一种猫冠状病毒核衣壳蛋白的鼠源单克隆抗体及其编码基因和应用

1.本发明属于细胞工程技术领域。更具体地，涉及一种猫冠状病毒核衣壳蛋白的鼠源单克隆抗体及其编码基因和应用。


背景技术：

2.猫传染性腹膜炎是由猫冠状病毒(feline coronavirus，fcov)引起的猫慢性致死性疾病，以腹膜炎、大量腹水积聚为主要特征，不同年龄的猫均可感染，传染率非常高。
3.目前针对猫冠状病毒的检测方法包括血清抗体筛查和rt-pcr等，上述方法需要对动物进行采血，而动物类采血存在采血困难、样本量少等问题。此外，应用rt-pcr方法在渗出液中检测fcov时，由于该方法诊断特异性有限，存在假阳性结果。中国专利cn 112415202a公开了一种检测猫冠状病毒的试纸条及其制备方法、试剂盒、检测方法。其所述检测试纸条的操作简单，可同时检测猫类动物的粪便、分泌物和腹水中的猫冠状病毒抗原。但fcov在世界各地猫群中普遍存在，不同地区、饲养环境、品种的猫感染的fcov毒株存在较大差异，给不同地区的fcov的检测带来困难。因此，提供一种针对国内fcov毒株进行检测的fcov检测方法具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种猫冠状病毒核衣壳蛋白的鼠源单克隆抗体及其编码基因和应用。
5.本发明的第一个目的是提供一种猫冠状病毒核衣壳蛋白的鼠源单克隆抗体。
6.本发明的第二个目的是提供所述单克隆抗体在制备猫冠状病毒检测产品的应用。
7.本发明的第三个目的是提供seq id no.5所示猫冠状病毒bs-8毒株核衣壳蛋白在制备猫冠状病毒核衣壳蛋白的鼠源单克隆抗体中的应用。
8.本发明的第四个目的是提供seq id no.5所示猫冠状病毒bs-8毒株核衣壳蛋白在制备猫冠状病毒检测产品中的应用。
9.本发明的第五个目的是提供编码所述猫冠状病毒核衣壳蛋白的鼠源单克隆抗体的基因。
10.本发明的第六个目的是提供包含上述基因的重组表达载体。
11.本发明的第七个目的是提供包含上述重组表达载体的宿主细胞。
12.本发明的第八个目的是提供一种检测猫冠状病毒的产品。
13.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
14.本发明首先提供了一种猫冠状病毒核衣壳蛋白的鼠源单克隆抗体，其是以猫冠状病毒bs-8毒株的核衣壳重组蛋白为抗原制备得到，所述单克隆抗体cdr区的重链氨基酸序列如seq id no.1所示，其轻链氨基酸序列如seq id no.3所示。实验表明，所述猫冠状病毒核衣壳蛋白的鼠源单克隆抗体的特异性强，效价高，使用该抗体可特异性的检测出国内
fcov毒株。因此，本发明申请保护所述单克隆抗体在制备猫冠状病毒检测产品中的应用。
15.本发明还申请保护seq id no.5所示猫冠状病毒bs-8毒株核衣壳蛋白在制备猫冠状病毒核衣壳蛋白的鼠源单克隆抗体中的应用。
16.本发明还申请保护seq id no.5所示猫冠状病毒bs-8毒株核衣壳蛋白在制备猫冠状病毒检测产品中的应用。
17.本发明同时提供了一种编码所述猫冠状病毒核衣壳蛋白的鼠源单克隆抗体的基因，编码重链氨基酸的基因序列如seq id no.2所示，编码轻链氨基酸的序列如seq id no.4所示。
18.本发明还提供了包含上述基因的重组表达载体。
19.本发明还提供了包含上述重组表达载体的宿主细胞。
20.本发明还提供一种检测猫冠状病毒的产品，其本发明所述单克隆抗体。
21.本发明还提供了一种检测猫冠状病毒的腹水间接免疫荧光方法，其以本发明所述单克隆抗体为一抗，以羊抗鼠igg为二抗。
22.优选地，所述羊抗鼠igg为abcam公司的goat anti-mouse igg h&l(alexa488)。
23.优选地，所述腹水间接免疫荧光方法的步骤为：
24.s1.取待测新鲜腹水滴于载玻片上，用盖玻片将腹水推平，再用免疫组化笔沿边缘画一圈，放入37℃烘箱中烘干；
25.s2.将盖玻片放到水平摇床上以最低转速用pbs洗3遍，每次3min。清洗结束后，将pbs弃掉，用4％的多聚甲醛固定10min；
