本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种屎肠球菌粉剂的制备方法及其应用。
背景技术：
：屎肠球菌(enterococcusfaecium)在自然界中广泛存在，在空气中、土壤中甚至植物叶片上都可以检测到。屎肠球菌为革兰阳性球菌，肠球属，兼性厌氧菌，无芽孢和鞭毛，生长速度较快，代谢可产生乳酸属于乳酸菌类，大多以短链或双链状排列，为动物肠道正常菌群，在肠内可形成优势菌群。其可以降低肠道内环境ph，维持动物肠道菌群生态平衡，因此可将屎肠球菌用于幼畜的肠道保健和疾病的防疫与医治上。不同屎肠球菌菌株对不同环境中的各种胁迫因子的抗御能力不同，体现出良好的抗逆性，例如耐酸、耐胆盐和耐高温等。屎肠球菌可以与肠道表面紧密接触，相互吸引，发生粘附形成肠道的保护屏障，与肠道发生粘附时，菌株可以发挥益生作用。在饲料中将屎肠球菌作为饲料添加剂加入，可以抑制有害微生物生长活性，使之繁殖能力降低的过程，由此而起到抗菌作用，且安全无毒，无药残，可作为抗生素的替代品。目前，虽然青贮饲料乳酸菌添加剂研究较多，但菌剂的活力不够高，另一方面，生产实践中如何方便快捷的将添加剂添加到青贮饲料中仍未有较为成熟的技术手段，导致研究成果未能广泛的转化应用到生产实践中。技术实现要素：本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种屎肠球菌粉剂的制备方法，工艺简单、成本低，并且制得的屎肠球菌粉剂活力高。技术方案一种屎肠球菌粉剂的制备方法，包括如下步骤：(1)将45g-120g脱脂乳用蒸馏水溶解并定容至800ml，105℃灭菌10-15min，得到脱脂乳溶液；(2)将30g-60g糖类物质用蒸馏水溶解并定容至200ml，115℃灭菌10-25min后，得到糖溶液；所述糖类物质选自蔗糖、海藻糖、麦芽糊精中的一种或两种以上任意比例的组合物；(3)将脱脂乳溶液与糖溶液冷却后混合均匀，得到保护剂，取屎肠球菌菌液，离心后去上清，得到菌体，往菌体中加入保护剂和mrs肉汤培养基，混合均匀后冷冻干燥，得到屎肠球菌粉剂。步骤(3)中，所述屎肠球菌菌液的制备方法：将屎肠球菌菌种以3v％的接种量接种到mrs肉汤培养基中，35-38℃培养36-48h后，得到屎肠球菌菌液。步骤(3)中，所述屎肠球菌为屎肠球菌enterococcusfaeciumf11.1g，已于2020年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为cctccm2020793。该菌株产酸性能显著，菌株活力高，干粉制剂经过二次发酵后仍然保持较好的活力和抑菌效果。进一步，步骤(1)中，所述脱脂乳用量为50g。进一步，步骤(2)中，所述糖类物质为蔗糖和麦芽糊精重量比为1:5的组合物。活力最高。进一步，步骤(3)中，所述保护剂和mrs肉汤培养基的总体积与屎肠球菌菌液的体积比为1:10，保护剂与mrs肉汤培养基的体积比为1:1。进一步，步骤(3)中，所述冷冻干燥是指先在-20℃冷冻6h，然后在-80℃冻12h。上述方法制得的屎肠球菌粉剂作为青贮饲料添加剂的应用。所述应用方法为：往100ml蒸馏水中加入0.5g糖，再加入0.001g柠檬酸，充分溶解后在121℃下灭菌15min，冷却后加入0.5g上述屎肠球菌粉剂，37℃发酵3d后，得到发酵液，将发酵液喷洒到青贮饲料或者二次启封的青贮饲料上，每公斤青贮饲料添加5ml发酵液；所述糖为葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖或麦芽糊精中的一种。屎肠球菌f11.1g菌株的筛选与鉴定：菌株来源：2016年在新疆阿克苏地区、伊犁地区和阿勒泰地区随机采集的发面面肥，样品封于密封袋中，样品贴上标签标明采样时间和地点后运回实验室，于4℃条件下保存备用。