一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的引物、方法和试剂盒与流程

1.本发明涉及分子生物技术和分子标记技术领域，具体为一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的引物、方法和试剂盒。


背景技术：

2.先天性肾上腺皮质增生(cah)是由一种或多种皮质醇生物合成酶的缺乏引起的，21羟化酶缺乏症(21
‑
hydroxylase deficiency,21
‑
ohd)是先天性肾上腺皮质增生症中最常见的类型，文献报道占cah的90％～95％，遗传方式为常染色体隐性遗传。临床表现有男性化和失盐，出现低血钠、高血钾、循环衰竭、失盐危象,可发生于生后数周内，危及生命。根据临床表现的严重程度分为典型和非典型。典型包括失盐型、单纯男性化；非经典型也称为迟发型21
‑
羟化酶缺陷症，患者只有轻度雄激素过多的临床表现。女性患者在出生时外生殖器正常或轻度阴蒂肥大，没有外生殖器两性畸形。最常见的症状为儿童阴毛提早出现，或年轻女性中表现为严重囊性痤疮、多毛症、多囊卵巢、月经稀发甚至闭经。非经典型21
‑
羟化酶缺陷症女性患者也存在生育能力下降，程度比经典型患者轻。对于21
‑
ohd的基因突变研究，近年来国内外报道逐渐增多，新的突变不断被发现。目前已经报道的突变位点达200个以上，其中，10个常见突变位点见于90％患儿。
3.cyp21a2基因编码酶的细胞色素p450超家族的成员。细胞色素p450蛋白是单加氧酶，可涉及催化药物和胆固醇代谢，类固醇和其他脂质合成的许多反应。该蛋白定位于内质网并在21位羟基化类固醇。它的活性是合成包括皮质醇和醛固酮在内的类固醇激素所必需的。该基因的突变会导致先天性肾上腺增生。一个相关的假基因位于该基因附近。涉及功能基因和假基因的基因转化事件被认为是类固醇21
‑
羟化酶缺乏的许多原因。
4.hsd3b2基因编码的蛋白质是一种双功能酶，可催化delta(5)
‑
ene
‑3‑
beta
‑
hydroxy steroids的氧化转化和ketosteroids的氧化转化。它在所有激素类固醇的生物合成中都起着至关重要的作用。该基因主要在肾上腺和性腺中表达。该基因的突变与ii型3
‑
β
‑
羟类固醇脱氢酶缺乏有关。
5.cyp21a2和hsd3b2基因的突变是导致先天性肾上腺皮质增生的原因之一，基因诊断也成为目前确诊先天性肾上腺皮质增生的重要手段。然而目前公认的先天性肾上腺皮质增生致病基因变异仅针对的是已发现的热点突变，仍有部分变异未作为先天性肾上腺皮质增生防控或治疗的靶点。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的引物、方法和试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的方法，包括以下步骤：
8.a、与人先天性肾上腺皮质增生疾病发病显著相关基因cyp21a2和hsd3b2的目的片段的扩增；
9.b、体系配制；
10.c、反应；
11.d、dna序列测序鉴定。
12.优选的，所述步骤b中体系配制具体如下：
[0013][0014]
优选的，所述步骤c中反应程序为：
[0015]
1)变性的条件，95℃5min；
[0016]
2)退火的条件，(首先95℃30sec，其次59℃30sec，然后72℃30sec)
×
25个循环；
[0017]
3)延伸的条件，72℃5min。
[0018]
优选的，所述步骤d中序列测序在3730xldnaanalyzer上进行。将所测得的序列与ncbi基因组序列对比，鉴定基因突变是否存在。
[0019]
优选的，一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的引物，cyp21a2和hsd3b2基因全部编码区的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为：
[0020]
cyp21a2
[0021]
cyp
‑1‑
f:ccagaaaagggccactctgt
[0022]
cyp
‑1‑
r:actgatgaaggcagctgagg
[0023]
cyp
‑2‑
f:atctggtggggagaaagcag
[0024]
cyp
‑2‑
r:gctgtgaggcaccttgatct
[0025]
cyp
‑3‑
f:agactactccctgctctggaaa
[0026]
cyp
‑3‑
r:ggcccataactggggtatgc
[0027]
cyp
‑4‑
f:caaggtggggactgtacgtg
[0028]
cyp
‑4‑
r:ggatgtcgtagccggagatg
[0029]
cyp
‑5‑
f:gagggttggggatgagtgag
[0030]
cyp
‑5‑
r:gaacgggaagagcagatggg
[0031]
hsd3b2
[0032]
hsd
‑1‑
f:aagctccagtccttcctcca
[0033]
hsd
‑1‑
r:gacatggctgcctctcaagt
[0034]
hsd
‑2‑
f:acacatgctgatttctgtgcttt
[0035]
hsd
‑2‑
r:agccttgaactccccagtca
[0036]
hsd
‑3‑
f:atctgtgcatgtggttgcag
[0037]
hsd
‑3‑
r:tgccttctgtatgaagccagg。
[0038]
优选的，一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的试剂盒，该试剂盒包括引物、反应体系、分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