26.s3.固定结束后，在水平摇床上以最低转速用pbs洗3遍，每次3min；
27.s4.清洗结束后，将pbs弃掉，用免疫荧光封闭液封闭孵育15min，弃掉封闭液；
28.s5.4℃孵育一抗12～14h，完毕后，回收一抗，用pbst清洗3遍，每次3min；
29.s6.常温避光孵育二抗1h，孵育完后，弃掉二抗，用pbst溶液清洗三次，每次3min。
30.本发明还提供了一种检测猫冠状病毒的冷冻切片间接免疫荧光方法，其以本发明所述单克隆抗体为一抗，以羊抗鼠igg为二抗。
31.优选地，所述羊抗鼠igg为abcam公司的goat anti-mouse igg h&l(alexa488)。
32.优选地，所述冷冻切片间接免疫荧光方法的步骤为：
33.s1.用剖检病猫的小肠肠系膜做冷冻切片，放到水平摇床上最低转速用pbs洗3遍，每次3min；
34.s2.清洗结束后，将pbs弃掉，用4％多聚甲醛固定10min；
35.s3.固定结束后，在水平摇床上最低转速用pbs洗3遍，每次3min；
36.s4.清洗结束后，将pbs弃掉后，用免疫荧光封闭液封闭孵育15min，弃掉封闭液；
37.s5.4℃孵育一抗12～14h，完毕后，回收一抗，用pbst清洗3遍，每次3min；
38.s6.常温避光孵育二抗1h，孵育完后，弃掉二抗，用pbst溶液清洗三次，每次3min。
39.本发明具有以下有益效果：
40.本发明制备得到的单克隆抗体的特异性强，效价高，利用该抗体可以特异性的检测出国内fcov毒株，因此，可将其应用于国内fcov毒株的检测，或用于制备检测国内fcov毒
株的产品。
附图说明
41.图1为81株阳性样品与国内猫冠状病毒毒株的氨基酸同源性分析。
42.图2为bs-8毒株的核衣壳重组蛋白的电泳图，其中孔道1为未纯化的重组蛋白，孔道2为纯化的bs8-n-mbp重组蛋白，孔道3为未纯化蛋白的重组蛋白经xa factor切割后，孔道4为纯化的bs8-n-mbp重组蛋白经过xa factor切割后再次纯化的bs-8-n蛋白。
43.图3为第一批小鼠三免后的效价检测结果。
44.图4为第二批小鼠三免后的效价检测结果。
45.图5为转染了myc-bs8n质粒的293t细胞样品与1f9、1g8、1h6、2a6、2d3和2f5细胞株上清的间接免疫结果图。
46.图6为转染了myc-bs8n质粒的293t细胞样品与2h1、2h11、3a12、3g6、3h8、4b11、4b12、4e1、4e7、5e2、5f11和5g7c4细胞株上清的间接免疫结果图。
47.图7为转染了myc-bs8n质粒的293t细胞样品与5h3、5h5、6a6、6a10、6c4、6c8、6c11、6d4、6f12、6g31e1、7d3细胞株上清和thermo对照的间接免疫结果图。
48.图8为转染了myc-bs8n质粒的crfk1细胞样品与1g8、2d3、2f5、2h1和3g6细胞株上清的间接免疫结果图。
49.图9为转染了myc-bs8n质粒的crfk1细胞样品与4b11、4b12、4e1、4e7和5e2细胞株上清的间接免疫结果图。
50.图10为转染了myc-bs8n质粒的crfk1细胞样品与5f11、6a6、6a10、6c8和6c11细胞株上清的间接免疫结果图。
51.图11为转染了myc-bs8n质粒的crfk1细胞样品与6d4、6f12细胞株上清和thermo对照的间接免疫结果图。
52.图12为转染了myc-bs8n质粒的fcwf4细胞样品与1g8、2d3、2f5、2h1和3g6细胞株上清的间接免疫结果图。
53.图13为转染了myc-bs8n质粒的fcwf4细胞样品与4b11、4b12、4e1、4e7和5e2细胞株上清的间接免疫结果图。
54.图14为转染了myc-bs8n质粒的fcwf4细胞样品与5f11、6a6、6a10、6c8和6c11细胞株上清的间接免疫结果图。
55.图15为转染了myc-bs8n质粒的fcwf4细胞样品与6d4和6f12细胞株上清的间接免疫结果图。
