一种包含狂犬病毒糖蛋白的感染性克隆及应用

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种包含狂犬病毒糖蛋白的感染性克隆及应用。

背景技术：

狂犬病是由狂犬病病毒(rabiesvirus,rabv)引起的以中枢神经系统感染为特征的人畜共患传染病。对于狂犬病，没有特效的治疗方法或药物，但疫苗的预防接种能有效地防止狂犬病的发生与传播。

目前研究较多的狂犬病疫苗主要包括弱毒疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗和反向遗传技术构建的重组疫苗。其中应用比较广泛的是弱毒疫苗和灭活疫苗。弱毒疫苗主要被欧美等发达国家用于野生动物及发展中国家的家养动物的肌肉注射或口服免疫预防，弱毒疫苗免疫后可以在体内诱导较强和持久的免疫反应，但弱毒疫苗存在毒力返强的可能，出于安全性考虑，弱毒疫苗在我国没有得到广泛的应用。人用狂犬病疫苗以及北美、澳洲和欧洲等国家和地区的宠物狂犬病疫苗多为安全的灭活疫苗，灭活疫苗一般需要添加佐剂，且需要免疫3-5次才能达到较好的免疫效果。dna疫苗、亚单位疫苗由于免疫效果差和生产成本高等问题，没有得到广泛应用。表达细胞因子、趋化因子或双份g蛋白的重组狂犬病活疫苗可以增强免疫效果或者延长免疫持续时间，但是存在安全问题，也没有得到广泛应用。痘病毒载体或腺病毒载体表达狂犬g蛋白的重组活载体疫苗在动物体内不会复制，安全性较好，并且可以产生较高的抗体水平，是比较理想的狂犬病疫苗，但该重组疫苗针对痘病毒或腺病毒产生的抗体会降低相应载体疫苗再次免疫后产生的免疫效果，且不适合与人类密切接触的动物的免疫。以上狂犬病疫苗均存在着成本高、安全性低、或免疫效果差等方面的不足，因此开发成本低廉、高效安全的新型狂犬病疫苗迫在眉睫。

semliki森林病毒(semlikiforestvirus,sfv)是甲病毒属(alphavirus)、披膜病毒科(togavirusfamily)的成员，同属的还有辛德毕斯病毒(sindbisvirus,sin)和委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelanequineencephalitisvirus,vee)等30个成员。sfv是单股、正链的rna病毒，基因组约为12kb。病毒进入宿主细胞后，以基因组rna为模板翻译出病毒的复制酶，即非结构蛋白1-4(nonstructureprotein1-4，nsp1-4)，启动基因组rna(genomicrna,grna)的复制，基因组复制后，以互补链为模板复制出的亚基因组信使rna(subgenomicmrna,sgrna)编码病毒的结构蛋白，即一个衣壳蛋白(capsidprotein)和两个纤突糖蛋白(spikeglycoproteins)，衣壳蛋白包裹基因组rna形成核衣壳，纤突蛋白包裹核衣壳，从细胞中释放出来。1991年，liljestriim和garoff构建了基于sfv基因组的cdna载体psfv1-3，该系列载体保留了sfv非结构蛋白的编码序列，删除了sfv结构蛋白的编码序列，并在删除区域加入了克隆位点方便外源蛋白的插入，该cdna载体体外转录后获得的grna转染细胞后启动病毒grna的复制，复制过程产生大量的sgrna，从而大量表达插入的外源蛋白。辅助质粒(psfv-helper1)体外转录获得的rna转染细胞后可以翻译出sfv的结构蛋白，形成包含grna和外源蛋白的病毒样颗粒，由于辅助质粒转录出的rna缺少包装信号，形成的感染性颗粒仅可以进行一轮的细胞感染，保证了其作为疫苗使用的安全性，此后，利用sfv载体表达外源蛋白成为了疫苗研究的热点。以sfv为载体的可以连续传代的病毒样囊泡最早发现于1994年，rolls,m.m.等将编码水疱性口炎病毒g蛋白(vesicularstomatitisvirusglycoprotein,vsv-g)的序列插入psfv-1载体中，体外转录后转染bhk-21细胞，在没有辅助质粒的帮助下，成功获得了仅含有vsv-g一种结构蛋白的病毒样囊泡(virus-likevesicles,vlvs)，该vlvs可以在bhk-21细胞上连续传代。该研究首次尝试插入狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein,rabv-g)编码序列，也成功获得了可以在细胞上增殖的vlvs，但是滴度不高。2008年，rose,n.f.等验证了sfv-vsvg免疫小鼠后具有保护作用。2014年，rose,n.f.等将vlvs-vsvg在bhk-21细胞上连续50次传代，使得其滴度提高了约1,000倍，测序发现sfv-vsvgp50的非结构蛋白(nsp1-4)的氨基酸存在10处点突变。

