一株铜绿假单胞菌及其应用

本发明是涉及一株铜绿假单胞菌及其应用，具体说，是涉及一株铜绿假单胞菌yy322及其在防治西红花病原菌中的应用，属于微生物
技术领域：
。
背景技术：
：西红花(crocussativus)是鸢尾科番红花属的多年生花卉，是世界著名染料香料，也是重要的药用植物，具有活血化瘀、凉血解毒和解郁安神的功效，已被我国列入药食同源物质名录，极具开发利用价值。同时由于其药用部位仅为干燥柱头，产量极低，故市场价格极高，质优者达50元左右每克，被誉为“红色金子”，因此对其栽培种植的研究便显得尤为重要。西红花原产于伊朗、希腊、印度和西班牙等地，我国于上世纪80年代开始引种，现在主产区有浙江、上海和安徽，在江苏、河南、河北和江西等地也有栽培。随着西红花的种植面积不断扩大，西红花的连作障碍问题不断加剧，尽管有些地方采用了轮作水稻、玉米和大豆等作物来克服该问题，但每年仍有不少西红花出现球茎腐烂情况，轻者发生率为百分之几，严重者甚至全军覆没，给种植户带来重大损失。目前对于西红花的病害研究相对较少，已报道的西红花病原菌有巴西曲霉(aspergillusbrasiliensis)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、茄病镰刀菌(fusariumsolani)和桔青霉(penicilliumcitrinum)等，本课题组在对上海崇明岛西红花病害情况进行调查分析和病原菌分离鉴定后发现，该地区西红花病害主要分为三种：①红烂病：特征为自球茎基部一侧或全部呈黑腐状，有的病处呈青灰或黄白色，发病轻者与健康球茎外形无异，不易发觉，剥去外层膜质鳞叶后可现红斑，发病重者整个球茎呈黑色或深白色，有的内部中空或呈松散粉末状，气味似腐烂大蒜，导致红烂病的主要致病菌为尖孢镰刀菌，该菌是致病力最强和分布最广的致病菌；②白烂病：特征为外部膜质鳞叶上着生白色绒毛，内部球茎干瘪皱缩，表面不平整，质地坚硬，有的内部中空，呈灰白色或黑色，质量较健康者明显减小，导致白烂病的主要致病菌为茄病镰刀菌；③麻点病：特征为球茎底部凹槽内发黑，明显区别于正常者，剥去膜质鳞叶后可见零散分布的黑斑，黑斑周围呈现微褐色，严重者黑斑连成片，其内部随病变程度的加深，褐变越厉害，其对西红花的伤害并非致命的，仅会造成产量减小，导致麻点病的主要致病菌为柠檬硫酸青霉(penicilliumcitreosulfuratum)和桔青霉。西红花球茎发病后会导致植株叶片发黄、变褐、枯萎而死，严重影响了西红花球茎和花丝的品质和产量，严重降低了西红花的经济价值和使用价值。为了提高西红花球茎以及花丝的产量和品质，从而达到西红花虽然名贵但却可普及享用的目的，西红花球茎腐烂病已成为生产栽培上迫切需要解决的问题。目前对于西红花的病害防治主要依赖于化肥农药，其虽然具有起效迅速、作用持久的优点，但会造成农药残留和污染环境等问题，不仅会影响药材的质量，且与国家绿色发展和生态农业的战略不相符。而生物防治是近年来研究广泛的技术，其因具有绿色环保安全有效的特点而备受推崇，吸引了国内外诸多学者的关注，因此有必要针对西红花的病原菌开展拮抗菌的相关研究。技术实现要素：针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明的目的是提供一株铜绿假单胞菌及其在防治西红花病原菌中的应用。本发明所述的铜绿假单胞菌，分类命名为铜绿假单胞菌(pseudomonaseruginosa)yy322，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2021年03月08日，保藏编号为cctccno：m2021208。进一步说，本发明所述的铜绿假单胞菌的主要形态及生物学特征为：单菌落近圆形，边缘不整齐，较扁平，淡黄绿色，不光滑，不透明，革兰氏染色反应显阴性，且该菌株16srdna序列分析显示其与genbank号为mn611437的铜绿假单胞菌(pseudomonaseruginosa)的一致性为100％。进一步说，本发明所述的铜绿假单胞菌能产生蛋白酶和葡聚糖酶，但不产生几丁质酶和纤维素酶；具有固氮、溶磷、产铁载体和产nh3的作用，但不具备解钾、产吲哚乙酸(iaa)和产acc脱氨酶的能力。