检测贾第鞭毛虫的LAMP引物组和试剂盒及应用

检测贾第鞭毛虫的lamp引物组和试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于生物诊断检测技术领域，具体涉及检测贾第鞭毛虫的lamp引物组和试剂盒及应用。


背景技术：

2.贾第鞭毛虫(giardia)是一种极为常见的致病性人兽共患病原虫，也是导致感染性腹泻发生主要病原虫，可以通过饮水、食品、接触等方式进行传播，导致贾第鞭毛虫病的暴发。美国食源性疾病监测组织把贾第鞭毛虫归类为食源性疾病监测的十大寄生虫之一。贾第虫在全世界平均感染率为4％～5％，在感染严重的国家被称为“头号肠道寄生虫”。
3.鉴于贾第鞭毛虫介水、食物传播事件的发生，开展环境介质中贾第鞭毛虫污染检测工作就成为控制感染性腹泻暴发的关键环节。目前，环境介质中贾第鞭毛虫污染检测的主要方法有病原学、分子生物学、免疫学等。病原学检测方法包括湿片或染色后显微镜镜检的方法，其中改良抗酸染色法和碘染色法被认为是诊断贾第鞭毛虫的“金标准”，但该方法需要检测人员具有一定的实际经验，导致本方法存在一定的漏检和误检情况；分子生物学检测方法主要有pcr、rpa、lamp等技术，优点为检测结果可靠，可以处理高通量样品，还可以进一步进行种类鉴定、基因分型、进化树分析等；缺点是过程步骤繁琐、费时费力，客观因素导致的问题较多；免疫学检测法包括荧光标记抗体检测、酶标记抗体检测等方法基于抗原和抗体的特异性结合原理，需要提取血清或组织，但操作稍困难。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供检测贾第鞭毛虫的lamp引物组和试剂盒及应用，所述lamp引物组和试剂盒的检测灵敏度高、特异性好，并具有良好的重复性和稳定性，从而为贾第鞭毛虫污染防控提供确实可行的现场快速检测技术。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一组检测贾第鞭毛虫的lamp引物组，所述lamp引物组包括外引物f3、外引物b3、内引物f1p和内引物b1p；
7.所述外引物f3的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述外引物b3的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述内引物f1p的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述内引物b1p的核苷酸序列如seq id no.4所示。
8.本发明还提供了一种包括上述lamp引物组的检测贾第鞭毛虫的试剂盒。
9.优选的，所述试剂盒中还包括warmstart lamp 2
×
master mix和molecularbiology grade h2o。
10.述阳性对照样品为包含贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶编码基因的重组质粒。
11.本发明还提供了一种上述lamp引物组或上述试剂盒在制备特异性检测贾第鞭毛虫的产品中的应用。
12.优选的，利用所述产品特异性检测贾第鞭毛虫时，构建检测体系进行lamp反应，所
述检测体系以25μl计，包括：warmstart lamp 2
×
master mix12.5μl，lamp引物组0.5μl，dna模板5μl和余量的molecularbiology grade h2o。
13.优选的，所述检测体系中，内引物fip和内引物b1p的浓度均为16μmol/l，外引物f3和外引物b3的浓度均为2μmol/l。
14.优选的，所述lamp反应的程序包括65℃反应30min。
15.本发明提供了一组检测贾第鞭毛虫的lamp引物组，所述lamp引物组以贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶(tpi)基因作为靶基因设计引物。本发明实施例中，以包含tpi基因序列的人工合成质粒为模板，建立基于lamp微流控芯片的贾第鞭毛虫检测方法，该方法可在30min内完成贾第鞭毛虫核酸的扩增，检测敏感度达到10拷贝/μl和0.01ng核酸/μl，对贾第鞭毛虫的特异性良好，隐孢子虫、旋毛虫、艾美耳球虫、戊肝病毒和粪肠球菌核酸均不能扩增。
附图说明
16.图1为lamp微流控芯片方法扩增贾第鞭毛虫基因组dna结果，可特异性扩增tpi基因；
17.图2为以重组质粒为模板验证贾第鞭毛虫lamp微流控芯片检测方法的灵敏性，其最低检测限为4.0
×
101拷贝/μl；
18.图3为贾第鞭毛虫核酸为模板的lamp微流控芯片方法的灵敏性，灵敏度为0.01ng/μl；
19.图4为lamp微流控芯片检测贾第鞭毛虫的特异性结果，显示对贾第鞭毛虫具有良好特异性；
20.图5为lamp微流控法检测贾第鞭毛虫的重复性结果，显示不同浓度梯度的基因组重复性良好；
21.图6为lamp微流控法检测贾第鞭毛虫基因组dna标准曲线，y＝
‑
2.4076x+32.717，r2＝0.9704，其中x为log
10
dna拷贝数，y为tt值(min)；
22.图7为lamp微流控法检测贾第鞭毛虫实际样品，检出率高。
具体实施方式
23.本发明提供了一组检测贾第鞭毛虫的lamp引物组，所述lamp引物组包括外引物f3、外引物b3、内引物f1p和内引物b1p；
24.所述外引物f3的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述外引物b3的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述内引物f1p的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述内引物b1p的核苷酸序列如seq id no.4所示(表1)。