56.图16为myc-bs8n质粒对293t、crfk、fcwf-4转染后提取的总蛋白免疫印迹的电泳图。
57.图17为4b11细胞株抗体纯化后的电泳图。
58.图18为4b11细胞株抗体的重链氨基酸序列。
59.图19为4b11细胞株抗体的轻链氨基酸序列。
60.图20为猫冠状病毒的腹水间接免疫荧光检测结果。
61.图21为猫冠状病毒的冷冻切片间接免疫荧光检测结果。
具体实施方式
62.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
63.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
64.本发明所用bs-8毒株现保藏于华南农业大学兽医学院外产科教研室的超低温冰箱的病毒种子库中。
65.实施例1bs-8核衣壳重组蛋白的制备
66.为实现对国内猫冠状病毒(fcov)毒株的检测，本发明将81株猫冠状病毒阳性样品测序获得的部分n基因序列，与公布的fcov 79-1146、black、ucd-1等8株国内外测得的猫冠状病毒毒株的n基因序列及ccov1-71和tn499两株犬冠状病毒的n基因序列，使用megalign软件进行了氨基酸同源性分析，分析结果显示bs-8毒株与国内毒株的同源性最高，甚至某些毒株的同源性高达100％，分析结果如图1所示。因此，本发明选择以bs-8毒株的核衣壳重组蛋白为抗原制备单克隆抗体，编码bs-8毒株核衣壳蛋白的基因序列如seq id no.5所示。
67.1、重组表达载体的构建
68.参照诺唯赞生物科技有限公司的同源重组试剂盒cloneexpress ii one step cloning kit的说明书，通过同源重组方法构建重组表达载体pmal-c5x-bs8n。
69.首先根据上述序列设计同源重组引物，扩增bs-8核衣壳蛋白的基因，引物为序列如下所示，交由广州天一辉远基因科技有限公司合成。
70.pmal-c5x-osbs8-f：
71.cgcgatatcgtcgacggatccatggccacacaaggacaacg
72.pmalc5x-osbs8-r：
73.ttaattacctgcagggaattcttagttcgagacctcatcaatcatct
74.表达载体pmal-c5x质粒的双酶切体系如下：
[0075][0076]
体系配制完成后，于37℃水浴15分钟，通过凝胶电泳回收线性化载体，同时测定回收所得线性化载体的。
[0077]
入门克隆及单片段同源重组反应：
[0078]
根据下列公式分别计算载体和片段的最适使用量，依据计算出的使用量配制同源重组体系。
[0079]
最适克隆载体使用量＝[0.02
×
克隆载体碱基对数]ng
[0080]
最适插入片段使用量＝[0.04
×
插入片段碱基对数]ng
[0081]
同源重组体系
[0082][0083]
体系配制完成后，于50℃条件下反应5min，反应结束后将所得重组产物加入解冻后的e.coli dh5α感受态细胞之中，轻弹混匀。混匀后将感受态细胞在冰中放置25min。静置结束后，将感受态细胞在42℃水浴锅中水浴45sec，取出后要迅速在冰上静置2min。待冰上静置后，在感受态细胞中加入700ul不含抗生素的lb肉汤培养基，混匀后置于恒温摇床内37℃，180rpm复苏1h。将复苏好的感受态细胞在室温条件下3000rpm离心3min，使用移液枪吸取上清600ul，使用剩余液体重悬菌体。使用玻璃棒均匀的将剩余液体涂布在氨苄lb琼脂培养基上，倒置在37℃恒温培养箱中过夜培养。挑取单菌落，经测序验证后，选择含有正确重组表达载体的菌进行后续实验。
[0084]
取10ml含有重组质粒pmal-c5x-bs8(fcov-bs8-n与mbp标签重组后的质粒)的菌液接种于1l含氨苄抗性的lb肉汤培养基中。在生长培养基中必须有葡萄糖来抑制大肠杆菌宿主染色体上的麦芽糖基因，原因是麦芽糖是可以降解亲和树脂上的直链淀粉的淀粉酶。
[0085]
待菌体生长至2
×