经实验证明：本发明所述的铜绿假单胞菌对尖孢镰刀菌的抑制率为73.17％，对茄病镰刀菌的抑制率为62.20％，对柠檬硫酸青霉的抑制率为23.16％，对桔青霉的抑制率为49.14％，并且，该铜绿假单胞菌产生的挥发性气体对尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的抑制率分别为90.24％、89.02％，因此，本发明所述的铜绿假单胞菌及其产生的挥发性气体可用于制备西红花病原菌的拮抗剂以用于防治西红花病害中，所述的西红花病原菌包括尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、桔青霉和柠檬硫酸青霉中的至少一种。与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：本发明的研究结果表明：本发明所述的铜绿假单胞菌及其产生的挥发性气体均对西红花病原菌具有高效拮抗作用，能用于由西红花病原菌引起的西红花病害的防治；并且，本发明的实验还证明：本发明所述的铜绿假单胞菌具有产蛋白酶、产葡聚糖酶、固氮、溶磷、产铁载体和产nh3的作用，表现出良好的促生性能，因此，本发明所述的铜绿假单胞菌可望用作制备防治西红花病害的土壤调理剂或/和肥料，具有广阔应用前景。附图说明图1为实施例1所筛选的yy322菌株对西红花病原菌的抑制效果图，其中：a图是对茄病镰刀菌的抑制效果图，b图是对尖孢镰刀菌的抑制效果图，c图是对柠檬硫酸青霉的抑制效果图，d图是对桔青霉的抑制效果图；图2为本发明所述的yy322菌株的形态特征图；图3为本发明所述的yy322菌株产降解酶的结果图，其中：a图是表示产蛋白酶的结果，b图是表示产葡聚糖酶的结果，c图是表示产几丁质酶的结果，d图是表示产纤维素酶的结果；图4为本发明所述的yy322菌株的促生性能评价结果图，其中：a图是表示固氮能力，b图是表示溶有机磷能力，c图是表示溶无机磷能力，d图是表示产铁载体能力，e图是表示产nh3能力，f图是表示解钾能力，g图是表示产iaa的能力，h图是表示产acc脱氨酶的能力；图5为本发明所述的yy322菌株所产生的挥发性气体对尖孢镰刀菌的抑制效果图，其中：a图是表示处理组，b图是表示对照组；图6为本发明所述的yy322菌株所产生的挥发性气体对茄病镰刀菌的抑制效果图，其中：a图是表示处理组，b图是表示对照组。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备，且除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1：yy322菌株的分离与筛选1)样品的采集采集上海崇明岛(东经121°09′30″～121°54′00″，北纬31°27′00″～31°5l′15″)健康西红花根际土壤，密封于无菌自封袋内，用冰盒运回实验室后，于干净通风处阴干两周，备用。2)细菌的分离与纯化将自然阴干后的土壤用研钵碾碎后，过20目筛，称取5g土样置于盛有45ml无菌水的三角瓶中，并在三角瓶中加少许玻璃珠，然后放置于150rmp摇床上振荡2h及静置1h，再从中吸取1ml放置于盛有9ml无菌水带塞试管中，充分振荡，做成10-2土壤稀释液，以此类推，制成为10-3、10-4、10-5的土壤悬浮液后备用；用无菌移液枪从不同浓度的悬浮液内各吸取200μl，分别加入到na培养基(取蛋白胨10g、nacl5g、牛肉膏3g、琼脂18g，加蒸馏水至1000ml，用玻璃棒搅拌均匀后，于121℃灭菌20min即得)、lb培养基(取蛋白胨10g、酵母膏5g、nacl5g、琼脂18g，加蒸馏水至1000ml，用玻璃棒搅拌均匀后，于121℃灭菌20min即得)，用无菌涂布珠将悬浮液涂布均匀，然后将培养基倒置于30℃条件下培养24h，挑取菌落形态和颜色不同的细菌单菌落，多次划线纯化后，转接至lb斜面培养基上，再培养24h后保存于4℃冰箱中备用。3)拮抗菌的初筛采用平板对峙法将尖孢镰刀菌进行活化培养5d，然后用打孔器在菌落边缘区域打孔制成直径为5mm的病原菌菌饼，将真菌放置到pda平板一侧及经分离纯化得到的细菌放置到pda平板另一侧，相距约2cm，以只放置病原菌菌饼的pda平板作为对照，于28℃培养箱中培养5天，观察pda平板上是否出现拮抗带，以确定对病原菌有抑制作用的拮抗菌。