25.表1检测贾第鞭毛虫的lamp引物组信息
[0026][0027]
本发明所述lamp引物组优选根据贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶(tpi)基因序列(genbank号hq603778)设计得到，并由上海生工科技公司合成贾第鞭毛虫特异性引物(f3、b3、f1p和b1p)。
[0028]
本发明还提供了一种包括上述lamp引物组的检测贾第鞭毛虫的试剂盒。
[0029]
本发明所述试剂盒中优选还包括warmstart lamp 2
×
master mix和molecularbiology grade h2o。在本发明中，所述试剂盒中所述引物组的总工作浓度优选为36μmol/l，各引物间的摩尔比优选为内外引物f3：内外引物b3：外内引物f1p：外内引物b1p＝1:1:8:8。
[0030]
本发明还提供了一种上述lamp引物组或上述试剂盒在制备特异性检测贾第鞭毛虫的产品中的应用。
[0031]
在本发明中，当利用所述产品特异性检测贾第鞭毛虫时，优选构建检测体系进行lamp反应，所述检测体系以25μl计，优选包括：warmstart lamp2
×
mastermix 12.5μl，lamp引物组0.5μl，dna模板5μl和余量的molecular biology grade h2o。本发明所述检测体系中，内引物fip和内引物b1p的浓度优选均为16μmol/l，外引物f3和外引物b3的浓度优选均为2μmol/l。本发明所述lamp反应的程序优选包括65℃反应30min。
[0032]
下面结合实施例对本发明提供的检测贾第鞭毛虫的lamp引物组和试剂盒及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0033]
实施例1
[0034]
1、由上海生工科技公司合成表1所示的贾第鞭毛虫特异性引物(f3、b3、f1p和b1p)。
[0035]
基于lamp微流控芯片技术检测贾第鞭毛虫的反应体系见表2。首先，通过加热干燥的方法将1μl混合引物(引物浓度为内引物fip 16μmol/l、内引物bip 16μmol/l、外引物f32μmol/l、外引物b32μmol/l。)预先固定在4个反应孔中，以灭菌纯净水为空白对照。将含有25μl预混反应液直接用移液枪注入微流控芯片的样品孔中，用薄膜密封样品孔和通风孔。然后将预处理的微流控芯片放入微流控仪内，在65℃下反应30min，扩增结果如图1所示，可特异性扩增贾第鞭毛虫的tpi基因。采用1.5％标准琼脂糖凝胶电泳对lamp扩增产物进行检测。一般情况下，只有在一次重复的实验中样品出现阳性信号，而阴性对照在30min内无阳性信号时，扩增结果才被认为是阳性。
[0036]
表2贾第鞭毛虫lamp扩增反应体系
[0037][0038]
2、lamp微流控芯片技术检测贾第鞭毛虫灵敏性
[0039]
将贾地鞭毛虫的tpi基因连接在puc57克隆载体的smal位点合成重组质粒，此质粒为本发明中贾第鞭毛虫检测方法建立的模板。分别以含104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、100拷贝/μl、10
‑1拷贝/μl贾第鞭毛虫重组质粒，以重组质粒为模板进行lamp微流控芯片扩增实验，通过观察出现扩增信号的时间(tt值)，评价检测贾第鞭毛虫的灵敏性。结果如图2所示，最低检测限为4.0
×
101拷贝/μl。
[0040]
分别以1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl贾第鞭毛虫基因组dna为模板进行lamp微流控芯片扩增实验，通过观察tt值，评价检测贾第鞭毛虫的灵敏性。结果如图3所示，灵敏度为0.01ng/μl。
[0041]
3、lamp微流控芯技术检测贾第鞭毛虫的特异性
[0042]
分别以贾第鞭毛虫、旋毛虫、艾美耳球虫、隐孢子虫、戊肝病毒、粪肠球菌基因组dna为模板进行lamp微流控芯片扩增实验，通过观察tt值，评价建立的lamp微流控芯片技术检测贾第鞭毛虫的特异性。结果如图4所示，对贾第鞭毛虫的特异性良好。
[0043]
4、lamp微流控芯片技术检测贾第鞭毛虫的重复性
[0044]
将贾地鞭毛虫的tpi基因连接在puc57克隆载体的smal位点合成重组质粒，分别以高(108拷贝/μl)、中(106拷贝/μl)、低(104拷贝/μl)浓度的贾第鞭毛虫人工合成质粒为模板，通过lamp微流控芯片扩增，通过观察tt，评价对隐孢子虫检测的重复性。结果如图5所示，不同浓度梯度的基因组重复性良好。
[0045]
5、lamp微流控芯片技术检测贾第鞭毛虫的稳定性
[0046]
将贾地鞭毛虫的tpi基因连接在puc57克隆载体的smal位点合成重组质粒，分别以103～108拷贝/μl的贾第鞭毛虫人工合成质粒为模板，通过lamp微流控芯片方法进行贾第鞭毛虫扩增，以tt为评价指标，分析样本浓度与tt之间的相关性，评价方法的稳定性。结果如图6所示，样本核酸浓度与扩增信号出现时间之间具有良好的统计学关系，r＝0.989＞r
0.01,4
＝0.917，相关系数具有统计学意义。
[0047]
6、lamp微流控芯片技术检测贾第鞭毛虫阳性样本验证
[0048]
取6份贾第鞭毛虫感染阳性牛粪样本，提取核酸后，利用建立的lamp微流控芯片技术进行方法验证，以蒸馏水为阴性对照。结果如图7所示，6份贾第鞭毛虫感染阳性牛粪样本均可被检测出来，呈阳性。
[0049]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。