108个细胞/ml，或在630nm波长下吸光度大于0.6时，加入iptg至终浓度为3mm，将菌体在37℃下孵育2小时；孵育结束后于4000
×
g离心20分钟，弃去上清液，收集菌体；用pbs缓冲液将菌体重悬并迅速收集菌体，将样品置于冰水浴中，超声处理15秒；使用bradford分析法监测蛋白质的释放，取5μl的超声溶液添加到1ml bradford试剂中并混合，继续超声处理2分钟，使释放的蛋白质达到最大程度；超声处理后20000
×
g离心20分钟，保留上清液，即粗提物；用6
×
pbs稀释成1ml粗提物，置于-20℃保存。
[0086]
2、重组蛋白的纯化
[0087]
本发明通过柱层析纯化蛋白。
[0088]
(1)层析柱的装填：
[0089]
用20％乙醇将垫片浸泡一晚，直到表面没有气泡产生；把垫片塞入2.5
×
10cm的色谱柱中；将直链淀粉树脂倒入2.5
×
10cm的色谱柱中；待树脂沉淀后再塞入另一片垫片；用5
倍柱体积的column buffer洗涤柱；
[0090]
(2)重组蛋白的纯化：
[0091]
以不超过5ml/min的流速装填稀释的粗提物，用12倍柱体积的pbs以不超过10ml/min的速度洗涤；用含10mm麦芽糖的pbs洗脱融合蛋白，收集10到20个各自为3ml的馏分，馏分大小等于1/5柱体积；
[0092]
(3)重组蛋白的切割和目标蛋白的纯化：
[0093]
在上述洗脱液中，按1mg重组蛋白加50μl的比例添加xa factor protease，在常温下反应1h；使用阴离子色谱交换柱ge hitrap q ff对目标蛋白进行纯化。
[0094]
用20mm的tris-hcl，25mm的nacl，ph 8.0的透析融合蛋白裂解混合物(100体积的2或3次变化，每次至少2小时)；用15ml相同的缓冲液洗涤色谱柱；将融合蛋白裂解混合物上样至色谱柱，收集2.5ml的柱流过馏分；用3～5倍体积的相同缓冲液洗涤色谱柱，继续收集2.5ml馏分。在ph 8.0的20mm tris-hcl中，开始从25mm nacl到500mm nacl(每个25ml)的梯度洗脱。收集1ml的馏分，通过测量a280或bradford方法确定哪些级分包含蛋白质。mbp在100～150mm nacl处洗脱为尖峰。xa factor以约400mm nacl洗脱。收集流过的液体做蛋白印迹验证。
[0095]
3、纯化蛋白效果的蛋白印迹验证
[0096]
(1)聚丙烯酰胺凝胶的制备：
[0097]
配制10ml浓度为12％的分离胶溶液：依次加入去离子水3.3ml、30％丙烯酰胺4ml、ph 8.8的tris 2.5ml、10％过硫酸铵100μl、10％sds 100μl、temed 6μl，立即快速混匀。迅速在两玻璃板的间隙中加入分离胶溶液，留出灌注浓缩胶所需空间，小心地在分离胶溶液上加入1ml异丙醇(贴壁加入)。分离胶完全聚合后，尽可能排去凝胶上的液体，再用滤纸的边缘吸净残留液体。
[0098]
配制4ml浓度为5％的浓缩胶溶液：依次加入去离子水2.7ml、30％丙烯酰胺670μl、ph6.8的tris 500μl、10％过硫酸铵40μl、10％的sds 40μl、temed6μl，立即快速混匀。快速在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，避免混入气泡。浓缩胶完全聚合后，小心移出梳子，向电泳槽内加入蛋白质电泳缓冲液。
[0099]
(2)样品的制备：
[0100]
取粗提取物、层析柱纯化后样品、xa factor切割后样品和过阴离子层析柱后的样品，各取50μl，加入5
×
loading buffer混匀，沸水浴10min。
[0101]
(3)电泳
[0102]
用移液枪慢慢将样品混合物加至样品槽中，预染marker加10μl。
[0103]
打开电源，采用80v电泳30min，换电压至120v电泳直至溴酚蓝上样缓冲液在凝胶中迁移至凝胶底部。
[0104]
(4)蛋白染色
[0105]