筛选方法：在超净工作台中准确称取10g发面面肥，放入90ml无菌蛋白胨水中，密封，置于摇床上以120r/min摇动2h，吸取1ml上清液加入到9ml无菌蛋白胨水中，漩涡振荡，以此稀释成10-5、10-6、10-7、10-8四个梯度，分别取4个梯度的菌液100μl涂布于固体mrs平板培养基上，30℃培养48～72h，根据菌落颜色、大小、光泽、是否有透明圈等挑取单菌落，在mrs固体培养基上划线，恒温培养30℃，48～72h，重复划线分离培养3次，得到纯化的单菌株。用mrs液体培养基富集(30℃，24h)，与等体积的甘油混合，封装，置于超低温冰箱内保存备用。鉴定方法：用细菌提取试剂盒提取细菌dna，并用pcr仪对各个菌株的dna进行扩增，扩增引物为27f和1495r，所使用扩增反应的体系为50μl，体系如下：5μl10×buffer，4μldntpmixture，0.5μltaq酶，2μldna模板，上下游引物(10μmol/l)各1μl，无菌超纯水补足至50μl后进行pcr扩增反应。反应条件：95℃，3min；94℃，1min；53℃，1min；72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸8min，用1％的琼脂糖凝胶电泳对扩增的pcr产物进行检测。将pcr产物回收后，连接pmd-18t载体并转化e.colidh5α，经蓝白斑筛选为阳性克隆后送武汉华大基因科技有限公司测序。利用核酸blast技术，将所测序列与ncbi网站的genbank数据库进行对比，选择与所测序列同源性最高的已知分类地位的菌种。从genbank数据库中下载已知菌株的16srdna基因序列，与所测菌株的16srdna序列一起，采用clustal进行比对，并用mega5.0绘制系统发育树，确定该菌株为屎肠球菌。本发明的有益效果：本发明首先提供了一种屎肠球菌f11.1g，其具有较好的抑制大肠杆菌、黄曲霉菌和金黄色葡萄球菌的作用，本发明将其制成屎肠球菌干粉，干粉的活力为6x109cfu/ml以上，经过与糖溶液和柠檬酸混合物经过37℃发酵3d后ph均低于3.9，且屎肠球菌活力保持在2x108cfu/ml以上，持续时间可达24h，在青贮饲料中喷洒后具有良好的抑制霉菌生长效果，具有良好的应用前景。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。下述实施例中，所述脱脂乳为高蛋白脱脂高钙奶粉，购于内蒙古伊利实业集团股份有限公司，但不限于此。下述实施例中，采用的屎肠球菌为屎肠球菌enterococcusfaeciumf11.1g，已于2020年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为cctccm2020793。采用的屎肠球菌菌液的制备方法：将屎肠球菌菌种以3v％的接种量接种到mrs肉汤培养基中，37℃培养36h后，得到屎肠球菌菌液。实施例1一种屎肠球菌粉剂的制备方法，包括如下步骤：(1)将50g脱脂乳用蒸馏水溶解并定容至800ml，105℃灭菌10min，得到脱脂乳溶液；(2)将10g蔗糖和50g麦芽糊精用蒸馏水溶解并定容至200ml，115℃灭菌20min后，得到糖溶液；(3)将脱脂乳溶液与糖溶液冷却后混合均匀，得到保护剂，取屎肠球菌菌液，将菌液离心后去上清，得到菌体，往菌体中加入保护剂和mrs肉汤培养基(保护剂与mrs肉汤培养基的体积比为1:1)，保护剂和mrs肉汤培养基的总体积与离心前屎肠球菌菌液的体积比为1:10，混合均匀后冷冻干燥(先在-20℃冷冻6h，然后在-80℃冻12h)，得到屎肠球菌粉剂。屎肠球菌粉剂活力的测试：将屎肠球菌粉剂使用无菌水复溶到冷冻抽干前的体积，吸取1ml上清液加入到9ml无菌水中，漩涡振荡，以此稀释成10-8、10-9、10-10三个梯度，分别取3个梯度的菌液100μl涂布于固体mrs平板培养基上，30℃培养48-72h后，计算活力。