[0039]
优选的，所述引物的浓度为100mol/l。
[0040]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过检测致病基因cyp21a2和hsd3b2的基因变异来辅助先天性肾上腺皮质增生疾病的筛查，具有可靠的特异性。在大约95％的情况下，肾上腺皮质带状区的21
‑
羟化作用受损，检测方法具有可重复性。
附图说明
[0041]
图1为本发明可疑基因变异位点的一代测序验证结果示意图；
[0042]
图2为本发明正向sanger测序结果示意图；
[0043]
图3为本发明反向sanger测序结果示意图。
具体实施方式
[0044]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0045]
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0046]
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0047]
实施例一：
[0048]
请参阅图1
‑
3，本发明提供如下技术方案：一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的方法，包括以下步骤：
[0049]
a、与人先天性肾上腺皮质增生疾病发病显著相关基因cyp21a2和hsd3b2的目的片段的扩增；
[0050]
b、体系配制；
[0051]
c、反应；
[0052]
d、dna序列测序鉴定。
[0053]
本发明中，所述步骤b中体系配制具体如下：
[0054][0055]
本发明中，所述步骤c中反应程序为：
[0056]
1)变性的条件，95℃5min；
[0057]
2)退火的条件，(首先95℃30sec，其次59℃30sec，然后72℃30sec)
×
25个循环；
[0058]
3)延伸的条件，72℃5min。
[0059]
本发明中，步骤d中序列测序在3730xldnaanalyzer上进行。将所测得的序列与ncbi基因组序列对比，鉴定基因突变是否存在。
[0060]
本发明中，一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的引物，cyp21a2和hsd3b2基因全部编码区的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为：
[0061]
cyp21a2
[0062]
cyp
‑1‑
f:ccagaaaagggccactctgt
[0063]
cyp
‑1‑
r:actgatgaaggcagctgagg
[0064]
cyp
‑2‑
f:atctggtggggagaaagcag
[0065]
cyp
‑2‑
r:gctgtgaggcaccttgatct
[0066]
cyp
‑3‑
f:agactactccctgctctggaaa
[0067]
cyp
‑3‑
r:ggcccataactggggtatgc
[0068]
cyp
‑4‑
f:caaggtggggactgtacgtg
[0069]
cyp
‑4‑
r:ggatgtcgtagccggagatg
[0070]
cyp
‑5‑
f:gagggttggggatgagtgag
[0071]
cyp
‑5‑
r:gaacgggaagagcagatggg
[0072]
hsd3b2
[0073]
hsd
‑1‑
f:aagctccagtccttcctcca
[0074]
hsd
‑1‑
r:gacatggctgcctctcaagt
[0075]
hsd
‑2‑
f:acacatgctgatttctgtgcttt
[0076]
hsd
‑2‑
r:agccttgaactccccagtca
[0077]
hsd
‑3‑
f:atctgtgcatgtggttgcag
[0078]
hsd
‑3‑
r:tgccttctgtatgaagccagg。
[0079]
本发明中，一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的试剂盒，该试剂盒包括引物、反应体系、分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒；其中，引物的浓度为100mol/l。
[0080]
实施例二：
[0081]
一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的方法，包括以下步骤：
[0082]
a、与人先天性肾上腺皮质增生疾病发病显著相关基因cyp21a2和hsd3b2的目的片段的扩增；
[0083]
b、体系配制；
[0084]
c、反应；
[0085]
d、dna序列测序鉴定。
[0086]
本发明中，所述步骤b中体系配制具体如下：
[0087][0088]
本发明中，所述步骤c中反应程序为：
[0089]
1)变性的条件，95℃5min；
[0090]
2)退火的条件，(首先95℃30sec，其次59℃30sec，然后72℃30sec)
×
25个循环；
[0091]
3)延伸的条件，72℃5min。
[0092]
本发明中，步骤d中序列测序在3730xldnaanalyzer上进行。将所测得的序列与ncbi基因组序列对比，鉴定基因突变是否存在。
[0093]
本发明中，一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的引物，cyp21a2和hsd3b2基因全部编码区的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为：