电泳结束后，把切割好的胶放入去离子水中进行清洗，常温摇动5min，弃掉液体，重复三遍洗涤。加入溴酚蓝染色液，覆盖凝胶后在常温下摇动孵育至少1h。随后用去离子水清洗至少30min，直到清晰出现条带。
[0106]
电泳结果如图2所示，其中孔道1为未纯化的重组蛋白，孔道2为纯化的bs8-n-mbp重组蛋白，孔道3为未纯化蛋白的重组蛋白经xa factor切割后，孔道4为纯化的bs8-n-mbp
重组蛋白经过xa factor切割后再次纯化的bs-8-n蛋白。蛋白的纯化效果好，所得蛋白大小与预期相符。
[0107]
实施例2单克隆抗体的制备
[0108]
1、动物免疫
[0109]
将8只spf级bal b/c小鼠分为两组，分批次进行免疫，共免疫4次。第一次免疫用弗氏不完全佐剂与50μg/只抗原和pbs混合，对小鼠进行皮下注射。反应2个周后，进行第二次免疫，注射如上试剂。再反应2个周后，进行第三次加强免疫，注射如上试剂，反应一个周后，对小鼠进行取血，进行抗体elisa效价检测，再进行第四次免疫。注射如上试剂后，反应2个周后，进行抗体elisa效价检测。腹腔冲击，用50μg/只抗原和pbs对小鼠进行腹腔冲击。
[0110]
2、elisa检测免疫效价
[0111]
抗原包被：用包被液稀释抗原到1ug/ml，100μl/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中，4℃放置过夜；
[0112]
洗涤：次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗1次；
[0113]
封闭：加200μl/孔封闭液，37℃放置2h；
[0114]
洗涤：用洗涤液洗3次。
[0115]
加待测样品(一抗)：以每孔100ul加入待测样(样品需要稀释的，按比例稀释好)，温育1h。
[0116]
洗涤：弃掉待测样品，用洗涤液洗3次；
[0117]
加酶标二抗抗体：加入hrp标记羊抗鼠igg(1:10000，酶稀稀释)，100μl/孔，37℃孵育40min；
[0118]
洗涤：用洗涤液洗5次；
[0119]
显色：加新鲜配制的底物溶液90μl/孔，37℃于暗处放置15min。
[0120]
终止反应、比色：加50μl/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。
[0121]
第一批和第二批小鼠在分别接种3次免疫原后，其血清效价的检测结果分别如图3和4所示，由图可知，实验组的血清效价均大于空白对照组1:8000的稀释度，血清效价满足后续实验条件。
[0122]
3、细胞融合
[0123]
末次冲击3天后，摘除眼球后处死，并收集阳性对照血，取出脾脏，制备成单细胞悬液，然后取出处于对数期的sp2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合(1∶5～1∶10)，50％的peg1450作用1min，以基础培养基dmem稀释终止，低速离心后，再用含20％胎牛血清的hat培养基轻轻悬浮并混匀，按照2
×
107个细胞/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5％co2，37℃下培养。
[0124]
具体步骤如下：
[0125]
(1)脾细胞：小鼠解剖，取出免疫好的脾脏，并分离脾脏中的淋巴细胞
[0126]
a、在超净工作台中准备一个1.5ml tube管。加入1ml无血清培养基，两个3.5cm dish，加入2ml无血清培养基，两根15ml离心管，其中一根加入10ml无血清培养基，手术器械(高压湿热灭菌)，绢网，移液器(1ml)，枪头；
[0127]
b、取已经免疫的bal b/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性
对照血清。同时通过断颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中5min，放蜡盘上固定后剪开脾脏上皮肤，用镊子取出脾脏，放在1.5ml tube管中；
