一种检测SARS-CoV-2的引物组合物及其应用的制作方法

本发明属于基因工程
技术领域：
，涉及一种检测sars-cov-2的引物组合物及其应用。
背景技术：
：冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的rna病毒，是自然界广泛存在的一类病毒。某些冠状病毒会感染人类并引起疾病，比如中东呼吸综合征（mers）、严重急性呼吸综合征（sars）和sars-cov-2引起的肺炎，其症状可从普通感冒到重症肺部感染。sars-cov-2引起的肺炎主要以发热、乏力和干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。对sars-cov-2感染的肺炎疑似案例、疑似聚集性病例患者及接触物等进行sars-cov-2检测，并采取适当措施，可以有效地鉴别感染病源，阻断疫情传播。sars-cov-2基因组为一条完整的单股正链rna，长约30kb。利用ncbi上的orffinder工具进行该病毒的基因组注释分析发现sars-cov-2基因组中共有14个开放阅读框（具有编码基因的能力），orf1a、orf1ab和4种结构蛋白：刺突蛋白（spikeprotein，s蛋白），膜蛋白（membraneprotein，m蛋白），包膜蛋白（envelopeprotein，e蛋白），核壳蛋白（nucleocapsid，n蛋白）。易发生突变是多数rna病毒的一种固有性质，已有报道揭示了sars-cov-2突变株的出现，sars-cov-2具有校对功能的聚合酶（proofreadingpolymerase），其可使sars-cov-2发生碱基置换（substitutions）突变的机率较低，但sars-cov-2较易发生缺失（deletions）突变，这种突变多发生在s蛋白的重复缺失区（recurrentdeletionregions，rdrs），作为抗体识别表位，rdrs的缺失突变可能导致sars-cov-2抗体的结合特异性发生变化，使其发生抗原进化（antigenicevolution），进而逃逸由突变前sars-cov2诱生的中和抗体。目前，国内外对sars-cov-2进行检测的方法主要集中在以靶序列pcr扩增为基础的检测和测序技术（sanger测序、ngs测序）两方面，sars-cov-2核酸的定性检测主要包括逆转录+实时荧光定量pcr（real-timepcr）等，其中荧光pcr技术简单、快速且灵敏，如cn111270021a公开了一种用于检测新型冠状病毒sars-cov-2的引物对、探针、组合物、试剂盒及应用，该荧光rt-raa引物和荧光探针可以快速、定性检测患者样本中的新型冠状病毒sars-cov-2，但由于病毒发现时间较短，科学认知不足，用于鉴别诊断的基因位点未经大规模临床验证，可能存在假阴性或假阳性，准确性和分析特异性风险。综上所述，提供一种准确检测sars-cov-2的引物及检测方法，发现新的变异位点，对于sars-cov-2防控具有重要意义。技术实现要素：针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测sars-cov-2的引物组合物及其应用，利用所述引物组合物进行逆转录巢式pcr，并结合测序，能够快速、准确地获取sars-cov-2基因信息，从而能够实现快速检测sars-cov-2以及判断sars-cov-2突变株。为达上述目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种检测sars-cov-2的引物组合物，所述引物组合物包括seqidno:1~seqidno:12所示的核酸序列。seqidno.1：cagtgtgttaatcttacaaccagaac。seqidno.2：cagactttaataacaacattagtagcgtt。seqidno.3：gaacaggaagagaatcagcaac。seqidno.4：actcagtaagaacacctgtgcct。seqidno.5：gtttctgcctttccaacaatttggc。seqidno.6：ctgcattcagttgaatcaccac。seqidno.7：tctttcacacgtggtgtttattac。seqidno.8：acaataagtagggactgggtcttc。seqidno.9：ctgtgttgctgattattctgtcctatat。seqidno.10：aaccattgaagttgaaattgacac。seqidno.11：gacattgctgacactactgatgct。seqidno.12：ctggtagaatttctgtggtaacactaat。本发明中，设计引物组合物时首先通过进化树分析，发现与sars-cov-2亲缘最近的为蝙蝠bat-sl-covzc45病毒，其次为sars-cov病毒，为提高扩增特异性，选择的目标序列均与bat-sl-covzc45和sars-cov序列有5%以上的碱基差异的序列，并通过blast比对，确保与人类基因组、常见人体或环境微生物之间无交叉反应。因此，本发明的引物组合物能够针对sars-cov-2的s蛋白特定区域g.21765_21770del（p.hv69_70del）、g.a22812c（p.k417t）、g.g22813c/t（p.k417n）、g.g23012a（p.e484k）、g.a23063t（p.n501y）、g.a23403g（p.d614g）和g.c23604a（p.p681h）进行高度特异性扩增。优选地，所述引物组合物还包括内参引物。优选地，所述内参引物为b2m内参引物。优选地，所述b2m内参引物包括seqidno:13和seqidno:14所示的核酸序列。seqidno.13：tcatgaggagtatgcagactct。seqidno.14：tccacatctgtggattcagca。本发明中，内参引物可作为监控提取与反转录过程的指标。