗透水透析，每隔12h换水，透析2天。步骤(4)中的透析是为了充分除去nacl等小分子物质；除蛋白后的透析是为了充分去除残留的有机溶剂。

本发明方法制备羊肚菌多糖过程中使用的透析袋截留分子量为30000da，由此制备得到的羊肚菌多糖可作为益生元，促进肠道菌群的生长，有利于肠道菌群将多糖转化为有益宿主并能被宿主吸收的物质，从而改善宿主健康状态，达到干预疾病，比如保肝的目的。

其中，上述的制备方法，上清液与氯仿-正丁醇混合液的体积比为4：1，其中氯仿与正丁醇的体积比为5：1。

本发明还提供了上述制备方法制备的羊肚菌多糖；优选的，所述羊肚菌多糖的重均分子量为28.7～47.738kda；更优选的，所述羊肚菌多糖的重均分子量为35.54kda。

本发明方法制备的羊肚菌多糖对急性肝损伤有明显的治疗作用，同时还可以调节肠道菌群；为羊肚菌多糖的进一步开发作出了显著的贡献。

以下通过实施例对本发明进行更详细的说明，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或者替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

本发明具体实施方式部分使用的原料和仪器均可通过市场购买得到。

实施例1

a、将干羊肚菌粉碎后用反渗透水浸提2次，浸提时羊肚菌超微粉与反渗透水的料液比为1:10，水浴温度为90℃，过滤浸提液后合并滤液，70℃减压浓缩至滤液总体积的25％。

b、将浓缩后的羊肚菌浸提液用乙醇醇沉，醇沉时羊肚菌浸提液与无水乙醇的体积比为1:3，醇沉时边加入乙醇边搅拌，随后静置3h后离心，离心条件为8000rpm，15min，离心后沉淀65℃烘干至恒重，再用反渗透水溶解。

c、将上述溶液先离心，8000rpm，15min，4℃，离心后收集上清。将该溶液-80℃冻实后进行真空冷冻干燥，得到最终的羊肚菌多糖样品。

实施例2

a、将干羊肚菌粉碎后用反渗透水浸提2次，浸提时羊肚菌超微粉与反渗透水的料液比为1:10，水浴温度为90℃，过滤浸提液后合并滤液，70℃减压浓缩至滤液总体积的25％。

b、将浓缩后的羊肚菌浸提液用乙醇醇沉，醇沉时羊肚菌浸提液与无水乙醇的体积比为1:3，醇沉时边加入乙醇边搅拌，随后静置3h后离心，离心条件为8000rpm，15min，离心后沉淀65℃烘干至恒重，再用反渗透水溶解。

c、将上述溶液先离心，8000rpm，15min，4℃，离心后将上清液流经deae-cellulose，上样、洗脱流速均为3ml/min，再分别用50mm、150mm、1m的nacl溶液洗脱，采用硫酸-苯酚法测定洗脱液中多糖含量，收集od值＞0.5的50mmnacl溶液洗脱液。

d、将收集到的50mmnacl洗脱液用孔径为30kda的透析膜透析，先用自来水流水透析1天，再用反渗透水透析每隔12h换水，透析2天，充分除去nacl等小分子物质。将透析后的溶液-80℃冻实后进行真空冷冻干燥，得到最终的羊肚菌多糖样品。

实施例3

a、将干羊肚菌超微粉粉碎至可过200目筛，取过筛后的羊肚菌子实体超微粉，用反渗透水浸提2次，浸提时羊肚菌超微粉与反渗透水的料液比为1:20，水浴温度为100℃，过滤浸提液后合并滤液，70℃减压浓缩至滤液总体积的25％。

b、将浓缩后的羊肚菌浸提液用乙醇醇沉，醇沉时羊肚菌浸提液与无水乙醇的体积比为1:4，醇沉时边加入乙醇边搅拌，随后静置6h后离心，离心条件为8000rpm，15min，离心后沉淀50℃烘干至恒重，再用反渗透水溶解，充分溶解后再离心，取上清液。