至今，形成感染性vlvs的机制尚不清楚。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种包含狂犬病毒糖蛋白的感染性克隆，所述的感染性克隆的核苷酸序列为seqidno.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种包含狂犬病毒糖蛋白的感染性克隆在拯救出高滴度的狂犬病毒样囊泡中的应用，拯救出的狂犬病毒样囊泡可用于制备狂犬疫苗

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种包含狂犬病毒糖蛋白的感染性克隆，其筛选过程如下：

首先将semliki森林病毒载体(psfv3，购自addgene)中的sp6启动子替换成了cmv启动子，并在多聚腺苷酸尾后面插入丁肝病毒核酶序列(hdvrz)和牛生长素多聚腺苷酸化信号序列(bghpoly(a)signal)以简化狂犬病病毒样囊泡的拯救步骤，在该载体中的非结构蛋白编码区引入10处碱基突变，在多克隆位点插入狂犬病毒疫苗毒株lbnse真核表达密码子优化后的g基因序列，从而获得了vlvs-p50r-rvg(vlvs-p50r)的反向遗传操作系统。将该反向遗传操作系统直接转染bhk-21细胞进行病毒拯救，拯救获得的vlvs可以在bhk-21细胞上连续传代，滴度约为10⁶ffu/ml。将vlvs-p50r在bhk-21细胞上连续传代，每隔5代检测病毒滴度，传至25代时，其滴度有了显著的提高，25代vlvs-p50r(vlvs-p50r-p25)滴度高达10⁸ffu/ml，通过测序发现vlvs-p50r-p25在基因组上有9个碱基突变，其中4处可以引起氨基酸的改变，5处为无意义突变。于是申请人在vlvs-p50r的基础上，引入了上述4处有意义突变，构建了vlvs-p50r-p25r的反向遗传操作系统，即pcmv-p50r-p25r-rvg感染性克隆，该感染性克隆的核苷酸序列为seqidno.1所示，利用该感染性克隆进行了病毒样囊泡的拯救，获得的病毒样囊泡vlvs-p50r-p25r与vlvs-p50r-p25表现出相似的增殖特征,滴度达到了10⁸ffu/ml。

本发明的保护内容还包括，pcmv-p50r-p25r-rvg感染性克隆或其拯救出的病毒样囊泡在制备狂犬病疫苗中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明构建的狂犬病病毒样囊泡所使用的反向遗传技术操作简单，成功率高，只需转染一个质粒就可以进行病毒拯救。

2.本发明拯救的狂犬病病毒样囊泡可以在bhk-21细胞上传代稳定，增殖快速，毒价高达10⁸ffu/ml，可以作为理想的狂犬病候补疫苗株。

附图说明

图1包含狂犬病毒糖蛋白的感染性克隆的构建过程。

图2狂犬病毒样囊泡vlvs-p50r的间接免疫荧光和连续传代过程中的病毒滴度；

a：vlvs-p50r感染bhk-21细胞后24h和48h的间接免疫荧光；

b：vlvs-p50r在bhk-21细胞上连续传25代后，每隔5代的病毒滴度。

图3vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25及vlvs-p50r-p25r的荧光斑扩散和生长曲线；

a：bhk-21细胞以moi＝0.001分别接种vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25及vlvs-p50r-p25r不同时间段后的荧光斑扩散；

b：bhk-21细胞以moi＝0.001分别接种vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25及vlvs-p50r-p25r不同时间段后荧光斑的平均光密度；

c：bhk-21细胞以moi＝0.01分别接种vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25及vlvs-p50r-p25r后的生长曲线。

图4vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25的蛋白表达；

a：sds-page检测纯化后的vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25的蛋白表达；

b：westernblot检测vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25感染bhk-21细胞后的蛋白表达。