[0128]
c、将脾脏转移到超净台里的其中一个3.5cm dish中，摘除脾脏上面的脂肪和结缔组织，洗一遍，铺开一张绢网放在dish盖子上，将脾脏轻轻挤破，放在绢网中间位置。将绢网两次对折，用移液器吸取无血清培养基轻轻吹散，用研磨棒研磨，使脾脏内淋巴细胞透过绢网制成单细胞悬液，收集单细胞悬液于15ml离心管中。1000rpm/min离心5min。
[0129]
(2)sp2/0准备：取瘤分离制备单细胞悬液后，1000rpm，离心5min后弃掉上清，10～20mldmem(根据瘤子大小而定)重悬并混匀，利用淋巴细胞分离液进行分离，其与dmem体积比为1:1，缓慢滴加分离液于重悬的细胞中，然后2500rpm/min，离心15min，后小心放置到超净工作台上，用移液枪将中间一层乳白色的晕圈转移至新的离心管中(事先准备好30ml dmem于管中)，1000rpm/min，离心5min，最后弃掉上清，收集细胞于10cm培养皿中，用10％的胎牛血清调整状态并扩大培养，通常一只小鼠的瘤子当天可制备3～5皿，第二天离心扩大到30皿，然后冻存30～35管。准备融合时，可按下列步骤进行：
[0130]
a、第一天复苏；
[0131]
b、第二天根据融合的数量传代，5皿/1个融合；
[0132]
c、约两天后观察细胞状态，是否达到对数期，然后收集细胞准备融合。
[0133]
(3)饲养层细胞准备：将健康的bal b/c小鼠在无菌条件下取出其脾脏，并用含20％胎牛血清的hat培养基制成单个脾细胞悬液，然后根据铺板数量，预先将其铺入到96孔板中。
[0134]
(4)终止液：基础培养基dmem 20ml预先放入37℃水浴锅中孵育。
[0135]
4、细胞建株
[0136]
(1)融合板检测：
[0137]
待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测(检测方法参见附表elisa方法)在elisa质控合格(即阴性对照《0.2，阳性对照》1.0)后挑选阳性孔(一般od 450≥0.5)作亚克隆。
[0138]
(2)亚克隆方法及检测：
[0139]
挑出融合板中检测阳性值高的孔进行有限稀释，以每板60％的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，每次亚克隆5～7天即可进行elisa检测，直到最终筛选出能稳定分泌阳性抗体的单克隆细胞株进行扩大培养。
[0140]
(3)细胞株建立：
[0141]
将亚克隆阶段筛选出的能稳定分泌阳性抗体的细胞株，扩大培养于24孔板，扩大后收集上清进行抗原检测，采用elisa梯度稀释及wb验证其稳定性，收集细胞扩大于10cm培养皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价，挑选出较高的1～3株细胞株培养于细胞瓶中，进行冻存。本发明成功建立的细胞株，按实验顺序命名包括1f9、1g8、1h6、2a6、2d3、2f5、2h1、2h11、3a12、3g6、3h8、4b11、4b12、4e1、4e7、5e2、5f11、5g7c4、5h3、5h5、6a6、6a10、6c4、6c8、6c11、6d4、6f12、6g31e1和7d3，将用于后续的抗体筛选实验。
[0142]
(4)细胞株冻存鉴定
[0143]
在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定，鉴定标准：
[0144]
①
复苏活细胞数≥100万个细胞/支；
[0145]
②
活细胞中有活力细胞≥50万/株；
[0146]
③
复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如细菌、真菌、支原体等)出现；
[0147]
④
复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；
[0148]
⑤
细胞培养上清也需作elisa，以确定是否分泌阳性抗体的同时做western blotting的鉴定。
