一种蛋白生产装置及方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白生产装置及方法。

背景技术：

近年来，无细胞蛋白合成(cell-freeproteinsynthesis，cfps)作为一种新型的蛋白质合成方法，展现出巨大的潜力和应用前景。该蛋白质合成系统的主要组分包括具有基本转录和翻译功能的粗提取物、dna模板、能量再生物质、辅因子和无机盐等。与自然状态下活细胞合成蛋白质不同，无细胞蛋白合成体系不受细胞膜的限制，不仅允许无细胞蛋白体系合成对细胞活性有害的蛋白质，还使基因更容易被编辑，蛋白质合成过程更好监控，极大地增加了蛋白质合成过程的灵活性。因此，无细胞合成体系具有比活细胞合成方法更快的蛋白质表达率、更高的蛋白质产量和可合成更复杂的蛋白质。

无细胞蛋白表达的反应方式有：

(1)批次反应(batch)：该方式是在cfps体系中一次性的加入模板、细胞提取物和能量缓冲液进行相关蛋白的表达。该体系是封闭的，能量供应体系和底物均能够最大程度的被利用，可以实现反应体系的放大和多种蛋白的平行表达。

(2)连续流加式(continuous-flow)：该生产方式在反应过程中，需要不断添加反应所需的物质和能量，并定时清除反应副产物.将这种生产方式应用于大肠杆菌和麦胚cfps，反应时间可延长至20h。

(3)连续交换式反应(continuous-exchangecell-freetranslationsystem，cecf)该方式的蛋白质表达发生在具有选择透过性的透析膜的反应液中。通过透析膜可连续供应能量和底物，同时，如无机小分子等反应的副产物通过透析膜扩散至补充液，降低其代谢产物对蛋白表达的抑制作用。该方式延长了反应时间，提高了蛋白表达产量。

但现有的无细胞表达体系在成本和产率上难以实现蛋白质的大规模应用，其存在的问题如下所示：

(1)批次反应(batch)的体系是封闭的，在体系反应过程中，所需物质不能添加，随着反应的进行，能量和底物逐渐被消耗，代谢产物和游离磷酸盐等的积累抑制反应导致系统的寿命短，蛋白表达体系小多为50μl且反应时长在3h左右，蛋白质产量低，通常只能达到μgml-1。

(2)连续流加式(continuous-flow)生产方式在反应过程中，需要不断添加反应所需的物质和能量，并定时清除反应副产物，连续流加操作的繁琐性和装置的复杂性严重限制了该模式的实用性。

(3)连续交换式反应如目前商业化的无细胞合成体系快速翻译系统rts100/500/9000e.colihy试剂盒则包括反应试剂及反应容器，需配套恒温振荡器进行反应，成本高昂，受仪器所限反应体积最大为10ml，通常应用在蛋白结构测定、蛋白结晶等研究领域，并且当无细胞体系应用于代替传统的细胞内基因表达方法大规模生产异源蛋白质时，由于需要充分长期补充能量和反应底物，从而增加了生产成本和降低了竞争力。

目前已有的连续交换式无细胞生产方式如图1所示，在该体系中透析管里的反应混合物得不到混合或搅拌，反应速率相对较低，有一定的体积要求，对反应体系条件更加严格；其混合搅拌作用的转子在装有补充液的容器中搅拌时会产热，整体反应体系的温度是不可控的，不适用于一些对温度敏感的合成反应，且透析管是不可二次使用的，而透析管的价格较为昂贵，增加了每次实验的成本。

此外，现有的技术没有解决反应过程中的通气问题，而氧气作为三磷酸腺苷(atp)再生系统中的关键组分，对atp的再生过程有着重要的影响。氧供应不足降低atp再生速率，增加脱氧核糖核酸(dna)转录-翻译时间，从而降低蛋白质产量和合成效率。同时，蛋白质合成过程中产生的二氧化碳也可能抑制代谢过程，影响蛋白质表达。

技术实现要素：

本发明的的主要目的在于提供一种蛋白生产装置及方法，以克服现有技术中存在的不足。

为实现前述目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种蛋白生产装置，包括：

反应单元，包括反应室，所述反应室与液相无细胞蛋白合成反应体系的供应设备连通，液相无细胞蛋白合成反应体系能够在所述反应室内连续流动并进行蛋白合成反应；

物料补充单元，包括补充室，所述补充室与液相物料补充体系的供应设备连通，液相物料补充体系能够在所述补充室内连续流动；

物质交换单元，包括透析膜，所述透析膜用于将所述反应室与补充室分隔，所述液相无细胞蛋白合成反应体系中产生的抑制蛋白合成反应的副产物以及废气能够连续穿过所述透析膜而被去除，以及，所述液相物料补充体系中的蛋白合成反应所需底物能够连续透过所述透析膜而补充入反应单元。

