本发明属于生物医药技术领域，涉及熊去氧胆酸的制备方法，具体涉及一种从猪去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法。
背景技术：
熊去氧胆酸(ursodexycholicacid)简称udca，是熊胆的主要成分，其化学名称为(3α，7β)-二羟基-5β胆烷酸。医学上用于增加胆汁酸分泌，并使胆汁成分改变，降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂，有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解，用于治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎、眼部疾病等。自从20世纪80年代，发现熊去氧胆酸具有有效溶解胆固醇性结石作用以来，不断有新的研究显示熊去氧胆酸在利胆、护肝中具有积极的作用。近年来，国外报道了udca还可用于治疗慢性肝炎和肝移植后排斥反应。随着临床研究的不断进步，人们发现熊去氧胆酸在促进免疫调节、治疗冠心病等方面也有积极作用。因此，随着研究的深入，熊去氧胆酸的药用价值越来越受到人们的重视，对熊去氧胆酸的需求量也在逐年升高。但是，天然熊胆的来源日益减少，人们一直在努力寻求除以天然熊胆获取熊去氧胆酸之外的替代方法。早期，熊去氧胆酸是通过从牛、羊胆汁中分离提取的胆酸为起始原料，然后经过复杂的化学方法生产的，其中，制成鹅去氧胆酸后需经氧化还原生成熊去氧胆酸。但是，这一方法步骤多、生产时间长、成本高。
近几年国内udca市场增长迅速，随着酶催化技术的逐步推进，目前的udca生产工艺开始从化学工艺大范围转到酶催化工艺。从目前公开的技术来看，酶法制备udca的原料大部分是鹅去氧胆酸（cdca）。在各种动物胆汁中，猪胆汁是最常见且产量最大的，自古代开始就被广泛应用于临床，如用猪胆汁治疗急性黄疸型传染性肝炎、百日咳、急性肠炎以及胃溃疡等，均能收到良好的治疗效果。猪胆汁中主要含胆汁酸类、胆色素、粘蛋白、脂类及无机物等，胆汁酸则主要包含猪去氧胆酸（hdca）、猪胆酸、鹅去氧胆酸、3α-羟基-6-氧-5α-胆烷酸以及胆石酸等，其中猪去氧胆酸约占40%。猪去氧胆酸的来源广泛廉价，成为较理想的原料。现有技术中从hdca到udca的技术基本是全化学法，工艺复杂，成本较高，环境不友好，安全风险大，因此需要开发更加安全简便的生产途径。
技术实现要素：
针对现有技术中的问题，本发明提供一种利用猪去氧胆酸制备熊去氧胆酸的方法，采用化学-酶法以猪去氧胆酸为原料，通过简单的三步反应，实现了udca的生产，该方法的工艺简单，成本低，转化率高，后处理更容易，更加环保。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种利用猪去氧胆酸制备熊去氧胆酸的方法，包括以下步骤：
（1）猪去氧胆酸与琼斯试剂发生氧化反应，分离纯化获得中间体r1：
（2）在3α-类固醇脱氢酶（3α-hsdh）、7β-羟化酶和葡萄糖脱氢酶（gdh）催化，葡萄糖和辅酶i或辅酶ii的参与下将中间体r1催化，反应终止后分离纯化获得中间体r2：
（3）中间体r2通过黄鸣龙反应分离纯化后获得熊去氧胆酸：
优选地，步骤（1）中，所述反应在溶液中进行，所述溶液的溶剂为乙酸乙酯或丙酮。
优选地，步骤（1）中，所述分离纯化步骤为：用硅藻土过滤，减压浓缩去除溶剂。
优选地，步骤（2）中，中间体r1：3α-类固醇脱氢酶：7β-羟化酶：葡萄糖脱氢酶：辅酶：葡萄糖的质量比为1：(0.3-1)：(0.2-1)：(0.1-1)：(0.001-0.005)：(2-4)。
优选的，步骤（2）中，辅酶i和辅酶ii用还原态的代替。
优选地，步骤（2）中，反应在缓冲溶液中进行；中间体r1在溶液中的质量体积浓度为5%-15%。
优选地，步骤（2）中，反应ph为6.5-7.5，反应温度为25℃-37℃。
优选地，步骤（2）中，氧气由空气或富氧空气提供；所述富氧空气的氧气含量为21%-50%。更优选地，通气量为0.5-2vvm。
优选地，步骤（2）中，所述分离纯化步骤为：反应体系中加入等体积乙酸乙酯，质量体积浓度为20%的硅藻土，搅拌后过滤，将滤液分液后收集有机相i；将滤饼和水相合并，再加入首次加入量的乙酸乙酯，搅拌后过滤，将滤液分液，收集有机相ii，然后将两次有机相合并后去除溶剂获得中间体r2。
优选地，步骤（3）中，所述分离纯化步骤为：反应体系中加等体积水，然后调ph至2.0，然后用2体积倍的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液后蒸出溶剂获得产物。
本发明具有以下优点：
本发明利用酶催化技术替代了大部分化学反应，将步骤繁琐、条件苛刻、高污染高安全风险的全化学反应转换成化学-酶法，仅保留了条件相对温和的化学反应，极大降低了生产成本，降低了环保压力和安全生产压力；酶反应过程中实现了辅酶nadph的循环再生，将昂贵的辅酶用量降到了最低，极大降低了生产成本。本发明的制备方法既降低了生产成本，有利于环境保护和生产安全，在实际生产中优势巨大。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1利用猪去氧胆酸制备熊去氧胆酸