[0149]
(5)腹水制备
[0150]
制备腹水，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中。细胞定株后选用10％胎牛血清培养基扩大培养，当细胞密度达到1
×
106～2
×
106/ml时，800rpm/min离心，收集沉淀，并用pbs重悬后，腹腔注入到小鼠(液体石蜡)体内，7～10天后，收集腹水准备纯化。
[0151]
5、抗体的筛选
[0152]
myc-bs8n质粒的构建参照实施例1中的方法进行，所用引物为：
[0153]
myc-bs8-f：
[0154]
tggccatggaggcccgaattcaaatggccacacaaggacaacg；
[0155]
myc-bs8-r：
[0156]
cctcgagagatctcggtcgacaattagttcgagacctcatcaatcatct载体更替为pcmv-myc，酶切位点更替为ecori和sali。
[0157]
用构建好的myc-bs8n质粒对293t、crfk、fcwf-4细胞进行转染，进行间接免疫荧光和蛋白提取。
[0158]
本发明用所得杂交瘤细胞株的上清对上述转染myc-bs8n质粒的细胞样品进行了间接免疫荧验证，结果如图5～15所示，其中图5～7为所述杂交瘤细胞株与转染了myc-bs8n质粒的293t细胞的实验结果，8～11为所述杂交瘤细胞株与转染了myc-bs8n质粒的crfk细胞的实验结果，12～15为所述杂交瘤细胞株与转染了myc-bs8n质粒的fcwf-4细胞的实验结果，其中thermo为商品化抗体对照。结果显示本发明筛选所得抗体均能与myc-bs8n重组蛋白发生特异性结合，显示绿色荧光。
[0159]
提取后的蛋白样品按实施例1的方法进行wb验证，其wb的验证结果如图16所示。结果显示invitrogen商品化的抗体(catalog#ma1-82189coronavirus pan monoclonal antibody(fipv3-70))只能识别磷酸化的核衣壳蛋白，不能识别未经修饰的核衣壳蛋白，而本发明所筛选的细胞株上清既能识别未经修饰的核衣壳蛋白，又能识别磷酸化的核衣壳蛋白。
[0160]
6、抗体克隆亚型的鉴定
[0161]
通过elisa方法进行抗体克隆亚型的鉴定，具体步骤为：
[0162]
(1)使用bs8蛋白以1ug/ml的浓度包被，4℃过夜包被；
[0163]
(2)用5％的脱脂奶粉在37℃下进行封闭；
[0164]
(3)用tbst以200ul/孔，洗涤3遍；
[0165]
(4)细胞上清以100ul/孔加样，共加样6个孔，37℃孵育30min；
[0166]
(5)用tbst以200ul/孔，洗涤3遍；
[0167]
(6)6中分型酶标二抗(iga、igm、igg1、igg2a、igg2b、igg3)1:1000稀释，以100ul/孔加到步骤5的6个孔中，37℃孵育30min；
[0168]
(7)用tbst以200ul/孔，洗涤5遍；
[0169]
(8)以90ul/孔加入单组份tmb显色液，孵育15min；
[0170]
(9)酶标仪测定od450读数，结果如下表。
[0171]
酶标仪od450读数：
[0172][0173][0174]
亚型检测结果
[0175][0176]
经过293t、crfk、fcwf-4细胞进行转染后的免疫荧光和转染后的蛋白免疫印迹，共4轮筛选后，将上述结果所示细胞株均进行冻存，并选择克隆号为4b11的一株亚克隆杂交瘤细胞株进行抗体纯化。
[0177]
7、抗体纯化
[0178]
收集后的腹水经过预处理后选用protein g-琼脂糖亲和层析柱纯化，具体步骤如下：
[0179]
(1)配制缓冲液：起始缓冲液为ph7.0，20mmol/l的磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为ph 2.7，0.1mmol/l甘氨酸盐酸；
[0180]