第二方面，本发明提供第一方面所述的检测sars-cov-2的引物组合物在制备sars-cov-2检测产品中的应用。第三方面，本发明提供一种检测sars-cov-2的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测sars-cov-2的引物组合物。优选地，所述试剂盒还包括pcr反应液、测序引物和测序试剂。优选地，所述pcr反应液包括dna聚合酶、mg2+缓冲液、dntps和水。优选地，所述pcr反应液还包括逆转录扩增mix、10×qiagenbuffer和5qsolution。优选地，所述测序引物包括seqidno:7、seqidno:9和seqidno:11所示的核酸序列。优选地，所述测序试剂包括bigdyeterminatorv3.1cyclesequencingkit。第四方面，本发明提供一种第三方面所述的检测sars-cov-2的试剂盒以非疾病治疗和/或诊断为目的的使用方法，所述方法包括：以样本中核酸为模板，利用第一方面所述的检测sars-cov-2的引物组合物进行逆转录巢式pcr，对逆转录巢式pcr的产物进行测序，并对测序结果进行分析。本发明中，采用所述引物组合物能够对sars-cov-2进行高度特异性逆转录巢式pcr，对逆转录巢式pcr的产物进行测序，可准确获取sars-cov-2基因信息，从而进行sars-cov-2检测以及突变株分析。本发明中，样本可以为人体样本，亦可以为接触物、食品等环境样本。优选地，所述逆转录巢式pcr包括一步法逆转录巢式pcr。优选地，所述测序包括sanger测序。本发明中使用sanger测序法获取sars-cov-2核酸序列，可直接读取dna的序列，测序长度较长，可发现新的变异位点，包括新的、罕见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失等。优选地，所述一步法逆转录巢式pcr包括第一轮扩增和第二轮扩增。优选地，所述第一轮扩增的引物包括seqidno:1~6、seqidno:13和seqidno:14所示的核酸序列。优选地，所述第一轮扩增的反应体系如表1所示，其中，混合酶包括热启动taq酶、逆转录酶和ung酶。表1优选地，所述第一轮扩增的程序如表2所示。表2优选地，所述第二轮扩增的引物包括seqidno:7~12、seqidno:13和seqidno:14所示的核酸序列。优选地，所述第二轮扩增的反应体系如表3所示。表3优选地，所述第二轮扩增的程序如表4所示。表4优选地，引物对应关系如表5所示。表5优选地，所述方法还包括回收扩增产物的步骤；优选地，所述回收扩增产物的方法包括通过琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物。优选地，所述琼脂糖凝胶的质量百分比为1~3%（w/w）。优选地，所述电泳的电压为80~120v。优选地，所述电泳的时间为15~25min。优选地，所述sanger测序包括：采用bigdyeterminator试剂盒进行测序pcr，将测序pcr产物用酒精纯化，加入hi-di甲酰胺，上样，按照abi3500xldx的仪器说明书进行设置开始运行程序，下机后进行结果分析。作为优选的技术方案，所述检测sars-cov-2的试剂盒以非疾病治疗和/或诊断为目的的使用方法包括以下步骤：（1）提取样本中核酸；（2）以样本中核酸为模板，利用seqidno:1~6、seqidno:13和seqidno:14所示引物，按扩增程序：53~57℃，14~16min；93~96℃，28~32sec；93~96℃，9~11sec，58~62℃，58~62sec，13~17个循环；36~40℃，28~32sec，进行第一轮扩增，使用1~3%（w/w）的琼脂糖凝胶于80~120v进行电泳15~25min，回收第一轮扩增产物；（3）以所述第一轮扩增产物为模板，利用seqidno:7~12、seqidno:13和seqidno:14所示的引物按扩增程序：93~97℃，14~16min；93~95℃，28~32sec，58~62℃，58~62sec，70~74℃，58~62sec，33~37个循环；70~74℃，9~11min；36~40℃，28~32sec，进行第二轮扩增，使用1~3%（w/w）的琼脂糖凝胶于80~120v进行电泳15~25min，回收第二轮扩增产物；（4）利用seqidno:7、seqidno:9和seqidno:11所示的测序引物，对所述第二轮扩增产物进行sanger测序，并对测序结果进行分析。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明的引物组合物具备高特异性，能够针对sars-cov-2的s蛋白特定区域进行高特异逆转录巢式pcr；（2）本发明利用所述引物组合物行逆转录巢式pcr，并结合sanger测序，能够快速、准确地获取sars-cov-2基因信息，从而能够实现快速检测sars-cov-2以及判断sars-cov-2突变株，且具备良好的准确性、灵敏度、特异性以及重复性。