经测试，实施例1的屎肠球菌粉剂的活力为4.41x1010cfu/ml。实施例2一种屎肠球菌粉剂的制备方法，包括如下步骤：(1)将120g脱脂乳用蒸馏水溶解并定容至800ml，105℃灭菌10min，得到脱脂乳溶液；(2)将20g蔗糖和20g海藻糖用蒸馏水溶解并定容至200ml，115℃灭菌20min后，得到糖溶液；(3)将脱脂乳溶液与糖溶液冷却后混合均匀，得到保护剂，取屎肠球菌菌液，将菌液离心后去上清，得到菌体，往菌体中加入保护剂和mrs肉汤培养基(保护剂与mrs肉汤培养基的体积比为1:1)，保护剂和mrs肉汤培养基的总体积与离心前屎肠球菌菌液的体积比为1:10，混合均匀后冷冻干燥(先在-20℃冷冻6h，然后在-80℃冻12h)，得到屎肠球菌粉剂。经测试，实施例2的屎肠球菌粉剂的活力为3.47x1014cfu/ml。将实施例1制得的屎肠球菌粉剂作为青贮饲料添加剂进行应用测试：实验方法：第一步：往100ml蒸馏水中加入0.5g糖(组1-组5分别为葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糊精，以未加糖的作为对照组)，再加入0.001g柠檬酸，充分溶解后在121℃下灭菌15min，冷却后加入0.5g实施例1制得的屎肠球菌粉剂，37℃发酵3d后，得到六组发酵液，检测溶液ph，并采用稀释梯度法检测屎肠球菌活力。六组发酵液的活力及ph测试结果见表1：表1组别0.5％糖溶液活力37℃发酵3d后ph对照100ml蒸馏水00组10.5g葡萄糖+100ml蒸馏水2x108cfu/ml3.29组20.5g乳糖+100ml蒸馏水4.2x108cfu/ml3.89组30.5g蔗糖+100ml蒸馏水6x108cfu/ml3.35组40.5g海藻糖+100ml蒸馏水6x108cfu/ml3.85组50.5g麦芽糊精+100ml蒸馏水2.52x108cfu/ml3.85第二步：采集新鲜的全株玉米，除去泥土等杂质，使原料水分含量保持在65-70％，将全株玉米切短至1-2cm，作为备用全株玉米青贮原料用。将表1制作好的5组屎肠球菌发酵液，经测试乳酸菌菌种活力大于1×108cfu/ml，按照接种总量为5ml/kg青贮原料，以均匀喷洒的方式喷洒在青贮玉米原料上并混合均匀(对照组为不添加屎肠球菌发酵液的青贮饲料，喷洒的是蒸馏水)，然后将青贮原料在常温密封条件下保存30d，在发酵15d和30d后检测玉米青贮中微生物数量、营养指标和有机酸含量，其中，微生物数量测试结果见表2，营养成分含量变化见3和表4，有机酸含量见表5，同时进行发酵15d和30d启封后的连续7d的二次有氧发酵检测，检测了有氧暴露后的霉菌毒素含量(黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素)，采用霉菌试剂盒进行检测，测试结果见表6：表2发酵过程中微生物数量变化(cfu·g-1)表3发酵过程中dm、cp、ee、wsc的含量变化表4发酵过程中ndf、adf的含量变化表5发酵过程中有机酸含量的变化(mg·ml-1)表6青贮有氧暴露后aft、zen、ota含量变化由表2-6的测试结果可以看出，添加屎肠球菌制剂的处理组(组1-组5)的玉米青贮在发酵过程中产生的乳酸菌数量显著高于未添加屎肠球菌的对照组的玉米青贮，且各处理组的乳酸(la)含量显著高于对照组，对照组发酵的15d和30d，以及组2在发酵15d时检测出丁酸含量，其余处理组均未检测出丁酸；各处理组中的干物质(dm)、可溶性糖(wsc)、中性洗涤纤维(ndf)和酸性洗涤纤维(adf)含量均呈下降状态；通过测定有氧暴露7d中黄曲霉毒素(aft)、玉米赤霉烯酮(zen)和赭曲霉毒素a(ota)的含量发现，在有氧暴露的7d中，各处理组较对照组的3种霉菌毒素含量均显著下降。当前第1页12