c、在上清液中加入氯仿-正丁醇混合液(羊肚菌浸提液与氯仿-正丁醇混合液的体积比为4:1，其中氯仿与正丁醇的体积比为5:1)，充分震荡15min除蛋白，静置3h后收集水溶液部分。选用孔径为30kda的透析膜透析除蛋白后的水溶液，先用自来水流水透析2天，再用反渗透水透析每隔12h换水，透析2天，充分去除残留的有机溶剂。

d、将透析后的羊肚菌浸提液先离心，8000rpm，15min，4℃，离心后将上清液流经deae-cellulose，上样、洗脱流速均为3ml/min，再分别用50mm、150mm、1m的nacl溶液洗脱，采用硫酸-苯酚法通过分光光度计测定洗脱液中多糖含量，收集od值＞0.5的50mmnacl溶液洗脱液。

e、将收集到的50mmnacl洗脱液用孔径为30kda的透析膜透析，先用自来水流水透析1天，再用反渗透水透析每隔12h换水，透析2天，充分除去nacl等小分子物质。将透析后的溶液-80℃冻实后进行真空冷冻干燥。

f、将上述羊肚菌多糖粉末溶解于反渗透水中，终浓度为10mg/ml，采用分子筛柱梯度洗脱，收集最大洗脱峰的洗脱液，经过-80℃冻实后冷冻干燥，得到最终的羊肚菌多糖样品，其分子量及其组成分布见表1。

表1本发明羊肚菌多糖的分子量及其组成分布

将本专利和cn110452311a中羊肚菌多糖分别经傅里叶变换红外光谱在4000cm^-1-400cm^-1范围内扫描，图1说明本发明羊肚菌多糖可能存在的官能团：

1、3100-3000cm^-1(c-h伸缩振动)的吸收峰，1675-1640cm^-1(c＝c伸缩振动)的吸收峰及1000-675cm^-1的吸收峰(烯烃c-h面外弯曲振动)表面样品b存在双键。

2、3100-3000cm^-1强吸收峰(芳环上c-h伸缩振动)、1600、1580、1500、1450cm-1处的强度不等吸收(c＝c)1000-675cm^-1吸收峰，说明样品存在芳环。

3、3650-3600cm^-1的吸收峰、1300-1000的吸收峰及769-659的吸收峰预示可能要醇羟基和酚的存在。

4、1750-1700cm^-1的吸收峰(c＝o)及2820，2720(醛基c-h)说明存醛基，同时1715cm-1处有较强的吸收峰，可能存在酮基。

5、3300-2500cm^-1的强吸收及1720-1706的c＝o伸缩吸收、1320-1210cm^-1的c-o伸缩吸收以及920cm^-1左右的吸收说明存在羧基-cooh。

同时，由图1-2可知，两种多糖的特征吸收峰完全不同。本发明羊肚菌多糖与cn110452311a中羊肚菌多糖是两种截然不同的多糖。

试验例1、羊肚菌多糖治疗肝损伤

小鼠溃疡性肝损伤造模方法为：将购买的c57bl/6雄性6-7周龄小鼠适应喂养一周后，继续常规喂养，使其自由取食、饮水，持续14天，第14天时给小鼠腹腔注射0.4％ccl4(ccl4，v/w)。

将实施例1-3制备的羊肚菌多糖分别溶解于反渗透水中，配置成18.75mg/ml溶液，灌胃ccl4诱导的肝损伤小鼠(折合体重为300mg/kg/d)，每天每只肝损伤小鼠灌胃一次200μl羊肚菌多糖溶液，持续14天，然后麻醉处死小鼠。

对比例1：用反渗透水灌胃未经任何处理的正常小鼠，每天每只小鼠灌胃一次200μl反渗透水，持续14天，然后麻醉处死小鼠。

对比例2：用反渗透水灌胃ccl4诱导的肝损伤小鼠，每天每只小鼠灌胃一次200μl反渗透水，持续14天，然后麻醉处死小鼠。

对比例3：将专利cn110452311a中制备的羊肚菌多糖配置为18.75mg/ml溶液，灌胃ccl4诱导的肝损伤小鼠，每天每只肝损伤小鼠灌胃一次200μl溶液，持续14天，然后麻醉处死小鼠。

