一种水凝胶固定化的微生物保藏方法

本发明属于固定化生物
技术领域：
，具体涉及一种水凝胶固定化的微生物保藏方法。
背景技术：
：菌种是国家的重要生物资源，也是生产、教学和科学研究的基本材料。近年来，越来越多的微生物菌种被研究并运用到食品、医药、农业等各个领域，菌种作为生产的源头，其质量好坏直接关系到产品的产量和品质。在微生物领域，不管是基础科研工作还是生物技术的应用研究，都需要正确的菌种保藏方法和技术，以保证菌种的质量和活力。我国在菌种保藏技术研究领域起步较晚，还没有形成系统性的操作规程，主要存在以下问题：对照试验次数有限，试验种类少，研究技术手段有待进一步更新，对于试验因子(如菌种的菌龄、接种菌丝块的大小、培养基类型、降温冷冻和升温复苏的速度、检测指标、防冻保护剂类型等)的控制研究不足。目前常用的菌种保藏方法为液氮超低温保藏法、真空冷冻干燥保藏法、定期移植法、矿物油保藏法等。部分研究表明前两种方法保藏效果较好，适合菌种长期保藏。然而仍存在着问题，例如即便是同一物种的蛹虫草，不同研究人员使用相似的方法，得出的结论却不尽相同。同时，液氮超低温保藏法和真空冷冻干燥保藏法，需要良好的设备及技术，投入过高，不能广泛应用于生产；后两种方法虽然简单、廉价，但占据的保藏空间较大，且由于转管次数过多，变异的可能性增大，极易造成菌种退化，给生产带来损失。因此，探讨高效廉价、操作简单的菌种保藏方式非常必要，从而获得更加科学和实用的结果。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种水凝胶固定化的微生物保藏方法，该微生物保藏方法以水凝胶为载体，通过固定化技术包埋在载体中，可实现常温长时间贮藏保存及运输；且制得的复合凝胶球载体具有良好的抗压强度，孔隙率高，稳定性好，更有利于微生物附着。本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种复合凝胶球，包括：包埋填料，包括n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺改性的壳聚糖微球；骨架材料，包括海藻酸钠，与包埋填料形成具有互穿或半互穿的网络结构。本发明提供的复合凝胶微球，形状为球状颗粒，孔隙率高，具有加大的比表面积，且无细胞毒性；其内部结构的网络孔隙有利于微生物的附着；各原料分子结构之间通过化学或物理相互作用形成具有互穿或半互穿的网络结构，其溶胀行为可控，从而使得到的微生物载体材料拥有了良好的稳定性；n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺的存在，可有效提升复合凝胶球的溶胀度；同时在大量活性基团的存在下，该微生物载体材料在一定程度上既兼顾了微生物固定化载体的稳定性，又提高了微生物的扩散行为。且制得的复合凝胶球具有优异的机械性能，抗压强度明显提升。需要说明的是，包埋填料由水/油反相乳液交联反应制得活性中间体，再采用n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺进行化学表面修饰而得。需要说明的是，包埋填料与骨架材料在催化剂的作用下通过交联反应形成凝胶球。更进一步地，上述复合凝胶球的制备方法，包括：s1：将壳聚糖粉末加入到乙酸水溶液(浓度为1.8～2.5％，w/w)中，搅拌至完全溶解；在磁力搅拌下加入caco3，搅拌10～15min，然后超声15～20min；接着加入液体石蜡，剧烈搅拌3～5min；40～45℃水浴条件下，滴加span-80，搅拌25～30min；保持水浴搅拌状态，缓慢滴加戊二醛溶液(浓度为23～27％，w/w)，进行交联反应60～70min；最后加入n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺，搅拌反应65～70min后，加入5mnaoh溶液调节ph至10.0～10.5，调节反应温度至70～75℃，继续搅拌反应100～110min；反应产物依次用石油醚、无水乙醇、去离子水多次润洗，并于50℃烘干即得中间产物m；s2：取中间产物m，用0.1m的hcl溶液润洗，除去凝胶球中的caco3颗粒，去离子水洗涤，然后与海藻酸钠于去离子水充分混合，并持续搅拌22～24h，得到混合液a；在搅拌条件下，用注射器将混合液a滴入氯化钙溶液(浓度为4～5％，w/v)中形成离子交联的凝胶球，并进一步硬化22～24h；然后，过滤收集反应后的凝胶球，再用蒸馏水洗去凝胶球表面多余的钙离子，吸干表面多余水分，冷冻干燥20～24h即得复合凝胶球。