[0094]
cyp21a2
[0095]
cyp
‑1‑
f:ccagaaaagggccactctgt
[0096]
cyp
‑1‑
r:actgatgaaggcagctgagg
[0097]
cyp
‑2‑
f:atctggtggggagaaagcag
[0098]
cyp
‑2‑
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[0099]
cyp
‑3‑
f:agactactccctgctctggaaa
[0100]
cyp
‑3‑
r:ggcccataactggggtatgc
[0101]
cyp
‑4‑
f:caaggtggggactgtacgtg
[0102]
cyp
‑4‑
r:ggatgtcgtagccggagatg
[0103]
cyp
‑5‑
f:gagggttggggatgagtgag
[0104]
cyp
‑5‑
r:gaacgggaagagcagatggg
[0105]
hsd3b2
[0106]
hsd
‑1‑
f:aagctccagtccttcctcca
[0107]
hsd
‑1‑
r:gacatggctgcctctcaagt
[0108]
hsd
‑2‑
f:acacatgctgatttctgtgcttt
[0109]
hsd
‑2‑
r:agccttgaactccccagtca
[0110]
hsd
‑3‑
f:atctgtgcatgtggttgcag
[0111]
hsd
‑3‑
r:tgccttctgtatgaagccagg。
[0112]
本发明中，一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的试剂盒，该试剂盒包括引物、反应体系、分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒；其中，引物的浓度为100mol/l。
[0113]
实施例三：
[0114]
一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的方法，包括以下步骤：
[0115]
a、与人先天性肾上腺皮质增生疾病发病显著相关基因cyp21a2和hsd3b2的目的片段的扩增；
[0116]
b、体系配制；
[0117]
c、反应；
[0118]
d、dna序列测序鉴定。
[0119]
本发明中，所述步骤b中体系配制具体如下：
[0120][0121]
本发明中，所述步骤c中反应程序为：
[0122]
1)变性的条件，95℃5min；
[0123]
2)退火的条件，(首先95℃30sec，其次59℃30sec，然后72℃30sec)
×
25个循环；
[0124]
3)延伸的条件，72℃5min。
[0125]
本发明中，步骤d中序列测序在3730xldnaanalyzer上进行。将所测得的序列与ncbi基因组序列对比，鉴定基因突变是否存在。
[0126]
本发明中，一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的引物，cyp21a2和hsd3b2基因全部编码区的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为：
[0127]
cyp21a2
[0128]
cyp
‑1‑
f:ccagaaaagggccactctgt
[0129]
cyp
‑1‑
r:actgatgaaggcagctgagg
[0130]
cyp
‑2‑
f:atctggtggggagaaagcag
[0131]
cyp
‑2‑
r:gctgtgaggcaccttgatct
[0132]
cyp
‑3‑
f:agactactccctgctctggaaa
[0133]
cyp
‑3‑
r:ggcccataactggggtatgc
[0134]
cyp
‑4‑
f:caaggtggggactgtacgtg
[0135]
cyp
‑4‑
r:ggatgtcgtagccggagatg
[0136]
cyp
‑5‑
f:gagggttggggatgagtgag
[0137]
cyp
‑5‑
r:gaacgggaagagcagatggg
[0138]
hsd3b2
[0139]
hsd
‑1‑
f:aagctccagtccttcctcca
[0140]
hsd
‑1‑
r:gacatggctgcctctcaagt
[0141]
hsd
‑2‑
f:acacatgctgatttctgtgcttt
[0142]
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‑2‑
r:agccttgaactccccagtca
[0143]
hsd
‑3‑
f:atctgtgcatgtggttgcag
[0144]
hsd
‑3‑
r:tgccttctgtatgaagccagg。
[0145]
本发明中，一种检测先天性肾上腺皮质增生致病基因的试剂盒，该试剂盒包括引物、反应体系、分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒；其中，引物的浓度为100mol/l。
[0146]
受检者可疑基因变异位点的一代测序验证结果：
[0147][0148][0149]
综上所述，本发明通过检测致病基因cyp21a2和hsd3b2的基因变异来辅助先天性肾上腺皮质增生疾病的筛查，具有可靠的特异性。在大约95％的情况下，肾上腺皮质带状区的21
‑
羟化作用受损，检测方法具有可重复性。
[0150]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。