4)拮抗菌的复筛将尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌接种于pda培养基(取马铃薯200g，去皮后加水适量煎煮半小时，八层纱布滤过，向滤液中加葡萄糖20g、琼脂18g、再加蒸馏水至1000ml，用玻璃棒搅拌均匀后，于121℃灭菌20min即得)上于30℃培养箱活化5天，将桔青霉和柠檬硫酸青霉采用分区划线法接种于pda培养基上于30℃培养箱活化2天，以获得单菌落；将初筛得到的拮抗菌接种于lb培养基上，于30℃培养箱内培养24h，然后用打孔器打取直径为5mm的病原菌菌饼，放置到pda平板中央，再用无菌牙签挑取细菌，采用十字交叉法将其点接于菌饼四周，相距2.5cm，以只放置病原菌菌饼的pda平板作为对照，均重复3次，于28℃培养箱中培养7天，然后计算抑制率【抑制率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径×100％)】，以确定目标拮抗菌；本发明将由上述方法得到的目标拮抗菌命名为yy322菌株，其对尖孢镰刀菌的抑制率为73.17％，对茄病镰刀菌的抑制率为62.20％，对柠檬硫酸青霉的抑制率为23.16％，对桔青霉的抑制率为49.14％，具体抑制效果图见图1所示，其中：a图是对茄病镰刀菌的抑制效果图，b图是对尖孢镰刀菌的抑制效果图，c图是对柠檬硫酸青霉的抑制效果图，d图是对桔青霉的抑制效果图。上述yy322菌株已于2021年03月08日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址是武汉大学，保藏编号为cctccno：m2021208。实施例2：yy322菌株的鉴定1)生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，将实施例1筛选得到的yy322菌株接种至lb培养基上培养24h，然后观察拮抗菌的生长情况、菌落形态与颜色、革兰氏染色等形态与生理生化特征。图2为所述yy322菌株的形态特征图，由图2可见：该菌株生长迅速，单菌落近圆形，边缘不整齐，较扁平，淡黄绿色，不光滑，不透明。具体生理生化鉴定结果见表1所示：表1yy322菌株的生理生化特征由表1所示结果可见：所述yy322菌株的氧化酶反应、接触酶反应、脲酶反应、脂酶反应、明胶液化、牛奶凝固、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用等生理生化试验均呈阳性，革兰氏染色反应、mr实验、v-p实验、淀粉水解、h2s产生等生理生化试验均呈阴性。结合以上yy322菌株的形态特征和生理生化特征结果，可初步鉴定yy322菌株为假单胞菌属(pseudomonas)。2)分子鉴定采用细菌dna提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)提取拮抗菌的dna，以此为模板，选择27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ctacggctaccttgttacga-3')对其进行pcr扩增，以获得目的片段，具体pcr反应体系和pcr反应条件分别见表2和表3所示：表2pcr反应体系组成体积(μl)27f(10μmol/l)21492r(10μmol/l)22×phantamaxmastermix25模板dna2ddh2o19表3pcr反应条件将pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至派森诺生物科技股份有限公司进行测序，然后在ncbi网站(nationalcenterforbiotechnologyinformation)上进行blast同源性搜索，结果表明：该菌株与genbank号为mn611437的铜绿假单胞菌(pseudomonaseruginosa)的一致性为100％；结合上述形态和分子鉴定结果，因此鉴定yy322菌株为铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)。