一种异色瓢虫多巴脱羧酶DDC及其在催化产5-羟色胺上的应用

本发明涉及分子生物学和生物工程
技术领域：
，具体涉及一种异色瓢虫多巴脱羧酶ddc及其在催化5-羟色胺上的应用。
背景技术：
：5-羟色胺来自于色氨酸的一种吲哚衍生物，简称5-ht。最早是从血清中发现的，因此又名血清素，它广泛存在于哺乳动物组织中，特别在大脑皮层质及神经突触内含量很高，是一种抑制性神经递质。与之类似的生物胺多巴胺和去甲肾上腺素的酶促合成都来自相应的氨基酸5-羟基色氨酸和3.4-二羟基苯丙氨酸(多巴)的脱羧。脑内5-羟色胺含量降低将导致抑郁等常见心境障碍；黑质和纹状体病变致使多巴胺合成减少还可导致帕金森症发生。在微生物法两步催化色氨酸生产5-羟色胺的研究中，大多数研究人员仍利用催化作用不具有专一性的色氨酸脱羧酶对5-羟基色氨酸进行脱羧，由于该脱羧酶同时会作用于色氨酸，且对色氨酸的催化能力要强于5-羟基色氨酸，因此在生产5-羟色胺时会产生不必要的副产物，同时造成5-羟色胺产量偏低。因此，找到一种可以只催化5-羟基色氨酸，而对色氨酸没有催化能力的脱羧酶具有重要意义。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种异色瓢虫多巴脱羧酶ddc及其在催化5-羟色胺上的应用，所述多巴脱羧酶ddc的基因来源于异色瓢虫harmoniaaxyridis（genbank:amq13055.1）。为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：一种异色瓢虫多巴脱羧酶ddc，其核苷酸序列如seqidno.1，所示。上述异色瓢虫多巴脱羧酶ddc，其氨基酸序列如seqidno.2所示。一种重组质粒，含有权利要求1所述的异色瓢虫来源多巴脱羧酶的核苷酸序列。一种重组载体，表达上述异色瓢虫来源多巴脱羧酶的核苷酸序列的重组质粒。一种重组菌株，所述重组菌株转化了上述重组载体。上述异色瓢虫来源多巴脱羧酶、重组质粒、重组载体或重组菌株在催化5-羟色胺上的应用。上述异色瓢虫来源多巴脱羧酶在催化5-羟色胺上的应用，具体包括以下步骤：步骤1，设计引物，并利用pcr扩增seqidno.1所示的核苷酸序列；步骤2，构建质粒载体如pet24a-ddc将pcr扩增的dna序列和pet24a载体用同样的限制性内切酶ndei和hindⅲ进行双酶切，用t4dna连接酶来连接纯化的酶切产物，得到质粒载体pet24a-ddc；步骤3，构建克隆菌株pet24a-ddc-e.colitrans1t1将质粒载体pet24a-ddc转化至e.colitrans1t1，得到阳性转化子，经菌落pcr筛选并测序确定为目标菌株；步骤4，构建表达菌株pet24a-ddc-bl21(de3)将目标菌株pet24a-ddc-e.colitrans1t1提取出来的质粒转化至e.colibl21(de3)，挑选阳性转化子直接克隆培养，得到重组表达菌株pet24a-ddc-bl21(de3)；步骤5，体外诱导表达将重组表达菌株pet24a-ddc-bl21(de3)接入5ml含卡那霉素的lb培养基中，于25-40℃过夜培养10-20h后，按1%的接种量接种到100ml含卡那霉素的lb培养基中，当od600=0.4-0.6，加入终浓度为0.5mm-1mm的iptg，于16-25℃，150-250rpm低温诱导20-24h；步骤6，获得多巴脱羧酶体外诱导表达结束后于4℃，6000-12000rpm离心7-10min收集菌体，用pbs缓冲液洗涤菌体三次，再用pbs缓冲液重悬菌体，之后置于冰上超声破碎，每次10-15min，超声2秒间隔3秒，然后于4℃，6000-12000rpm离心7-10min收集上清液，即得粗酶液ddc；步骤7，粗酶液的纯化利用超声过的纯水、50mm和500mm的咪唑先后清洗蛋白纯化仪管路及镍柱，去除其中的杂质，取步骤6所得的粗酶液ddc上柱，再用50mm的咪唑打通管路，目标蛋白具有his标签，可吸附在镍柱上，不带his标签的杂蛋白以及其它杂质被冲洗下来，最后用500mm的咪唑洗脱目标蛋白，收集洗脱液（洗脱液即为纯酶），取少量洗脱液进行8％sds聚丙烯酰胺凝胶电泳；步骤8，催化应用10g/l的5-羟基色氨酸1.2ml，20mm的plp，trishcl7.2缓冲液调节体系ph为7.2，再加入100μl步骤7所得的洗脱液，总体系为2ml，35℃震荡反应，即可得到5-羟色胺。作为改进的是，步骤1中，引物为：上游引物chi-f：5’-catatgatggccttgttgccgttgg-3’，下游引物chi-r：5’-cccaagcttctactttgccgccggaat-3’。