进一步地，所述的蛋白生产装置，包括一整体腔室，所述整体腔室被所述透析膜分隔为反应室和补充室，且所述整体腔室的外侧通过固定单元固定。

进一步地，所述透析膜表面分布有复数个突起部。

进一步地，所述反应室和/或补充室的内壁上均设有复数个向内或向外的突起部。

进一步地，所述的蛋白生产装置，包括一中空结构的反应室，所述中空结构的反应室内设有由透析膜形成的一中空结构的补充室。

进一步地，所述中空结构的反应室内还设有由透析膜形成的中空通气单元，所述中空通气单元的入口与气源连通并用于输入包含氧气或其他气体的工作气体，出口用于排放含二氧化碳或其他气体的废气。

本发明实施例还提供了一种蛋白生产方法，包括：

提供前述的蛋白生产装置；

将液相无细胞蛋白合成反应体系的供应设备提供的液相无细胞蛋白合成反应体系注入反应室，在反应室内循环进行蛋白表达；

将液相物料补充体系的供应设备提供的液相物料补充体系注入补充室，与反应室内的液相无细胞蛋白合成反应体系进行物质交换；

以气源向通气单元输入工作气体，以向反应室内的液相无细胞蛋白合成反应体系提供氧气，并排除液相无细胞蛋白合成反应体系中的二氧化碳。

进一步地，在进行所述的蛋白表达时，蛋白表达的时间为2-48h，所述工作气体包含0-100v/v％氧气，其余为氮气或其他惰性气体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明蛋白生产装置及方法，将无细胞蛋白生产的连续流加式(continuous-flow)及连续交换式(continuous-exchange)相结合有效减小反应容器的总体尺寸使得反应更加灵活，可使外源基因连续高效表达，该系统所需的氨基酸、能量等物质的补充液通过蠕动泵连续恒定的进人物料补充单元，随着反应的进行两个单元之间会形成一定的浓度差，通过透析膜两个单元可以进行物质交换，既反应单元中产生的能够抑制蛋白合成的副产物等通过扩散作用(浓度差)穿过透析膜，并快速地从流动的物质补充液中去除，而物料补充单元中所需的反应底物也能连续不断的供给反应单元使其整个装置始终处于动态平衡状态。

(2)本发明蛋白生产装置及方法，其中，将透析膜做成有柱状突起的形状，增大其比表面积，提高物质交换率，反应单元及物料补充单元也可做成有柱状突起的腔室，增加反应物接触面积，加快物质交换，且通过增加通气单元为反应提供氧气同时将反应产生的二氧化碳等废气的及时去除，延长反应进行时间，提高蛋白表达产量。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请背景技术中已有的连续交换式无细胞生产装置图。

图2是本申请实施例一中的一种蛋白生产装置的结构示意图。

图3是图2中反应室、物质交换单元及补充室的具体结构示意图。

图4是图2中反应室、物质交换单元及补充室的剖面图。

图5是本申请实施例二中的一种蛋白生产装置的结构示意图。

图6是图5中反应室、物质交换单元及补充室的具体结构示意图。

图7是图5中反应室、物质交换单元及补充室的剖面图。

图8是本申请实施例三中的一种蛋白生产装置的结构示意图。

图9是图8中反应室、物质交换单元及补充室的结构示意图。

图10沿图9a-a的横切面图。

图11沿图9b-b的纵切面图。

图12是本申请对比例中表达质粒图谱。

附图标记说明：1、固定单元，1-1、第一接口，1-2、第二接口，1-3第三接口，1-4第四接口，1-5、螺丝，2、反应室，2-1、反应液入口，2-2、反应液出口，3、透析膜，3-1、柱状突起，4、补充室，4-1、补充液出口，4-2、补充液入口，5、中空结构的反应室，6、中空结构的补充室，7、中空通气单元，8、液相无细胞蛋白合成反应体系的供应设备，9、液相物料补充体系的供应设备，10、蠕动泵，11、气源，12、物质交换单元。

具体实施方式

通过应连同所附图式一起阅读的以下具体实施方式将更完整地理解本发明。本文中揭示本发明的详细实施例；然而，应理解，所揭示的实施例仅具本发明的示范性，本发明可以各种形式来体现。因此，本文中所揭示的特定功能细节不应解释为具有限制性，而是仅解释为权利要求书的基础且解释为用于教示所属领域的技术人员在事实上任何适当详细实施例中以不同方式采用本发明的代表性基础。