实施例3：检测yy322菌株产降解酶的性能3.1、蛋白酶用无菌牙签挑取活化好的yy322菌株点接于蛋白酶检测平板(脱脂奶粉15g，琼脂18g，蒸馏水1l，于115℃灭菌15min)上，3次重复，于30℃培养箱内培养2天后观察，出现清晰透明圈即为阳性。3.2、几丁质酶用无菌牙签挑取活化好的yy322菌株点接于几丁质酶检测平板(nh4h2po41g，kcl0.2g，mgso4·7h2o0.2g，胶体状几丁质10g，琼脂18g，蒸馏水1l，于121℃灭菌20min)上，3次重复，于30℃培养箱内培养2天后观察，出现清晰透明圈即为阳性。3.3、纤维素酶用无菌牙签挑取活化好的yy322菌株点接于纤维素酶检测平板((nh4)2so42g，mgso4·7h2o0.5g，kh2po41g，nacl0.5g，cmc-na2g，刚果红0.4g，琼脂18g，蒸馏水1l，于121℃灭菌20min)上，3次重复，于30℃培养箱内培养2天，往培养皿中加入适量1mg/ml的刚果红溶液染色1h，弃去染液，加入适量1mol/l的nacl溶液洗涤1h，再倒入1mol/l的hcl后观察，出现清晰透明圈即为阳性。3.4、葡聚糖酶用无菌牙签挑取活化好的yy322菌株点接于葡聚糖酶检测平板(燕麦20g煎煮后去渣取汁，酵母浸膏0.1g，刚果红0.1g，nacl0.1g，琼脂18g，蒸馏水1l，于121℃灭菌20min)上，3次重复，后续同3.3。上述检测的结果表明：本发明所述的yy322菌株可以产生蛋白酶和葡聚糖酶，但不产生几丁质酶和纤维素酶，具体检测结果见图3所示，其中：a图是表示产蛋白酶的结果，b图是表示产葡聚糖酶的结果，c图是表示产几丁质酶的结果，d图是表示产纤维素酶的结果。实施例4：评价yy322菌株的促生性能4.1、固氮能力用无菌牙签挑取活化好的yy322菌株点接于无氮培养基(kh2po40.2g，caco30.5g，mgso4·7h2o0.2g，nacl0.2g，caso40.1g，葡萄糖10g，琼脂15g，蒸馏水1l，于121℃灭菌20min)上，3次重复，于30℃培养箱内培养5天后观察，如果可以生长即为阳性。4.2、溶磷能力用无菌牙签挑取活化好的yy322菌株点接于无机磷细菌培养基(葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，nacl0.3g，ca3(po4)25g，mgso40.3g，k2so40.3g，mnso40.03g，feso40.03g，琼脂15g，蒸馏水1l，于121℃灭菌20min)和有机磷细菌培养基(葡萄糖10g，酵母膏0.5g，(nh4)2so40.5g，nacl0.3g，kcl0.3g，mgso40.3g，feso40.03g，mnso40.03g，caco31g，卵磷脂0.2g，琼脂15g，蒸馏水1l，于121℃灭菌20min)上，各3次重复，于30℃培养箱内培养5天后观察，出现溶磷圈即为阳性，溶磷圈直径与菌落直径的比值越大，则溶磷效果越好。4.3、解钾能力用无菌牙签挑取活化好的yy322菌株点接于硅酸盐细菌培养基(蔗糖5g，na2hpo42g，mgso4·7h2o0.5g，caco30.1g，fecl3·6h2o0.005g，钾长石粉1g，琼脂15g，蒸馏水1l，于121℃灭菌20min)上，3次重复，于30℃培养箱内培养5天后观察，出现光滑透明圈即为阳性。4.4、产铁载体能力用无菌牙签挑取活化好的yy322菌株点接于cas培养基(取60.5mg铬奥醇溶于50mlfe3+溶液(1mmol/lfecl3·6h2o，10mmol/lhcl)混合均匀，在搅拌的同时，缓慢加入十六氨基三甲基溴化铵溶液(72.9mg溶于40mlh2o)，调ph至7.0，然后定容至100ml；再将上述溶液与900ml培养基(含琼脂20g，蛋白胨4.5g，葡萄糖9g，牛肉浸膏2.7g，nacl4.5g，ph为7.0)于115℃灭菌20min后混合均匀)上，3次重复，于30℃培养箱内培养5天后观察，出现橘黄色晕圈即为阳性。4.5、产nh3能力将yy322菌株接种到含20ml蛋白胨水(10g/l)的50ml三角瓶里，于30℃摇床200r/min培养2天后，取2ml到试管中，加入0.5mlnessler’s试剂，摇匀后观察，以蛋白胨水作为对照，2次重复，颜色由褐色转为黄色即为阳性。