具体实施方式

本部分中所涉及的pcr，酶切，连接，转化，rna的提取，rt-pcr等实验方法，如无特殊说明，均采用本领域的常规方法。以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。因此本领域的技术人员在本发明公开内容的基础上做的修改或改进，均应属于本发明要求保护的范围。

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

一种包含狂犬病毒糖蛋白的感染性克隆的获得：

1)构建cmv启动子驱动的semliki森林病毒复制子：利用多片段同源重组技术对psfv3(购买自addgene)进行改造，将原有的sp6启动子替换成了cmv启动子，并在多聚腺苷酸尾后面插入丁肝病毒核酶序列(hdvrz)和牛生长素多聚腺苷酸化信号序列(bghpoly(a)signal)，省去了体外转录的步骤，具体方法如下：

设计了4对同源重组引物(表1中，ty-a-f/r，ty-b-f/r，ty-c-f/r，ty-d-f/r)，其中ty-a-f/r是扩增hdvrz和bghpoly(a)signal的引物，ty-c-f/r是扩增cmv启动子的引物(含有cmv启动子、hdvrz和bghpoly(a)signal的模板质粒bac由华中农业大学彭贵青教授友情提供，wangg.,etal.,then-terminaldomainofspikeproteinisnottheenterictropismdeterminantfortransmissiblegastroenteritisvirusinpiglets.viruses,2019,11(4).)。ty-c-f/r和ty-d-f/r是扩增psfv3上原本序列的引物，将psfv3(购买自addgene，图1)用spe1和ecorv双酶切，回收长片段和以上扩增的片段进行多片段同源重组(clonexpressmultisonestepcloningkit,vazyme)，连接产物转化dh5α感受态细胞，挑选阳性菌落进行质粒扩增和测序，测序正确的质粒命名为pcmv-sfv3(图1)，保存于-20℃备用。

2)构建含有10个突变氨基酸的semliki森林病毒复制子载体：为了使拯救出的狂犬病病毒样囊泡拥有较高滴度，我们利用重叠延伸pcr技术和多片段同源重组技术将步骤1)中构建的pcmv-sfv3中nsp1-4的编码序列引入10处核苷酸突变，突变位点见表2，该10处突变参考文献(rose,n.f.,etal.,invitroevolutionofhigh-titer,virus-likevesiclescontainingasinglestructuralprotein.procnatlacadsciusa,2014.111(47):p.16866-71.)。

具体方法如下：设计11对引物(表1中a-f/r，b-f/r，c-f/r，d-f/r，e-f/r，g-f/r，h-f/r，i-f/r，j-f/r，k-f/r，l-f/r，其中大写为突变碱基)对pcmv-sfv3载体片段进行pcr扩增，从而引入核苷酸突变，利用重叠延伸pcr将获得的11个片段连接成4个片段，用ecorv和bamh1将pcmv-sfv3切开，回收长片段与上述4个片段进行多片段同源重组，连接产物转化dh5α感受态细胞，挑选阳性菌落进行质粒扩增和测序，测序正确的质粒命名为pcmv-p50r-sfv3(图1)，保存于-20℃备用。

3)构建pcmv-p50r-rvg感染性克隆：将狂犬病毒g蛋白编码序列插入步骤2)中构建的pcmv-p50r-rvg，狂犬病毒g蛋白编码序列模板为本实验室保存的质粒plbnse-dog(pei,j.,etal.,codonoptimizationofgproteinenhancesrabiesvirus-inducedhumoralimmunity.journalofgeneralvirology,2019.100.8)(optig是以lbnse的g蛋白序列为基础进行真核表达密码子优化后的序列，lbnse是sad-b19株的cdna克隆，其中g蛋白的194和333两个氨基酸位点发生突变，使得lbnse对幼鼠失去了致病性)，用引物(表1中optig-f/r)进行狂犬病毒g蛋白的序列扩增，然后用bamh1将pcmv-p50r-sfv3切开，和g蛋白片段进行同源重组，连接产物转化dh5α感受态细胞，挑选阳性菌落进行质粒扩增和测序，测序正确的质粒命名为pcmv-p50r-rvg(图1)，保存于-20℃备用。