鉴于现有技术中反应容器的体积受限、价格昂贵及无细胞合成过程中气体的流通速率受限除，影响合成效率的问题，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是将无细胞蛋白生产的连续流加式(continuous-flow)及连续交换式(continuous-exchange)相结合有效减小反应容器的总体尺寸使得反应更加灵活。如下将对该技术方案、其实施过程及原理作进一步的解释说明。

对比例：

使用10kd透析管(slide-a-lyzerminidialysisdevices，thermoscientific)进行连续交换式反应。

1.表达载体

本发明中，sfgfp-huti基因表达载体用于无细胞蛋白质的生成。sfgfp-rhuti表达载体用于确认本发明应用到由无细胞蛋白质生产的可行性。

表达载体构建过程如下：

(1)在genebank中查找人尿胰蛋白酶抑制剂的cdna在n端添加6*his标签以及sfgfp碱基，将上述基因进行基因合成，基因合成序列见seqidno：1。

(2)以pij8660f：ggtgacgaagaactgctgtaaggatccgaattcaagctttg和pij8660r：gctgtgatgatgatgatgatgcatggtatatctccttcttaaag为上下游引物(分别引入了同源互补区段)，以载体pij8660为模板进行pcr扩增。分别取1.0μl模板、2.5μl10μm的上游和下游引物、25μlpcr聚合酶q5high-fidelity2xmastermix(neb，usa)、无菌水将反应液定容至50μl。98℃条件下预变性处理30s，然后分别在98℃变性10s、57℃退火30s、72℃延伸2min、72℃终延伸2min，整个pcr反应体系共进行35个循环。扩增产物经dpni酶处理消除模板后，经1％琼脂糖凝胶电泳检验后进行dna切胶纯化，获得线性质粒pij8660。

(3)线性质粒pij8660，与(1)中合成基因seqidno：1进行gibson组装：10μlgibsonassemblymastermix(2x)(neb，usa)、将上述线性质粒pij8660、seqidno∶1按摩尔比1∶3的比例加入，使用无菌水将反应液定容至20μl，50℃下保温1h。

(4)将步骤(3)获得的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，经37℃培养16h后，挑取阳性克隆经测序验证正确后获得重组质粒pij8660-sfgfp-huti(图谱如图12所示)。

2.细胞裂解液的制备

用1l的2*yt培养基(16g蛋白胨，10g酵母提取物，5g氯化钠，7gk2hpo4，3gkh2po4，ph＝7.2)培养大肠杆菌bl21(de3)，37℃、220rpm培养至od600值到达0.6-0.8，加1mm的异丙基-β-d硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导表达t7rna聚合酶，培养至od600到达3-3.5时，5000g离心15min收菌，弃上清。使用buffera(10mmtrisbase，14mm醋酸镁，60mm谷氨酸钾，2mmdtt，ph＝8.2)洗涤菌体3次，称细胞湿重，放-80℃冰箱保存。取1.1mlbufferb(10mmtrisbase，14mm醋酸镁，60mm谷氨酸钾，1mmdtt，ph＝8.2)重悬1g菌体，用高压均质机破碎，4℃、12000g离心10min，取上清37℃静置孵育30min后4℃、12000g离心10min，取上清作为大肠杆菌裂解物。储存至-80℃冰箱直到细胞裂解液使用。

3.连续式无细胞蛋白表达体系溶液的制备

3-1：反应体系的溶液的制备

所述表达系统成分如下：10ng/μlpij8660-sfgfp-huti模板、10mm磷酸盐缓冲液、1.2mmatp、0.85mmutp、0.85mmctp、0.85mmgtp、280mm谷氨酸钾、8mm谷氨酸镁、2.7mm草酸钾、2mm氨基酸混合物、体积比25％的大肠杆菌抽提物。

3-2：补充体系的溶液的制备

所述补充溶液成分如下：10mm磷酸盐缓冲液、1.2mmatp、0.85mmutp、0.85mmctp、0.85mmgtp、280mm谷氨酸钾、8mm谷氨酸镁、2.7mm草酸钾、2mm氨基酸混合物、体积比25％的bufferb。反应体系与补充体系的体积比为1∶10。