（1）将22g三氧化铬加入28ml浓硫酸中，用水稀释至100ml，得到琼斯试剂；将100g猪去氧胆酸溶于1000ml丙酮中并用琼斯试剂处理，直到获得轻微的永久橙色。将混合物静置10min后，加入少量异丙醇以破坏过量的氧化剂。反应混合物用硅藻土过滤，减压浓缩去除溶剂，得到99.1g产品r1，收率99.1%；
（2）反应体系500ml，往2l三孔烧瓶中加入400ml0.05mph6.8pbs缓冲液，然后加入50g中间体r1、120g葡萄糖、40ml正己醇、2.5mltritonx-100、0.1gnadp+，将三孔烧瓶放在35℃恒温水浴锅中，搅拌均匀后调ph6.8，然后加入15g3α-hsdh、25g7β-羟化酶、10ggdh，反应过程中保持温度和ph的稳定，并持续向三孔烧瓶中通入空气，空气流量1l/min，反应8h后hplc检测底物r1和产物r2的浓度，反应超过98%后结束反应，向反应瓶中加入500ml乙酸乙酯，20g硅藻土，搅拌15min后过滤，将滤液分液后收集有机相。将滤饼和水相合并，再加入500ml乙酸乙酯，搅拌15min后过滤，将滤液分液，收集有机相，然后将两次有机相合并，60℃旋蒸，得到中间体r2干粉45.8g，收率91.6%；
（3）将25g中间体r2溶解在500ml一缩二乙二醇中，加入30ml98%水合肼，加热至120℃，搅拌2h，冷却至80℃，然后加入25gnaoh，升温至200℃反应10h。hplc检测反应底物r2和产物udca的浓度，反应99%以上时结束反应。反应结束后加水500ml，用盐酸调ph至2.0，然后用1000ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后50℃旋蒸，得到udca干粉22.4g，收率89.6%。
实施例2利用猪去氧胆酸制备熊去氧胆酸
（1）将22g三氧化铬加入28ml浓硫酸中，用水稀释至100ml，得到琼斯试剂。将50g猪去氧胆酸溶于1000ml乙酸乙酯中并用琼斯试剂处理，直到获得轻微的永久橙色。将混合物静置10min后，加入少量异丙醇以破坏过量的氧化剂。反应混合物用硅藻土过滤，减压浓缩去除溶剂，得到48.8g中间体r1，收率97.6%；
（2）反应体系500ml，往2l三孔烧瓶中加入400ml0.05mph7.0pbs缓冲液，然后加入25g中间体r1、50g葡萄糖、40ml正己醇、2.5mltritonx-100、0.025gnad+，将三孔烧瓶放在37℃恒温水浴锅中，搅拌均匀后调ph7.0，然后加入7.5g3α-hsdh、5g7β-羟化酶、2.5ggdh，反应过程中保持温度和ph的稳定，并持续向三孔烧瓶中通入50%富氧空气，空气流量0.5l/min。反应8h后hplc检测底物r1和产物r2的浓度，反应超过98%后结束反应，向反应瓶中加入500ml乙酸乙酯，20g硅藻土，搅拌15min后过滤，将滤液分液后收集有机相。将滤饼和水相合并，再加入500ml乙酸乙酯，搅拌15min后过滤，将滤液分液，收集有机相，然后将两次有机相合并，60℃旋蒸，得到中间体r2干粉22.6g，收率90.4%；
（3）将20g中间体r2溶解在500ml一缩二乙二醇中，加入25ml98%水合肼，加热至120℃，搅拌2h，冷却至80℃，然后加入20gnaoh，升温至200℃反应10h。hplc检测反应底物r2和产物udca的浓度，反应99%以上时结束反应。反应结束后加水500ml，用盐酸调ph至2.0，然后用1000ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后50℃旋蒸，得到udca干粉18.4g，收率92%。
实施例3利用猪去氧胆酸制备熊去氧胆酸
（1）将22g三氧化铬加入28ml浓硫酸中，用水稀释至100ml，得到琼斯试剂。将100g猪去氧胆酸溶于1000ml丙酮中并用琼斯试剂处理，直到获得轻微的永久橙色。将混合物静置10min后，加入少量异丙醇以破坏过量的氧化剂。反应混合物用硅藻土过滤，减压浓缩去除溶剂，得到98.2g产品r1，收率98.2%；
（2）反应体系500ml，往2l三孔烧瓶中加入400ml0.05mph7.4pbs缓冲液，然后加入75g中间体r1、230g葡萄糖、40ml正己醇、2.5mltritonx-100、0.3gnadph，将三孔烧瓶放在25℃恒温水浴锅中，搅拌均匀后调ph7.4，然后加入50g3α-hsdh、50g7β-羟化酶、50ggdh，反应过程中保持温度和ph的稳定，并持续向三孔烧瓶中通入50%富氧空气，空气流量1l/min。反应6h后hplc检测底物r1和产物r2的浓度，反应超过98%后结束反应，向反应瓶中加入500ml乙酸乙酯，20g硅藻土，搅拌15min后过滤，将滤液分液后收集有机相。将滤饼和水相合并，再加入500ml乙酸乙酯，搅拌15min后过滤，将滤液分液，收集有机相，然后将两次有机相合并，60℃旋蒸，得到中间体r2干粉69.3g，收率92.4%；
（3）将25g中间体r2溶解在500ml一缩二乙二醇中，加入30ml98%水合肼，加热至120℃，搅拌2h，冷却至80℃，然后加入25gnaoh，升温至200℃反应10h。hplc检测反应底物r2和产物udca的浓度，反应99%以上时结束反应。反应结束后加水500ml，用盐酸调ph至2.0，然后用1000ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后50℃旋蒸，得到udca干粉22.1g，收率88.4%。