4)pcmv-p50r-rvg感染性克隆拯救出vlvs-p50r病毒样囊泡：在6孔板的每孔中接种2×10⁵个bhk-21细胞，当细胞汇合度达到80％时，按照转染试剂(superfecttransfectionreagent,qiagen)厂家提供的说明书步骤将pcmv-p50r-rvg直接转染至bhk-21细胞中进行病毒拯救，转染3天后，将上清转移至铺有80％汇合度的bhk-21细胞的25cm²的细胞培养瓶中进行增殖，1小时后，换成含有2％fbs的培养基继续培养3天，3天后收取上清，12000rpm，4℃离心30min去除细胞碎片，上清分装后冻存于-80℃备用，记做p1代毒。

5)间接免疫荧光(ifa)检测重组vlvs-p50r病毒的增殖：将上述步骤4)中保存的p1代毒取出100ul接种到新的80％汇合度的bhk-21细胞的12孔板中，在感染24h和48h后用预冷的80％丙酮在-20℃固定20min，洗掉丙酮。室温孵育一抗1h(一抗为鼠源狂犬病毒g蛋白单抗，按照1：100稀释)，pbs冲洗3遍后，于室温避光孵育二抗，抗体为1:500倍稀释的偶联异硫氰酸荧光素(fitc)羊抗鼠抗体。二抗孵育1h后，pbs冲洗3遍，于荧光显微镜下进行观察。结果显示vlvs-p50r在bhk-21细胞上感染24h后即可观察到成团的阳性细胞，48h后阳性细胞明显增多，以上结果表明了pcmv-p50r-rvg可以拯救出可以感染细胞的病毒样囊泡vlvs-p50r(图2中a)。

6)间接免疫荧光(ifa)检测重组vlvs-p50r的滴度：将p1代重组病毒样囊泡用dmem进行10倍倍比稀释，在96孔板中每孔加入100μl稀释好的病毒液，每个稀释度做4个副孔，然后每孔加入100μl含有5×10⁴个bhk-21细胞的完全培养基(含1％双抗和10％fbs)，在细胞培养箱中37℃，5％co2培养2天。2天后弃上清，用预冷的80％丙酮在-20℃固定20min，之后用步骤5)中的间接免疫荧光的方法观察阳性孔，根据reed-muench法进行病毒毒价的计算并记录为ffu/ml(focus-formingunitspermilliliter)。

7)vlvs-p50r的连续传代和每隔5代的滴度测定：将100ul收获的p1代vlvs-p50r接种至80％汇合度的bhk-21的6孔板中进行传代，每次感染2天后，吸取100ul上清接种至新的80％汇合度的bhk-21的6孔板中进行连续传代，每隔5代测定其滴度，发现当传至25代时其滴度明显提高(图2中b)。25代(vlvs-p50r-p25)上清用trizol(invitrogen)法提取其rna，根据厂家(primescript^tmrtmastermix，takara)提供的说明书步骤反转录获得cdna，设计重叠引物，以cdna为模板pcr扩增其nsp1-4及rabv-g片段，pcr产物测序鉴定其突变位点，结果其基因组上发现9处核苷酸突变，其中4处引起氨基酸突变，其余5处为无意义突变(突变位点见表3)。

8)vlvs-p50r-p25r反向遗传操作系统的构建及拯救：为验证非结构蛋白上的突变是引起vlvs-p50r毒价提高的关键因素，在vlvs-p50r反向遗传操作系统的基础上，利用多片段同源重组技术引入3处突变，构建vlvs-p50r-p25r的反向遗传操作系统，具体方法如下：设计同源重组引物(表4中，m-f/r，n-f/r，o-f/r大写是突变的核苷酸)以pcmv-p50r-rvg为模板扩增同源重组片段，用ecorv和xho1对pcmv-p50r-rvg双酶切，回收后与上述片段进行多片段同源重组，连接产物转化dh5α感受态细胞，挑选阳性菌落进行质粒扩增和测序，测序正确的质粒命名为pcmv-p50r-p25r-rvg(图1，序列为seqidno.1所示)，保存于-20℃备用。拯救pcmv-p50r-p25r的方法同步骤4)，拯救出的病毒样囊泡为vlvs-p50r-p25r。