4.连续交换式无细胞蛋白表达sfgfp-huti蛋白表达

取100μl反应体系加入透析管，在2ml灭菌离心管中加入1ml的补充溶液，将透析管置于离心管中确保透析膜与补充溶液接触，反应温度维持在30℃。表达24h后将反应体系取出离心，分离上清和沉淀，上清中含有表达的荧光蛋白。

5.测定荧光蛋白sfgfp-huti的产量

取10μl纯化的荧光蛋白样品加入到96孔细胞培养板中并向其中加入90μl磷酸缓冲液，用酶标仪测得sfgfp-huti蛋白的荧光值为8.2×10⁴。

实施例1

参阅图2、图3和图4，本发明的一个实施例提供的一种蛋白生产装置，包括反应单元、物料补充单元和物质交换单元12，其中，物质反应单元包括反应室2，反应室2与液相无细胞蛋白合成反应体系的供应设备8连通，液相无细胞蛋白合成反应体系能够在反应室2内连续流动并进行蛋白合成反应；物料补充单元包括补充室4，补充室4与液相物料补充体系的供应设备9连通，液相物料补充体系能够在所述补充室内连续流动；物质交换单元12包括透析膜3，透析膜3用于将反应室2与补充室4分隔，液相无细胞蛋白合成反应体系中产生的抑制蛋白合成反应的副产物以及二氧化碳等废气能够连续穿过透析膜3而被去除，以及，液相物料补充体系中的蛋白合成反应所需底物能够连续透过透析膜3而补充入反应单元。

在本实施例中，蛋白生产装置包括一整体腔室，整体腔室被透析膜3分隔为反应室2和补充室4，且整体腔室的外侧通过固定单元1固定；透析膜3选用具有褶皱的透析膜，整体腔室的室壁由聚二甲基硅氧烷(pdms)形成，固定单元1选用聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)板。

具体实施过程中，液相无细胞蛋白合成反应体系的供应设备8的出口经蠕动泵10与反应室2的反应液入口2-1连通，液相无细胞蛋白合成反应体系的供应设备8的入口与反应室2的反应液出口2-2连通；液相物料补充体系的供应设备9的出口经蠕动泵10与补充室4的补充液入口4-2连通，液相物料补充体系的供应设备9的入口与补充室4的补充液出口4-1连通；其中，反应液入口2-1与反应液出口2-2之间形成曲线型流道，补充液入口4-2与补充液出口4-1之间形成曲线型流道，如s型流道。

固定单元1上还具有与反应液入口2-1、反应液出口2-2、补充液入口4-1与补充液出口4-2分别对应设置的第一接口1-1、第二接口1-2、第三接口1-3和第四接口1-4，且通过螺丝1-5将整体腔室固定。

本实施例实施了由图2、图3和图4所示出的连续交换式方法，使用大肠杆菌提取物实施了蛋白质的合成，具体步骤如下：

1.表达载体

取对比例中的重组质粒pij8660-sfgfp-huti作为表达载体。

2.细胞裂解液的制备

用1l的2*yt培养基(16g蛋白胨，10g酵母提取物，5g氯化钠，7gk2hpo4，3gkh2po4，ph＝7.2)培养大肠杆菌bl21(de3)，37℃、220rpm培养至od600值到达0.6-0.8，加1mm的异丙基-β-d硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导表达t7rna聚合酶，培养至od600到达3-3.5时，5000g离心15min收菌，弃上清。使用buffera(10mmtrisbase，14mm醋酸镁，60mm谷氨酸钾，2mmdtt，ph＝8.2)洗涤菌体3次，称细胞湿重，放-80℃冰箱保存。取1.1mlbufferb(10mmtrisbase，14mm醋酸镁，60mm谷氨酸钾，1mmdtt，ph＝8.2)重悬1g菌体，用高压均质机破碎，4℃、12000g离心10min，取上清37℃静置孵育30min后4℃、12000g离心10min，取上清作为大肠杆菌裂解物。储存至-80℃冰箱直到使用细胞裂解液。

3.连续式无细胞蛋白表达体系溶液的制备

3-1：反应体系的溶液的制备

所述表达系统成分如下：10ng/μlpij8660-sfgfp-huti、10mm磷酸盐缓冲液、1.2mmatp、0.85mmutp、0.85mmctp、0.85mmgtp、280mm谷氨酸钾、8mm谷氨酸镁、2.7mm草酸钾、2mm氨基酸混合物、体积比25％的大肠杆菌抽提物。