附图说明图1为实施例2中第二轮扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；图2为实施例2中1号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变起始位置，g.21765_21770del(p.hv69_70del)突变；图3为实施例2中2号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.g22813t(p.k417n)突变；图4为实施例2中2号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.g23012a(p.e484k)无突变；图5为实施例2中2号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.a23063t(p.n501y)无突变；图6为实施例2中3号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.a23403g(p.d614g)突变；图7为实施例2中3号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.c23604a(p.p681h)无突变；图8为实施例3中第二轮扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；图9为实施例3中1号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变起始位置，g.21765_21770del(p.hv69_70del)突变；图10为实施例3中2号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.g22813t(p.k417n)突变；图11为实施例3中2号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.g23012a(p.e484k)突变；图12为实施例3中2号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.a23063t(p.n501y)无突变；图13为实施例3中3号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.a23403g(p.d614g)无突变；图14为实施例3中3号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.c23604a(p.p681h)无突变。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1本实施例提供一种sars-cov-2检测试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括seqidno.1~12所示的引物组合物、seqidno.7，9，11所示的测序引物、pcr反应的试剂和sanger测序的试剂，其中pcr反应的试剂包括宝瑞生物的逆转录扩增mix、宝瑞生物的混合酶（包含热启动taq酶、逆转录酶、ung酶）、qiagen的10×buffer、qiagen的5qsolution、qiagen的25mmmg2+、qiagen的25mmdntps和h2o，sanger测序的试剂为赛默飞的bigdyeterminatorv3.1cyclesequencingkit（包括：bigdye，5×seqbuffer）。所述使用方法包括：（1）采集鼻咽拭子样本；（2）采用磁珠法提取核酸；（3）使用核苷酸序列如seqidno.1~12所示的引物组合进行扩增反应，第一轮扩增反应的体系为30μl，primers由seqidno.1~6所示的引物组合混合而成，反应体系如表6所示。表6第一轮扩增反应程序如表7所示。表7第二轮扩增反应的体系为50μl，primers为seqidno.7-12所示的引物组合，反应体系如表8所示。表8第二轮扩增反应程序如表9所示。表9（3）扩增产物的琼脂糖凝胶电泳及回收用2%（w/w）的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为100v，20min，采用离心柱型普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒（天根，catno.dp209-03）回收扩增产物；（4）sanger测序以第二轮扩增产物为模板，使用核苷酸序列如seqidno.7，9，11所示的测序引物进行sanger测序，采用bigdyeterminator试剂盒进行测序pcr，将测序pcr产物用酒精纯化，加入hi-di甲酰胺，上样，按照abi3500xldx的仪器说明书进行设置开始运行程序，下机后进行结果分析。其中，测序pcr反应的体系为10μl，具体体系如表10所示。表10组份体积（μl）bigdye0.55×seqbuffer1.75引物1模板1水补足至10测序pcr反应的程序如表11所示。表11实施例2本实施例使用实施例1所述试剂盒及使用方法对sars-cov-2（样本来源：凯普医学检验所检测人源标本的剩余核酸样本）进行检测，具体对sars-cov-2s蛋白基因突变g.21765_21770del（p.hv69_70del）、g.a22812c（p.k417t）、g.g22813c/t（p.k417n）、g.g23012a（p.e484k）、g.a23063t（p.n501y）、g.a23403g（p.d614g）和g.c23604a（p.p681h）进行检测。如表5所示，seqidno:1、2和seqidno:7、8分别为g.21765_21770del(p.hv69_70del)区段的第一轮扩增和第二轮扩增的引物，首先以seqidno:1、2所示引物进行第一轮扩增，并以seqidno:7、8所示引物进行第二轮扩增，得到1号扩增产物，同理，以seqidno:3、4所示引物进行第一轮扩增，并以seqidno:9、10所示引物进行第二轮扩增，得到2号扩增产物；以seqidno:5、6所示引物进行第一轮扩增，并以seqidno:11、12所示引物进行第二轮扩增，得到3号扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，左侧第一泳道为dnamarker（条带大小由上至下分别为1000bp，700bp，500bp，400bp，300bp，200bp和100bp），左数第2-5泳道分别为1~3号第二轮扩增产物以及内参扩增产物，回收各扩增产物，并进行sanger测序，结果如图2-图7所示，样本检测结果为g.21765_21770del(p.hv69_70del)、g.g22813t(p.k417n)和g.a23403g(p.d614g)突变。