需要说明的是，步骤s1中caco3与壳聚糖粉末的质量比为0.75～0.82：1；壳聚糖粉末与石蜡的固液比为1g：150～160ml；壳聚糖粉末与span-80的固液比为1g：1.8～2.2ml；壳聚糖粉末与戊二醛溶液的固液比为1g：2～2.3ml；n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺与壳聚糖粉末的质量比为1.76～2.03：1。需要说明的是，步骤s2中间产物m和海藻酸钠的质量比为1：0.8～1.2；海藻酸钠与氯化钙溶液的固液比为0.1g：18～24ml。更进一步地，步骤s2中加入n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺与海藻酸钠的质量比为0.4～0.7：1。n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺的加入，与其它组分交联，制得复合凝胶球，可有效提升凝胶球的抗压强度，改善其机械性能；且可显著增强凝胶球的热稳定性；制得的复合凝胶球负载微生物后，可长时间有效维持微生物活力，进一步延长了保藏期。同时在n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺修饰壳聚糖微球同时存在的条件下，对凝胶球抗压强度以及微生物活性维持时长的增强效果更佳。本发明的又一目的在于，提供了n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺在增强凝胶球的孔隙率和抗压强度中的用途。本发明的再一目的在于，提供了上述复合凝胶球在制备微生物固定化载体中的用途。一种水凝胶固定化的微生物保藏方法，将微生物通过包埋的方法固定在水凝胶固定化载体中，常温下贮藏保存；其水凝胶固定化载体包括上述复合凝胶球。本发明以复合凝胶球为固定化载体，让微生物固定在水凝胶里，制备出的含微生物的水凝胶，可以常温贮藏保存。使用时，将含微生物的水凝胶放入水中，可快速降解将微生物释放出来，微生物也可以快速复活并增殖。本发明提供的复合凝胶球，为球状颗粒，孔隙率高，具有加大的比表面积；其内部结构形成的网络孔隙有利于微生物的附着；可通过氢键或离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型，以防止或降低周围环境对细胞的损害，从而使得该符合凝胶球载体可长时间维持微生物活力，大大延长了保藏期。本发明的菌种保藏方法操作简便，转运方便，微生物生存期长，可常温储存，非常适合临床微生物菌种实验室分离的细菌、真菌等微生物的日常保藏及转运。更进一步地，微生物保藏方法具体为：在上述制备复合凝胶球的过程中，将微生物菌种浓缩液与混合液a混合，在搅拌条件下，用注射器将混合液a滴入氯化钙溶液(浓度为4～5％，w/v)中形成离子交联的凝胶球，并进一步硬化22～24h；然后，过滤收集反应后的凝胶球，再用蒸馏水洗去凝胶球表面多余的钙离子，吸干表面多余水分，冷冻干燥20～24h即得负载微生物的复合凝胶球。需要说明的是，微生物为好氧微生物、兼性微生物或在无氧条件下可以休眠超过2h或可以存活超过2h的微生物中的一种或多种。需要说明的是，微生物菌种浓缩液浓度为1.2～2.6×104mg/l；微生物菌种浓缩液加入量为混合液a质量的0.8～10％。需要说明的是，上述复合凝胶球在延长微生物保藏时间中的用途。相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：本发明以复合凝胶球为固定化载体，让微生物固定在水凝胶里，制备出的含微生物的水凝胶，可以常温贮藏保存。本发明提供的复合凝胶球，为球状颗粒，孔隙率高，具有加大的比表面积，溶胀度较高；且制得的复合凝胶球具有优异的机械性能，抗压强度明显提升。同时，其内部结构形成的网络孔隙有利于微生物的附着，可有效防止或降低周围环境对细胞的损害，从而使得该符合凝胶球载体可长时间维持微生物活力，大大延长了保藏期。除此之外，凝胶球载体制备过程中n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺的加入，可有效提升凝胶球的抗压强度，改善其机械性能，且可显著增强凝胶球的热稳定性；负载微生物后，可长时间有效维持微生物活力，进一步延长了保藏期；在n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺修饰壳聚糖微球同时存在的条件下，对凝胶球抗压强度以及微生物活性维持时长的增强效果更佳。