3-2：补充物料体系的溶液的制备

所述补充溶液成分如下：10mm磷酸盐缓冲液、1.2mmatp、0.85mmutp、0.85mmctp、0.85mmgtp、280mm谷氨酸钾、8mm谷氨酸镁、2.7mm草酸钾、2mm氨基酸混合物、体积比25％的bufferb。反应体系与补充物料体系的体积比为1∶10。

4.连续交换式无细胞蛋白表达sfgfp-huti蛋白表达

将合成荧光蛋白质的3ml反应体系和30ml补充液体系分别连续注入到液相无细胞蛋白合成反应体系的供应设备8和液相物料补充体系的供应设备9通过蠕动泵10将反应室2和补充室4充满，其中反应室2和补充室4通过透析膜3相联通，反应液通过蠕动泵10在反应单元循环，蠕动速度1.5ml/min，反应温度维持在30℃。表达24h后将反应体系取出离心，分离上清和沉淀，上清中含有表达的荧光蛋白。

5.纯化sfgfp-huti蛋白

取500μl镍柱，6000g离心30s，去除上清；用250μl磷酸缓冲液重悬镍柱，6000g离心30s重复洗涤2次，向反应体系上清加入500μl洗涤的镍柱，4℃在摇床上缓慢摇动1h，以充分结合带his标签的目的蛋白。1h后离心弃上清，加入1ml20mm咪唑洗涤(50mmnah2po4，300mmnacl，20mm咪唑)重悬凝胶，离心弃上清，重复洗涤5次；加入500ul500mm咪唑洗脱液(50mmnah2po4，300mmnacl，500mm咪唑)，轻轻重悬凝胶，离心收集上清液。上清液中即为纯化获得的荧光蛋白。

6.测定荧光蛋白sfgfp的荧光值

取10μl纯化的荧光蛋白样品加入到96孔细胞培养板中并向其中加入90μl磷酸缓冲液，混合均匀后用酶标仪测得sfgfp-huti蛋白的荧光值为2.5×10⁵。

实施例2

参阅图5、图6和图7，本发明的一个实施例提供的一种蛋白生产装置，与实施例1相比，反应室2的室壁上设有向内的柱状突起2-3，补充室4的室壁上设有向内的柱状突起4-3，且半透膜3的两侧也设有柱状突起3-1；其他结构不变。

在反应室2和补充室4上加入了柱状突起的设计，可以扩大它们的比表面积，增大反应物之间的接触面积，以及提高物质交换速度。具体实验方案同实施例1，最后取10μl纯化的荧光蛋白样品加入到96孔细胞培养板中并向其中加入90μl磷酸缓冲液，混合均匀后用酶标仪测得sfgfp-huti蛋白的荧光值为3.2×10⁵。

实施例3

参阅图5、图6和图7，本发明的一个实施例提供的一种蛋白生产装置，与实施例1相比，改变整体腔室的结构，包括一中空结构的反应室5，中空结构的反应室5内设有由透析膜形成的一中空结构的补充室6；一中空结构的反应室5由聚二甲基硅氧烷(pdms)形成，且中空结构的反应室5和中空结构的补充室6的室壁上均设有向内的柱状突起；实施例中，中空结构的反应室5内还设有由透析膜形成的中空通气单元7，中空通气单元7的入口与气源11连通并用于输入包含氧气的工作气体，出口用于排放含二氧化碳的废气。

整体腔室改为中空状反应容器并且加入通气单元7，其中中空结构的反应室5腔室和用以连通中空结构的反应室5与补充室6的透析膜都采用柱状突起的设计，以增大它们的比表面积，提高反应速率和物质交换速率；同时反应室的材质为聚二甲基硅氧烷(pdms)，该材料透气性好，可以促进反应的进行(或者其他任何符合条件的可塑性高的透气疏水材料)。另外新加入的通气单元7也可以加入柱状突起的设计，使其比表面积更大，通气效果进一步提高，加快反应进行，延长反应时间。实验方案同实施例1，最后取10μl纯化的荧光蛋白样品加入到96孔细胞培养板中并向其中加入90μl磷酸缓冲液，混合均匀后用酶标仪测得sfgfp-huti蛋白的荧光值为4.5×10⁵。

对比例和实施例1-3的反应条件及合成蛋白质的荧光值的对比结果，见下表。

由上表可知，通过本发明蛋白生产方法，可优选延长反应可持续时间及提高蛋白的产率。

本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。

在本发明(本发明)案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。

在本发明(本发明)案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。

除非另外具体陈述，否则术语“包含(include、includes、including)”、“具有(have、has或having)”的使用通常应理解为开放式的且不具限制性。

应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。

此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。

尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。