(2)准备收集管：取1.5ml离心管，每支离心管加70μl ph9，1mol/ltris-hcl；
[0181]
(3)样品准备：经50％sas沉淀得到的样品，置起始缓冲液进行透析过夜，并经0.22μm微孔滤膜滤过；
[0182]
(4)纯化过程：用足够的起始缓冲液(8～10ml)平衡protein g-琼脂糖亲和层析柱(hitrap protein g 1ml，pharmacia biotech)。取待纯化的样品(每毫升样品含蛋白10.2～21.1mg)15～25ml上柱，流速为0.5ml/min，然后以同样的流速依次用起始缓冲液7～8ml、洗脱缓冲液6～7ml、起始缓冲液5ml洗涤，每管1ml收集洗脱液；
[0183]
(5)纯度及活性鉴定：纯化的mab用sds-page鉴定其纯度；
[0184]
纯度鉴定结果如图17所示，经sds验证，抗体纯度在90％以上，可以用作下步实验。
[0185]
8、抗体测序
[0186]
对4b11细胞株的mrna进行抽提，将其反转录成cdna，对抗体的重链和轻链的cdr区域扩增后进行测序。对比删除无意义序列，得到的4b11抗体重链氨基酸序列如图18所示，轻链氨基酸序列如图19所示。
[0187]
所述单克隆抗体cdr区的重链氨基酸序列如seq id no.1所示，编码重链氨基酸的基因序列如seq id no.2所示，其轻链氨基酸序列如seq id no.3所示，编码轻链氨基酸的序列如seq id no.4所示。
[0188]
实施例3病毒检测
[0189]
1、腹水间接免疫荧光
[0190]
此方法以本发明所述单克隆抗体为一抗，以abcam公司的goat anti-mouse igg h&l(alexa488)为二抗，具体步骤如下：
[0191]
(1)取待测新鲜腹水滴于载玻片上，用盖玻片将腹水推平，再用免疫组化笔沿边缘画一圈，放入37℃烘箱中烘干；
[0192]
(2)将盖玻片放到水平摇床上以最低转速用pbs洗3遍，每次3min。清洗结束后，将
pbs弃掉，用4％的多聚甲醛固定10min；
[0193]
(3)固定结束后，在水平摇床上以最低转速用pbs洗3遍，每次3min；
[0194]
(4)清洗结束后，将pbs弃掉，用免疫荧光封闭液封闭孵育15min，弃掉封闭液；
[0195]
(5)4℃孵育一抗12～14h，完毕后，回收一抗，用pbst清洗3遍，每次3min；
[0196]
(6)常温避光孵育二抗1h，孵育完后，弃掉二抗，用pbst溶液清洗三次，每次3min；
[0197]
(7)清洗完用荧光显微镜观察，拍照。
[0198]
腹水间接免疫荧光检测结果如图20所示，腹水中被猫冠状病毒感染的细胞被特异性标记，显示明亮的绿光。
[0199]
2、冷冻切片间接免疫荧光
[0200]
此方法以本发明所述单克隆抗体为一抗，以abcam公司的goat anti-mouse igg h&l(alexa488)为二抗，具体步骤如下：
[0201]
(1)用剖检病猫的小肠肠系膜做冷冻切片，放到水平摇床上最低转速用pbs洗3遍，每次3min；
[0202]
(2)清洗结束后，将pbs弃掉，用4％多聚甲醛固定10min；
[0203]
(3)固定结束后，在水平摇床上最低转速用pbs洗3遍，每次3min；
[0204]
(4)清洗结束后，将pbs弃掉后，用免疫荧光封闭液封闭孵育15min，弃掉封闭液；
[0205]
(5)4℃孵育一抗12～14h，完毕后，回收一抗，用pbst清洗3遍，每次3min；
[0206]
(6)常温避光孵育二抗1h，孵育完后，弃掉二抗，用pbst溶液清洗三次，每次3min；
[0207]
(7)清洗完用荧光显微镜观察，拍照。
[0208]
冷冻切片间接免疫荧光结果如图21所示，肠系膜和小肠组织中被猫冠状病毒感染的细胞被特异性标记，显示明亮的绿光。
[0209]
上述检测毒株同时经pcr扩增验证，确定为猫冠状病毒阳性样品，表明本发明所述单克隆抗体适用于猫冠状病毒的检测。
[0210]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。