表1.vlvs-p50r反向遗传操作系统(即pcmv-p50r-rvg)构建所用引物

表2.vlvs-p50r反向遗传操作系统引入的碱基突变

注：*下划线代表突变后的氨基酸，数字代表突变在nsp1-4上的位置。

表3.vlvs-p50r连续传代25代后发生的碱基突变

注：*下划线代表突变后的氨基酸，数字代表突变在nsp1-4上的位置。

表4.vlvs-p50r-p25r反向遗传操作系统(即pcmv-p50r-p25r-rvg)的构建所用引物

实施例2：

本发明提供的狂犬病病毒样囊泡vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25及vlvs-p50r-p25r病毒荧光斑扩散以及生长曲线测定：

病毒样囊泡的荧光斑扩散试验：将1×10⁵个bhk-21细胞接种至24孔板各孔中，待细胞汇合度达到90％时，以moi＝0.001接种vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25或vlvs-p50r-p25r，37℃、5％co2的培养箱中吸附1h后，用pbs洗三遍，加入含有2％fbs的dmem培养基和2％甲基纤维素的覆盖物于37℃、5％co2的培养箱中培养，分别在24h，48h取出一块板子，吸弃覆盖物，用pbs洗三遍，用预冷的80％丙酮在-20℃固定20min，之后用间接免疫荧光的方法观察形成的荧光斑(图3中a)。实验组每孔随机选取5个荧光斑，使用imagej软件计算绿色荧光面积所占比例，统计结果如图3中b所示，在48h内vlvs-p50r-p25及vlvs-p50r-p25r显示出相似的扩散特征，并且vlvs-p50r-p25及vlvs-p50r-p25r荧光斑扩散速度较vlvs-p50r更快。

病毒样囊泡的生长曲线测定：在12孔细胞培养板的各孔中分别接种3×10⁵个bhk-21细胞，待细胞汇合度达到90％时，以moi＝0.01接种vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25或vlvs-p50r-p25r，37℃、5％co2的培养箱中吸附1h后，用pbs洗三遍，加入含有2％fbs的dmem培养基，分别在12h、24h、36h、48h、60h、72h吸取100ul上清进行病毒滴度检测(图3中c)，结果显示，vlvs-p50r-p25和vlvs-p50r-p25r表现出相似的增殖特征，在36h即可达到最高滴度，约为10⁸ffu/ml。

实施例3：

本发明提供的狂犬病病毒样囊泡vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25、vlvs-p50r-p25r的纯化、sds-page和westernblot：

vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25和vlvs-p50r-p25r的纯化和sds-page：将收集的vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25和vlvs-p50r-p25r进行30,000rpm，4℃超高速离心2.5h(beckman,sw32ti)，弃掉上清，在管底加入1mlpbs，4℃放置过夜溶解，取100μl，加入5×sds上样缓冲液煮沸后进行sds-page检测，同时用纯化的lbnse全病毒作为marker，其余浓缩的病毒进行20％-60％蔗糖密度梯度离心，在蔗糖浓度为40％处出现沉淀层，小心吸取该层沉淀，加入pbs稀释后再次进行超高速离心去除蔗糖，最后用100ulpbs在4℃放置过夜溶解，冻存于-80℃备用。结果表明vlvs-p50r(图4中a)、vlvs-p50r-p25(图4中a)和vlvs-p50r-p25r病毒样囊泡仅含有狂犬病毒g蛋白一种结构蛋白。

westernblot检测vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25和vlvs-p50r-p25r的g蛋白表达：bhk-21细胞以1×10⁶接种至6孔板中，待细胞汇合度达90％时，以moi＝0.01接种vlvs-p50r、vlvs-p50r-p25，48h后用1％np40(含蛋白酶抑制剂和pmsf)在冰上裂解1h，12,000rpm，4℃离心30min去除细胞碎片，上清加入5×sds上样缓冲液煮沸后进行westernblot检测，同时用本实验室保存的纯化的lbnse全病毒作为对照。结果表明vlvs-p50r(图4中b)、vlvs-p50r-p25(图4中b)和vlvs-p50r-p25r病毒样囊泡与lbnse感染的细胞中均检测到了g蛋白表达。

序列表

<110>华中农业大学

武汉康湃特生物科技有限公司

<120>一种包含狂犬病毒糖蛋白的感染性克隆及应用

<160>39

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>13485

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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