实施例3本实施例使用实施例1所述试剂盒及使用方法对sars-cov-2（样本来源：假病毒的rna样本，假病毒购买于广州艾基生物技术有限公司）进行检测，具体对sars-cov-2s蛋白基因突变g.21765_21770del（p.hv69_70del）、g.a22812c（p.k417t）、g.g22813c/t（p.k417n）、g.g23012a（p.e484k）、g.a23063t（p.n501y）、g.a23403g（p.d614g）和g.c23604a（p.p681h）进行检测。如表5所示，seqidno:1、2和seqidno:7、8分别为g.21765_21770del(p.hv69_70del)区段的第一轮扩增和第二轮扩增的引物，首先以seqidno:1、2所示引物进行第一轮扩增，并以seqidno:7、8所示引物进行第二轮扩增，得到1号扩增产物，同理，以seqidno:3、4所示引物进行第一轮扩增，并以seqidno:9、10所示引物进行第二轮扩增，得到2号扩增产物；以seqidno:5、6所示引物进行第一轮扩增，并以seqidno:11、12所示引物进行第二轮扩增，得到3号扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示，左侧第一泳道为dnamarker（条带大小由上至下分别为1000bp，700bp，500bp，400bp，300bp，200bp和100bp），左数第2-5泳道分别为1~3号第二轮扩增产物以及内参扩增产物，回收各扩增产物，并进行sanger测序，结果如图9-图14所示，样本检测结果为g.21765_21770del（p.hv69_70del）、g.g22813t（p.k417n）、g.g23012a（p.e484k）突变。实施例4本实施例使用实施例1所述试剂盒及使用方法对已知突变情况的sars-cov-2样本进行检测，从而对本发明检测试剂盒及使用方法进行性能验证，验证性能分为四部分：准确度验证、灵敏度与特异性验证、最低检出量验证、重复性验证。准确度验证结果如表12所示。表12灵敏度检测结果如表13所示。表13特异性检测结果如表14所示。表14最低检出量检测结果如表15所示。表15重复性检测结果如表16和表17所示。表16表17综上所述，本发明采用所述引物组合物具备高特异性，能够针对sars-cov-2的s蛋白特定区域进行高特异逆转录巢式pcr，本发明利用所述引物组合物行逆转录巢式pcr，并结合sanger测序，能够快速、准确地获取sars-cov-2基因信息，从而能够实现快速检测sars-cov-2以及判断sars-cov-2突变株，且具备良好的准确性、灵敏度、特异性以及重复性。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>广东凯普生物科技股份有限公司，北京凯普医学检验实验室有限公司，郑州凯普医学检验所（有限合伙），广州凯普医药科技有限公司<120>一种检测sars-cov-2的引物组合物及其应用<130>20210428<160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列<400>1cagtgtgttaatcttacaaccagaac26<210>2<211>29<212>dna<213>人工序列<400>2cagactttaataacaacattagtagcgtt29<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3gaacaggaagagaatcagcaac22<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<400>4actcagtaagaacacctgtgcct23<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列<400>5gtttctgcctttccaacaatttggc25<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6ctgcattcagttgaatcaccac22<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列<400>7tctttcacacgtggtgtttattac24<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<400>8acaataagtagggactgggtcttc24<210>9<211>28<212>dna<213>人工序列<400>9ctgtgttgctgattattctgtcctatat28<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列<400>10aaccattgaagttgaaattgacac24<210>11<211>24<212>dna<213>人工序列<400>11gacattgctgacactactgatgct24<210>12<211>28<212>dna<213>人工序列<400>12ctggtagaatttctgtggtaacactaat28<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列<400>13tcatgaggagtatgcagactct22<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列<400>14tccacatctgtggattcagca21当前第1页12