有益效果：与现有技术相比，本发明一种异色瓢虫多巴脱羧酶ddc及其在催化5-羟色胺上的应用的优势在于：1、本发明从已报道的异色瓢虫harmoniaaxyridis（genbank:amq13055.1）中获得了异色瓢虫多巴脱羧酶的核苷酸序列，并构建了pet-24a-ddc原核表达载体，成功获得分子量约为50kda的蛋白；该蛋白表达效果好，制备过程简单，为异色瓢虫多巴脱羧酶ddc获得提供了简便方法；2、本发明首次实现了异色瓢虫多巴脱羧酶ddc对5-羟基色氨酸的脱羧来生成5-羟色胺，其转化效率高，可替代色氨酸脱羧酶，在工业化的生物法合成5-羟色胺方面具有良好的应用前景。3、本发明首次利用了专一性催化5-羟基色氨酸而对色氨酸无催化作用的多巴脱羧酶，对于生物法催化色氨酸生成5-羟基色胺具有重要指导意义。附图说明图1为本发明异色瓢虫多巴脱羧酶ddc的sds-page检测结果，其中，m：蛋白标准分子量，1-为ddc蛋白离心得到的沉淀，2-为ddc蛋白离心得到的上清液；3-为ddc上清液经过纯化后的洗脱液。图2为本发明多巴脱羧酶ddc催化5-羟基色氨酸和色氨酸结果分析：（a）5-羟基色氨酸为底物，（b）色氨酸为底物。具体实施方式下面通过实施例对本发明做进一步描述，但不用于限制本发明的保护范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实例中所用到的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1异色瓢虫多巴脱羧酶的扩增本发明根据来自异色瓢虫（harmoniaaxyridis，ku820948）多巴脱羧酶ddc的氨基酸序列（genbank:amq13055.1）设计引物：上游引物chi-f：5’-catatgatggccttgttgccgttgg-3’；下游引物chi-r：5’-cccaagcttctactttgccgccggaat-3’；通过聚合酶链式反应（pcr）的方法获得了多巴脱羧酶ddc保守序列。pcr反应体系：基因组模板0.5μl上游引物（10μm）1μl下游引物（10μm）dntp1μl5×transstartfastpfubuffer10μl2.5mmdntps4μltransstartfastpfudnapolymerase0.5μlddh2oupto50μlpcr反应条件：95℃预变性,2min；95℃变性20s,52℃退火，20s,72℃延伸，2min,共30个循环；72℃后延伸，5min，最后4℃保温。pcr反应结束以1%琼脂糖凝胶电泳检测，在1431bp处有明亮一条带，即为异色瓢虫多巴脱羧酶。其核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明所述的多巴脱羧酶基因编码403个氨基酸，分子量约50kd，具有如seqidno.2所述的氨基酸序列。seqidno.1:aaaacccagtgaaggtaacccccatgtacaacgaggttcagcatgtcaaaacgatcgatctggccccacttcttcttgtcctctgatttaaactcttgcagtagccagaagaacgcttttactctcgctgcagccaaccgtgcctgtccagtctgggaaactgagagttttccgtggagattgttcagtgtgataagtgataagtgataaggaggctgcgtatctattaagtggattgttggatatccttttatttatttgagatttaaagagatggaggctaatcagtttagggacttcggaaaggcgatgatagactacgtcgccaattatctggagaatataagggagaggcgggttttgcctactgtagaaccagggtatttacgtcctctacttcccagtgaggcaccacaaaaacctgacacatggcaagaagttatggctgacattgaaaaagtcattatgcctggagttacacactggcattcaccaaagtttcatgcatattttcctactgccaactcctatcctgctattgtagcagatattctcagtgatggtattgcttgcatcggtttttcatggatcgcaagtcccgcttgcaccgaactcgaagtcgtgatgatggactggttgggaaaaatgataggtctcccagaggaattcctcgcttgttcagggggtaaggggggcggcgtaatccaggggactgcgagtgaagctacgctagttgccttgcttggagccaaagcacgtgccattcatcatgtgaaaaaagaacacccagattggaaagatgccgatatagccgagaaattggtgggatacacttctagtcaaagtcattcttcggttgaacgagctggtcttcttggtggtgttaagttaagaggtctacccacagacgaatcaaaccgactacgaggggacactttagaaagggcaatcaaggaggatagagaagctggccttattccattttacgttgtcgccaccctgggaacaacctcatcctgcacctttgacaaccttgaagagatcggtcccgtgtgtaatgttaacaaggtgtggctccacatcgacgccgcttacgcaggcgcagccttcacttgtcccgagtacaggtatctgatgaagggcgtagagatggccgattcctttgacttcaacccgcacaaatggatgttggtcacatttgactgttctgcaatgtggctcaaagaccccaactggctcgtggatgccttcaatgttgaccccctctacttgaaacacgaccaacaaggctcagcaccggattacagacactggcagattcagctcggccgtaggttcagagctctcaagatttggtttgtcttgagattgtacggagtcgagaacatccagaagcatatacggaagcagattgggcttgcacaccatttcgaagatttggtcaagtcggacgataggttcgaggtaactgaggaggtgcttatgggtttggtgtgcttcaggctaaagggccagtcgaacgaagtcaacgaacgacttctgaagaggatcaacgcaaggggtaccatacatttggttccttctaagataagagaaatgtactttttgagaatggctgtatgctctaggttaactgagaaggaagacatggatttatcatggaaagaagtacgggaatctgctgatgatattttgggagagtagaaaatgaatgaattttaggtgcatctgttatacctcaacatgtattcctgccacataataacgattaataattatttataaattatttattgcaataaatgtatatatgtatgtgttggaaggaccaataaaaaacagctaaattatgtattgtacaagtaaatataattgttgaagcacttatgaagaataaactcgaatttttacataacatagcgatcaatcaaaatgacaagttcatgatttctseqidno.2meanqfrdfgkamidyvanylenirerrvlptvepgylrpllpseapqkpdtwqevmadiekvimpgvthwhspkfhayfptansypaivadilsdgiacigfswiaspactelevvmmdwlgkmiglpeeflacsggkgggviqgtaseatlvallgakaraihhvkkehpdwkdadiaeklvgytssqshssveragllggvklrglptdesnrlrgdtleraikedreaglipfyvvatlgttssctfdnleeigpvcnvnkvwlhidaayagaaftcpeyrylmkgvemadsfdfnphkwmlvtfdcsamwlkdpnwlvdafnvdplylkhdqqgsapdyrhwqiqlgrrfralkiwfvlrlygveniqkhirkqiglahhfedlvksddrfevteevlmglvcfrlkgqsnevnerllkrinargtihlvpskiremyflrmavcsrltekedmdlswkevresaddilge实施例2质粒载体pet24a-ddc及克隆菌株pet24a-ddc-e.colitrans1t1的制备1、使用takara公司试剂盒（takaradnaligationkit<mightymix>）对实施例1得到的pcr产物进行纯化回收，；2、构建质粒载体pet24a-ddc将pcr扩增的dna序列和pet24a载体用同样的限制性内切酶ndei和hindⅲ进行双酶切，酶切产物经回收纯化，并用t4dna连接酶连接，得到质粒载体pet24a-ddc；连接反应体系：ddc基因的pcr产物6μlpet24a1μl5×buffer2μlt4dna连接酶1μl连接反应的条件为：16℃过夜连接，构建重组质粒pet24a-ddc。