采集各组小鼠的血清和肝脏进行肝损伤相关指标的测定，测定结果见表2。

表2小鼠肝损伤治疗效果比较

注：对比例2和对比例1相比，p＜0.5表明差异显著，标记“#”，p＜0.01表明差异极显著，标记“##”；对比例3、实施例1、实施例2、实施例3与对比例2相比，p＜0.5表明差异显著，标记“*”，p＜0.01表明差异极显著，标记“**”。

从表2可以看出，实施例1、2、3与对比例1、2、3相比，实施例3中羊肚菌多糖可显著降低ccl4中毒时的肝重。对比例2组血清中与谷丙转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、总胆汁酸(tba)相关的生化指标显著升高，但mips灌胃组显著升高，对小鼠急性肝损伤的作用显著优于其它组。此外，ccl4中毒可使肝脏丙二醛(mda)含量升高，超氧化物歧化酶(sod)含量降低，从而损害肝脏抗氧化活性。然而，实施例3制备的羊肚菌多糖可以缓解ccl4的这些不良反应。炎症指标结果显示，经ccl4处理后，il-1、il-6、tnf-α和髓过氧化物酶(mpo)水平明显升高(对比例2)，但在灌胃实施例3中羊肚菌多糖后下降。综合比较表中所列指标，对比例3、实施例1、实施例2、实施例3对急性肝损伤有一定的治疗作用，效果实施例3＞实施例2＞实施例1＞对比例3。随后，通过uhplc-ms/ms代谢组学分析，在血清中鉴定出9个正常组(对比例1)与造模组(对比例2)之间的代谢产物，10个高剂量羊肚菌多糖治疗组(实施例3)与造模组(对比例2)之间的代谢产物，这其中一些关键代谢产物涉及类黄酮生物合成、氨基酸代谢、能量代谢和毒物降解。这些新发现表明，羊肚菌多糖可能在减轻ccl4引起的氧化应激和炎症反应方面具有治疗价值。基于lc-ms的代谢组学为鉴定潜在的生物标志物和阐明药用菌抗肝损伤的保护机制提供了一个强有力的理论依据。

我们还发现羊肚菌多糖能够调节肠道菌群、改变菌群的代谢产物，以此来达到缓解肝损伤的作用。由图3所示，经ccl4诱导后，与正常小鼠相比，急性肝损伤小鼠产生特有的肠道菌群，进一步通过羊肚菌多糖治疗后，小鼠的肠道菌群也发生变化。正常组、造模组、羊肚菌多糖组小鼠共有的肠道菌群有551个，特有的数量分别为79、347、107。图4小鼠肠道菌群门水平的pcoa图进一步验证了上述结果，并且如图所示，羊肚菌多糖处理组的菌群分布区域位于正常组和造模组之间，说明经羊肚菌多糖灌胃后，急性肝损伤小鼠的肠道菌群组成趋近于正常小鼠。图5表明各组小鼠肠道菌群门水平top15的组成变化，可以明显看出经ccl4处理后，小鼠肠道菌群firmicutes降低而bacteroidetes升高，但灌胃羊肚菌多糖后能缓解这种变化，增加firmicutes丰度，降低bacteroidetes丰度。图6更准确地说明正常组、造模组、羊肚菌多糖组中具体菌群的显著变化。急性肝损伤小鼠菌群中staphylococcus和jeotgalicoccus显著上升，lactobacillus和gordonibacter显著下降，而羊肚菌多糖能改善这些变化，使得staphylococcus、lactobacillus、jeotgalicoccus、gordonibacter的丰度接近正常小鼠的丰度。图7-12表明造模组和羊肚菌多糖组小鼠菌群代谢产物的变化。图7和8中造模组和羊肚菌多糖组所分布的区域明显分开，说明他们的菌群代谢物组成有显著性差别。图9和10的显著差异代谢物热图(蓝色代表上调、红色代表下调)也验证了上述结果。图11和12表明筛选到的差异代谢产物富集到的相关代谢通路，涉及组氨酸等氨基酸、嘧啶、嘌呤、脂肪酸、β-丙氨酸、维生素b6的代谢，以及氨基酸和初级胆酸的合成，表明羊肚菌多糖通过影响急性肝损伤小鼠肠道菌群及其代谢物，导致肠道内相关物质的合成与代谢改变，进一步达到干预急性肝损伤的效果。