本发明的菌种保藏方法操作简便，转运方便，微生物生存期长，可常温储存，非常适合临床微生物菌种实验室分离的细菌、真菌等微生物的日常保藏及转运。因此，本发明提供了一种水凝胶固定化的微生物保藏方法，该微生物保藏方法以水凝胶为载体，通过固定化技术包埋在载体中，可实现常温长时间贮藏保存及运输；且制得的复合凝胶球载体具有良好的抗压强度，孔隙率高，稳定性好，更有利于微生物附着。附图说明图1为本发明试验例1中对比例1制得中间体m的sem测试结果；图2为本发明试验例1中实施例1制得中间体m的sem测试结果；图3为本发明试验例1中热重分析测试结果。具体实施方式以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：实施例1：一种复合凝胶球的制备：s1：将壳聚糖粉末加入到乙酸水溶液(浓度为2.1％，w/w)中，搅拌至完全溶解；在磁力搅拌下加入caco3(与壳聚糖粉末的质量比为0.79：1)，搅拌12min，然后超声15min；接着加入液体石蜡(壳聚糖粉末与石蜡的固液比为1g：156ml)，剧烈搅拌5min；43℃水浴条件下，滴加span-80(壳聚糖粉末与span-80的固液比为1g：2.1ml)，搅拌30min；保持水浴搅拌状态，缓慢滴加戊二醛溶液(浓度为24.5％，w/w)(壳聚糖粉末与戊二醛溶液的固液比为1g：2.2ml)，进行交联反应65min；最后加入n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺(与壳聚糖粉末的质量比为1.87：1)，搅拌反应70min后，加入5mnaoh溶液调节ph至10.2，调节反应温度至74℃，继续搅拌反应110min；反应产物依次用石油醚、无水乙醇、去离子水多次润洗，并于50℃烘干即得中间产物m；s2：取中间产物m，用0.1m的hcl溶液润洗，除去凝胶球中的caco3颗粒，去离子水洗涤，然后与海藻酸钠(两者质量比为1：0.96)于去离子水充分混合，并持续搅拌22h，得到混合液a；在搅拌条件下，用注射器将混合液a滴入氯化钙溶液(浓度为4.3％，w/v)(海藻酸钠与氯化钙溶液的固液比为0.1g：21.3ml)中形成离子交联的凝胶球，并进一步硬化24h；然后，过滤收集反应后的凝胶球，再用蒸馏水洗去凝胶球表面多余的钙离子，吸干表面多余水分，冷冻干燥24h即得复合凝胶球。实施例2：一种复合凝胶球的制备与实施例1的不同之处在于：步骤s1中caco3与壳聚糖粉末的质量比为0.76：1；壳聚糖粉末与戊二醛溶液的固液比为1g：2ml；n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺与壳聚糖粉末的质量比为1.80：1；步骤s2中间产物m和海藻酸钠的质量比为1：0.8～1.2；海藻酸钠与氯化钙溶液的固液比为0.1g：18.4ml。实施例3：一种复合凝胶球的制备与实施例1的不同之处在于：步骤s1中caco3与壳聚糖粉末的质量比为0.81：1；壳聚糖粉末与戊二醛溶液的固液比为1g：2.3ml；n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺与壳聚糖粉末的质量比为2.01：1；步骤s2中间产物m和海藻酸钠的质量比为1：1.16；海藻酸钠与氯化钙溶液的固液比为0.1g：23.6ml。实施例4：一种复合凝胶球的制备与实施例1的不同之处在于：步骤s2中加入n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺与海藻酸钠的质量比为0.54：1。实施例5：一种复合凝胶球的制备与实施例4的不同之处在于：步骤s1中不添加n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺。实施例6：一种水凝胶固定化的微生物保藏方法，包括：将微生物菌株从原料中筛选并纯化富集，并在其生长对数期加入实施例1制备复合凝胶球过程中，得到负载微生物的复合凝胶球，常温贮藏保存即可。其中，微生物菌种浓缩液浓度为2.1×104mg/l；微生物菌种浓缩液加入量为混合液a质量的7.8％。实施例7：一种水凝胶固定化的微生物保藏方法与实施例6的不同之处在于：复合凝胶球为实施例4制得的。实施例8：一种水凝胶固定化的微生物保藏方法与实施例6的不同之处在于：复合凝胶球为实施例5制得的。对比例1：一种复合凝胶球的制备与实施例1的不同之处在于：步骤s1中不添加n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺。对比例2：一种水凝胶固定化的微生物保藏方法与实施例6的不同之处在于：复合凝胶球为对比例1制得的。试验例1：1、sem测试将样品常温干燥后，经过喷金处理，将其置于场发射扫描电镜下，观察样品的表面形貌。对对比例1和实施例1中制得的中间体m进行上述测试，结果如图1～2所示。从图中分析可知，相比于对比例1，实施例1制得的中间体m的表面更加粗糙，侧面证明了n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺对壳聚糖微球表面修饰成功。2、热重分析(tga)将冷冻干燥好的凝胶球样品，采用sta7300热分析仪在n2的氛围下，以10℃/min升温速率，在0～800℃范围内，对样品的热稳定性进行测试。对对比例1、实施例1和实施例4制得的凝胶样品进行上述测试，结果如图3所示。从图中分析可知，本发明制得的复合凝胶球的热重损失主要分三个阶段。相比于对比例1，实施例1制得复合凝胶球各阶段分解温度与其无明显差异，而实施例4制得样品各阶段分解温度要高于实施例1，且失重量要少于实施例1，表明n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺的加入，与其它组分交联，制得复合凝胶球，可有效提升凝胶球的热稳定性。3、抗压强度测试将凝胶球样品置于两片载玻片之间，采用便携式压力计垂直挤压凝胶球，按照p＝f/s，其中，f为凝胶球破碎时系统记录的压力大小，s为压力传感器接触面积。对对比例1、实施例1～5制得的凝胶球进行上述测试，结果如表1所示：表1抗压强度测试结果从表1中分析可知，实施例1制得凝胶球的抗压强度明显高于对比例1，表明采用n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺对壳聚糖微球进行表面修饰，再与海藻酸钠进行交联制得复合凝胶球，可有效增强凝胶球的抗压强度。实施例5制得复合凝胶球的抗压强度高于对比例1，表明n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺的加入，与其它组分交联，可显著提升凝胶球的抗压能力，改善其机械性能。除此之外，实施例4的效果要好于实施例1和实施例5，表明在n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺修饰壳聚糖微球与n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺同时存在的条件下，对凝胶球抗压强度增强效果更佳。4、水凝胶溶胀度测试将冷冻干燥后的干燥凝胶球称重，质量为(wd)，在20℃、ph中性条件下浸泡溶胀，间隔60h取出，并用滤纸吸干表面水分，溶胀后质量为wt，多次测量至溶胀平衡，根据下列公式计算溶胀度sr：sr＝(wt－wd)/wd×100％式中，wd为初始干燥凝胶质量，g；wt为t时刻溶胶凝胶质量，g；sr为溶胀度，％。对对比例1、实施例1～5制得的凝胶球进行上述测试，结果如表2所示：表2溶胀特性测试结果样品溶胀度(％)对比例1392实施例1495实施例2501实施例3490实施例4505实施例5403从表2中分析可知，实施例1制得凝胶球的溶胀度明显高于对比例1，表明采用n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺对壳聚糖微球进行表面修饰，再与海藻酸钠进行交联制得复合凝胶球，可有效提升凝胶球的溶胀能力。实施例4制得复合凝胶球的溶胀度与于实施例1相当，实施例5的效果与对比例1相当，表明n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺的加入，与其它组分交联，对凝胶球的溶胀性能无消极影响。5、孔隙率的测试采用溶剂置换法测定干燥凝胶球的孔隙率，以无水乙醇为介质，水凝胶经冷冻干燥后，称其干重为m0；测量凝胶球的高度和直径，计算其体积为v；样品经无水乙醇溶胀平衡后，用滤纸吸取凝胶球表面的液体，测重为m1；无水乙醇的密度为ρ，根据下列公式计算凝胶球的孔隙率pr：pr＝(m1－m0)/(ρv)×100％对对比例1、实施例1～5制得的凝胶球进行上述测试，结果如表3所示：表3孔隙率测试结果样品孔隙率(％)对比例162.9实施例176.2实施例274.5实施例375.7实施例478.1实施例564.3从表3中分析可知，实施例1制得凝胶球的孔隙率明显高于对比例1，表明采用n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺对壳聚糖微球进行表面修饰，再与海藻酸钠进行交联制得复合凝胶球，可有效增加凝胶球的孔隙度。