3、获得克隆菌株pet24a-ddc-e.colitrans1t1将质粒载体pet24a-ddc转化至e.colitrans1t1：（1）取冰上冻融的20μl感受态细胞trans1t1，于上述10μl的连接反应液中，轻轻混合均匀；（2）在冰上静置30min后，42℃热激处理45s，然后迅速放置冰上2min；（3）在超净工作台加lb培养基(10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，5g/l氯化钠)800μl，37℃摇床培养1h；（4）4000g离心培养液，涂布于含有卡那霉素的lb平板上，37℃过夜培养，筛选阳性转化子，并测序保证获得目标菌株，然后转至液体培养基培养；（5）用takara公司试剂盒提取大量重组质粒pet24a-ddc，继续下一步表达宿主的转化。实施例3构建重组表达菌株pet24a-ddc-e.colibl21(de3)1.菌株培养：将已构建的重组质粒pet24a-ddc从克隆宿主中提取出来，并将重组质粒转化入e.coli.bl21（de3）感受态细胞中。转化操作如上述实施例2中的转化步骤，最终挑取1-2个单菌落接种到含有卡那霉素终浓度为0.2%的5mllb培养基（lb培养基为现有常规配方）中，37℃过夜培养；2.主培养：培养12h后按1%接种量转移至100mllb/kan培养基中，37℃震荡培养至od600=0.4-0.6；3.诱导表达：加入终浓度为0.25mm的iptg诱导菌体细胞，在18℃下200rpm低温诱导20h；4.收集全细胞：于4℃，6000rpm，离心8-10min收集菌体，并用10mlpbs混匀后于超声波破碎处理10min，至液体呈现透明；5.可溶蛋白酶ddc的提取：将上述菌液于12000rpm，4℃离心5min，取上清液即为可溶蛋白（本发明所述异色瓢虫多巴脱羧酶ddc）。沉淀一般为破碎细胞和少量的本底表达蛋白。6.sds-page电泳检测表达的目的蛋白，具体见图1所示。实施例4纯化异色瓢虫多巴脱羧酶ddc1、清洗蛋白纯化仪管路：将已超声的纯水、50mm（a泵）和500mm（b泵）的咪唑流动相先后清洗蛋白纯化仪管路及镍柱，去除其中的杂质。2、上样：取实施例3获得的粗酶液上柱，用a泵流动相以1-1.5ml/min流速进样，目标蛋白具有his标签，因此可吸附在镍柱上，不带his标签的杂蛋白以及其它杂质不能吸附从而被冲洗下来。3、洗脱获得纯酶：换用b泵以流速2-3ml/min洗脱目标蛋白，此时注意收集洗脱液，洗脱液即为目标蛋白（纯酶），将最后收集得到的洗脱液经过超滤离心后，取样并用8％sds聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，可观察纯化前后多巴脱羧酶的含量发生了变化，具体可见图2。实施例5异色瓢虫多巴脱羧酶ddc催化5-羟基色氨酸生成5-羟色胺1、反应体系：取初始浓度为10g/l的5-羟基色氨酸作为底物，加入20mm的plp，用trishcl7.2缓冲液调节体系ph为7.2左右，再加入15g/l的纯酶，总体系为2ml，35℃震荡反应，每30min取样200μl。样品经过高温煮沸后用0.22μm过滤器过滤后于-20℃冰箱保存待用。2、产物检测：反应12h后，利用高效液相色谱法（采用agilenttc-c18色谱柱（150mm×4.6mm,5μm）；以10mm磷酸盐缓冲液-甲醇（88:12）为流动相；流速1.0ml/min;检测波长为276nm;柱温:室温25℃）检测5-羟色胺的生成情况。经过计算可知，5-羟色胺的产量达到3.4g/l,转化率高达90%以上。实施例6异色瓢虫多巴脱羧酶ddc催化5-羟基色氨酸专一性研究1、反应体系：分别取初始浓度为10g/l的色氨酸，5-羟基色氨酸作为底物，加入20mm的plp，用trishcl7.2缓冲液调节体系ph为7.2左右，再加入15g/l的纯酶，总体系为2ml，35℃震荡反应，每30min取样200μl。样品经过高温煮沸后用0.22μm过滤器过滤后于-20℃冰箱保存待用。同时，以色氨酸为底物作为对照组。2、产物检测：反应12h后，利用高效液相色谱法（采用agilenttc-c18色谱柱（150mm×4.6mm,5μm）；以10mm磷酸盐缓冲液-甲醇（88:12）为流动相；流速1.0ml/min;检测波长为276nm；柱温:室温）检测5-羟色胺的生成情况。检测结果如图2所示：色氨酸为底物的对照组底物无变化，同时无新产物生成；5-羟基色氨酸为底物的实验组，可明显看到5-羟基色氨酸完全消耗完，有新产物5-羟色胺生成。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。