4.6、产iaa能力将yy322菌株接种到含有20mllb液体培养基(内含l-色氨酸100mg·l-1)的50ml三角瓶里，于30℃摇床培养200r/min培养1天后离心，取上清2ml加到试管中，同时加入等体积salkowski比色液(50ml35％hclo4+1ml0.5mol·l-1fecl3)，振荡混匀后观察，以未接菌的lb液体培养基与等体积比色液的混合溶液为对照，2次重复，颜色变红即为阳性。4.7、产acc脱氨酶能力将yy322菌株接种到含有20ml无氮液体培养基(mnso4·7h2o0.2g，caco31g，蔗糖10g，k2hpo4·3h2o0.5g，nacl0.12g，蒸馏水1l，ph7.2)的50ml三角瓶里，于30℃摇床200r/min振荡培养2天，吸取1ml培养液接种至含有20mldf培养基(kh2po44g，na2hpo46g，mgso4·7h2o0.2g，(nh4)2so42g，葡萄糖2g，葡萄糖酸钠2.0g，柠檬酸2.0g，组分一、组分二溶液各0.1ml，再用蒸馏水定容至1l，ph7.2；组分一：mnso4·h2o11.19mg，cuso4·5h2o78.22mg，znso4·7h2o124.6mg，h3bo310.0mg，moo310.0mg溶于100ml无菌水中；组分二：feso4·7h2o100.0mg溶于10ml无菌水中)的50ml三角瓶中，于30℃摇床200r/min振荡培养2天，吸取1ml培养液接种至含有20mladf培养基(acc溶于去离子水后过滤除菌，加到不含(nh4)2so4且灭好菌的df培养基中，acc终浓度为3.0mmol/l)中，摇晃混匀后吸取200μl测其od600，然后继续培养2天，观察培养基内是否出现浑浊，并测其od600，均重复3次，如果两者相差超过0.1即为阳性。上述评价实验的结果表明：本发明所述的yy322菌株具有固氮、溶磷、产铁载体和产nh3的能力，但不具备解钾、产iaa和产acc脱氨酶的能力，具体结果见图4所示，其中：a图是表示固氮能力，b图是表示溶有机磷能力，c图是表示溶无机磷能力，d图是表示产铁载体能力，e图是表示产nh3能力，f图是表示解钾能力，g图是表示产iaa的能力，h图是表示产acc脱氨酶的能力。实施例5：考察yy322菌株所产生的挥发性气体的抑菌效果于同一平板的皿盖中加入lb培养基并划线接种yy322菌株，培养皿中加入pda培养基，于平板中心分别接种直径为5mm的尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌，以不接种yy322菌株的平板为对照，以封口膜封口，并用保鲜膜密封培养皿，3次重复，将平板倒置于28℃培养箱中培养7天，观察实验组病原菌生长的抑制情况，并计算抑制率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径×100％。实验结果表明：本发明所述的yy322菌株所产生的挥发性气体对尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的抑制率分别为90.24％、89.02％，但仍可见两者病原菌菌丝有少许蔓延至整个平板，具体抑制效果图分别见图5和6所示，图5为本发明所述的yy322菌株所产生的挥发性气体对尖孢镰刀菌的抑制效果图，其中：a图是表示处理组，b图是表示对照组；图6为本发明所述的yy322菌株所产生的挥发性气体对茄病镰刀菌的抑制效果图，其中：a图是表示处理组，b图是表示对照组。由本发明的上述研究结果可见：本发明所述的铜绿假单胞菌及其产生的挥发性气体均对西红花病原菌具有高效拮抗作用，能用于由西红花病原菌引起的西红花病害的防治；并且，本发明的实验还证明：本发明所述的铜绿假单胞菌具有产蛋白酶、产葡聚糖酶、固氮、溶磷、产铁载体和产nh3的作用，表现出良好的促生性能；因此，本发明所述的铜绿假单胞菌可望用作制备防治西红花病害的土壤调理剂或/和肥料，具有广阔应用前景。最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。当前第1页12