实施例4制得复合凝胶球的孔隙率与于实施例1相当，实施例5的效果与对比例1相当，表明n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺的加入，与其它组分交联，对凝胶球的孔隙率无消极影响。试验例2：负载微生物复合凝胶球载体的表征实验微生物为硝化菌1、微生物活性测试在室温25℃下，选取相同菌量的游离硝化菌浓缩液和包埋硝化菌的复合凝胶球分别放入溶氧瓶，溶氧瓶中加入含有含氨氮的培养液(配水组成及比例见表4)，水浴控制温度在25～35℃，预曝气10min使溶氧瓶中达到溶解氧饱和，插入溶氧仪探头，迅速加水密封，并用磁力搅拌器进行缓慢搅拌，每隔一定时间测定溶氧瓶中溶解氧的浓度，并将所得溶解氧数据和对应时间作图，从而计算呼吸活性。式中，rr—游离或固定化硝化菌的呼吸活性，mg-o2/l·min；do—t时刻溶氧瓶中的溶氧浓度，mg/l；t—测试时间，min；k—溶氧浓度对时间的斜率。rrr＝rri/rrf×100％式中，rrr—包埋硝化菌的相对呼吸活性，％；rri—包埋固定化硝化菌的呼吸活性，mg-o2/l·min；rrf—游离硝化菌的呼吸活性，mg-o2/l·min。表4硝化细菌培养液组成(nh4+-n：40mg/l)组分浓度(mg/l)nh4cl146nahco3457na2hpo4·12h2o45.1nacl21.6kcl9.4cacl2·2h2o9.3mgso4·7h2o32.5对对比例2、实施例6～8制得的负载微生物的复合凝胶球进行上述测试，结果如表5所示：表5呼吸活性测试结果样品呼吸活性(％)对比例288.4实施例693.4实施例794.7实施例889.3从表5中分析可知，实施例6制得负载微生物的复合凝胶球中硝化菌呼吸活性要明显高于对比例2，表明采用n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺对壳聚糖微球进行表面修饰，再与海藻酸钠进行交联制得复合凝胶球，可有效降低凝胶球的细胞毒性。实施例7制得复合凝胶球的孔隙率与于实施例6相当，实施例8的效果与对比例2相当，表明n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺的加入，与其它组分交联，对凝胶球的细胞毒性不产生消极影响。2、包埋硝化菌活性的恢复将制得的负载微生物的复合凝胶球常温贮藏6个月后，加入水中溶胀，收集菌种浓缩液；采用间歇驯化方式恢复活性，间歇驯化期间采用sbr，载体颗粒按反应器体积填充率10％投加，溶解氧保持在4mg/l，温度在25～30℃，驯化期间采用不同的氨氮初始浓度，培养液的配方如表4所示，浓度增加时，所有药品按照配比增加，在驯化过程中并不加入酸或碱来调节体系ph值。在反应开始后间隔相同的时间测定反应器内nh4+-n、no2－-n、no3－-n的浓度，以nh4+-n降低到初始浓度的10％为一个驯化周期，驯化六个周期后，测定硝化菌的呼吸活性。对对比例2、实施例6～8制得的负载微生物的复合凝胶球进行上述测试，结果如表6所示：表6呼吸活性测试结果样品呼吸活性(％)对比例266.8实施例684.1实施例793.5实施例881.2从表6中分析可知，经过一个月的贮存后，实施例6制得负载微生物的复合凝胶球中硝化菌呼吸活性要明显高于对比例2，且其呼吸活性下降率为9.96％，要高于对比例2的24.43％，表明采用n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺对壳聚糖微球进行表面修饰，再与海藻酸钠进行交联制得复合凝胶球，负载微生物后进行常温贮藏保存，微生物可以快速复活并增殖，有效延长贮藏时间。实施例8制得负载微生物的复合凝胶球中硝化菌呼吸活性降低率为9.07％，显著低于对比例2，表明n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺的加入，与其它组分交联，对凝胶球的贮藏效果具有增强效果。实施例7制得负载微生物的复合凝胶球中硝化菌呼吸活性降低率为1.27％，几乎无显著下降，表明在n-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺修饰壳聚糖微球与n-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺同时存在的条件下，对凝胶球贮藏效果增强更佳。上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12