序列表<110>南京工业大学<120>一种异色瓢虫多巴脱羧酶ddc及其在催化产5-羟色胺上的应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1952<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aaaacccagtgaaggtaacccccatgtacaacgaggttcagcatgtcaaaacgatcgatc60tggccccacttcttcttgtcctctgatttaaactcttgcagtagccagaagaacgctttt120actctcgctgcagccaaccgtgcctgtccagtctgggaaactgagagttttccgtggaga180ttgttcagtgtgataagtgataagtgataaggaggctgcgtatctattaagtggattgtt240ggatatccttttatttatttgagatttaaagagatggaggctaatcagtttagggacttc300ggaaaggcgatgatagactacgtcgccaattatctggagaatataagggagaggcgggtt360ttgcctactgtagaaccagggtatttacgtcctctacttcccagtgaggcaccacaaaaa420cctgacacatggcaagaagttatggctgacattgaaaaagtcattatgcctggagttaca480cactggcattcaccaaagtttcatgcatattttcctactgccaactcctatcctgctatt540gtagcagatattctcagtgatggtattgcttgcatcggtttttcatggatcgcaagtccc600gcttgcaccgaactcgaagtcgtgatgatggactggttgggaaaaatgataggtctccca660gaggaattcctcgcttgttcagggggtaaggggggcggcgtaatccaggggactgcgagt720gaagctacgctagttgccttgcttggagccaaagcacgtgccattcatcatgtgaaaaaa780gaacacccagattggaaagatgccgatatagccgagaaattggtgggatacacttctagt840caaagtcattcttcggttgaacgagctggtcttcttggtggtgttaagttaagaggtcta900cccacagacgaatcaaaccgactacgaggggacactttagaaagggcaatcaaggaggat960agagaagctggccttattccattttacgttgtcgccaccctgggaacaacctcatcctgc1020acctttgacaaccttgaagagatcggtcccgtgtgtaatgttaacaaggtgtggctccac1080atcgacgccgcttacgcaggcgcagccttcacttgtcccgagtacaggtatctgatgaag1140ggcgtagagatggccgattcctttgacttcaacccgcacaaatggatgttggtcacattt1200gactgttctgcaatgtggctcaaagaccccaactggctcgtggatgccttcaatgttgac1260cccctctacttgaaacacgaccaacaaggctcagcaccggattacagacactggcagatt1320cagctcggccgtaggttcagagctctcaagatttggtttgtcttgagattgtacggagtc1380gagaacatccagaagcatatacggaagcagattgggcttgcacaccatttcgaagatttg1440gtcaagtcggacgataggttcgaggtaactgaggaggtgcttatgggtttggtgtgcttc1500aggctaaagggccagtcgaacgaagtcaacgaacgacttctgaagaggatcaacgcaagg1560ggtaccatacatttggttccttctaagataagagaaatgtactttttgagaatggctgta1620tgctctaggttaactgagaaggaagacatggatttatcatggaaagaagtacgggaatct1680gctgatgatattttgggagagtagaaaatgaatgaattttaggtgcatctgttatacctc1740aacatgtattcctgccacataataacgattaataattatttataaattatttattgcaat1800aaatgtatatatgtatgtgttggaaggaccaataaaaaacagctaaattatgtattgtac1860aagtaaatataattgttgaagcacttatgaagaataaactcgaatttttacataacatag1920cgatcaatcaaaatgacaagttcatgatttct1952<210>2<211>476<212>prt<213>氨基酸序列(aminoacidsequence)<400>2metglualaasnglnpheargasppheglylysalametileasptyr151015valalaasntyrleugluasnilearggluargargvalleuprothr202530valgluproglytyrleuargproleuleuproserglualaprogln354045lysproaspthrtrpglngluvalmetalaaspileglulysvalile505560metproglyvalthrhistrphisserprolysphehisalatyrphe65707580prothralaasnsertyrproalailevalalaaspileleuserasp859095glyilealacysileglyphesertrpilealaserproalacysthr100105110gluleugluvalvalmetmetasptrpleuglylysmetileglyleu115120125progluglupheleualacysserglyglylysglyglyglyvalile130135140glnglythralaserglualathrleuvalalaleuleuglyalalys145150155160alaargalailehishisvallyslysgluhisproasptrplysasp165170175alaaspilealaglulysleuvalglytyrthrserserglnserhis180185190serservalgluargalaglyleuleuglyglyvallysleuarggly195200205leuprothraspgluserasnargleuargglyaspthrleugluarg210215220alailelysgluaspargglualaglyleuileprophetyrvalval225230235240alathrleuglythrthrsersercysthrpheaspasnleugluglu245250255ileglyprovalcysasnvalasnlysvaltrpleuhisileaspala260265270alatyralaglyalaalaphethrcysproglutyrargtyrleumet275280285lysglyvalglumetalaaspserpheasppheasnprohislystrp290295300metleuvalthrpheaspcysseralamettrpleulysaspproasn305310315320trpleuvalaspalapheasnvalaspproleutyrleulyshisasp325330335glnglnglyseralaproasptyrarghistrpglnileglnleugly340345350argargpheargalaleulysiletrpphevalleuargleutyrgly355360365valgluasnileglnlyshisilearglysglnileglyleualahis370375380hisphegluaspleuvallysseraspaspargphegluvalthrglu385390395400gluvalleumetglyleuvalcyspheargleulysglyglnserasn405410415gluvalasngluargleuleulysargileasnalaargglythrile420425430hisleuvalproserlysileargglumettyrpheleuargmetala435440445valcysserargleuthrglulysgluaspmetaspleusertrplys450455460gluvalarggluseralaaspaspileleuglyglu465470475<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3catatgatggccttgttgccgttgg25<210>4<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cccaagcttctactttgccgccggaat27当前第1页12