用于粪便微生物基因组的DNA提取试剂盒及提取方法与流程

用于粪便微生物基因组的dna提取试剂盒及提取方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学核酸提取领域，尤其涉及一种用于粪便微生物基因组的dna提取试剂盒及提取方法。


背景技术：

2.近年来关于肠道菌群的研究不断涌现，肠道菌群在人类健康中的作用也越来越得到人们关注。肠道菌群是人体肠道的正常微生物，种类繁多，数目众多。据估算，一个正常成人体内，肠道细菌总重量可达1～1.5kg。它们能够影响体重和消化能力，抵御感染和自身免疫疾病的患病风险，除此之外，还与一些内分泌代谢性疾病、肾脏疾病、神经性疾病、心血管疾病、呼吸系统疾病以及癌症的发生具有密切关联。
3.因此研究肠道菌群响的特别重要，通过查看宿主肠道菌群状态可以判断宿主健康情况或与疾病的关系，并可据此提供改善或治疗的方案。当前主要通过16s rdna或宏基因组研究肠道菌群分布情况或变化情况，所以获取肠道菌群核酸dna是后续研究的基础。但是，目前传统的核酸提取方法步骤繁琐、耗时，市售的粪便微生物基因组dna提取试剂盒价格高，所以提供一种操作简单易行、成本低、提取效果好的试剂盒可以大大的提高对肠道菌群的研究范围。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题在于提出一种用于粪便微生物基因组的dna提取试剂盒，可有效地去除粪便中的腐殖酸、多糖、多酚、色素等pcr抑制剂，使医护工作者通过本申请的dna提取试剂盒可以便捷高效地提取粪便微生物基因组dna，有助于医护工作者对肠道菌群进行研究，为后续pcr或高通量建库提供质量保证。
5.与此相应，本发明另一个所要解决的技术问题在于提出一种用于粪便微生物基因组的dna提取试剂盒的提取方法，按除杂步骤、裂解步骤、漂洗步骤以及洗脱步骤依次执行，使医护工作者通过本方法简单便捷地实现核酸提取，操作简单易行，提取效果可靠优良。
6.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明提供的一种用于粪便微生物基因组的dna提取试剂盒，包括除杂液a、裂解液b、漂洗液c、漂洗液d以及洗脱液e，除杂液a、裂解液b、漂洗液c、漂洗液d以及洗脱液e依次加入试管中与粪便微生物相反应，以提取dna，除杂液a包括以下物质：ctab、edta、pvp30、nacl、tritonx
‑
100、tween
‑
20、柠檬酸以及柠檬酸钠；裂解液b包括以下物质：盐酸胍、ctab、pvp30、柠檬酸以及柠檬酸钠。
8.本发明优选的技术方案在于，在除杂液a中，ctab的质量比范围配置为1～3％m/m，edta的体积摩尔浓度范围配置为20～30mm，pvp30的质量比范围配置为1～3％m/m，nacl的体积摩尔浓度范围配置为1.5～2.0m，tritonx
‑
100的体积比范围配置为1～3％v/v，tween
‑
20的体积比范围配置为0.5～1％v/v，柠檬酸的体积摩尔浓度范围配置为0.1～0.5m，柠檬酸钠的体积摩尔浓度范围配置为0.2～1m，除杂液a的ph范围配置为4.0～4.5。
9.本发明优选的技术方案在于，在裂解液b中，盐酸胍的体积摩尔浓度范围配置为4～6m，ctab的质量比范围配置为0.5～1.5％m/m，pvp30的质量比范围配置为0.5～1.5％m/m，柠檬酸的体积摩尔浓度范围配置为0.1～0.5m，柠檬酸钠的体积摩尔浓度范围配置为0.2～1m，裂解液b的ph范围配置为4.0～4.5。
10.本发明优选的技术方案在于，漂洗液c包括以下物质：盐酸胍、nacl以及无水乙醇。
11.本发明优选的技术方案在于，漂洗液d包括以下物质：tris以及无水乙醇。
12.本发明优选的技术方案在于，洗脱液e包括以下物质：tris以及edta。
13.本发明优选的技术方案在于，在漂洗液c中，盐酸胍的体积摩尔浓度范围配置为2～4m，nacl的体积摩尔浓度配置为0.15m，无水乙醇的体积比配置为56％v/v。
14.本发明优选的技术方案在于，在漂洗液d中，tris的体积摩尔浓度配置为25mm，无水乙醇的体积比配置为70％v/v，漂洗液d的ph范围配置为7～7.5。
15.本发明优选的技术方案在于，在洗脱液e中，tris的体积摩尔浓度配置为10mm，edta的体积摩尔浓度配置为0.5mm，洗脱液e的ph配置为8.0。
16.本发明提供的一种用于粪便微生物基因组的dna提取试剂盒的提取方法，按除杂步骤、裂解步骤、漂洗步骤以及洗脱步骤依次执行，
17.除杂步骤具体包括以下步骤：
18.1)称取新鲜粪便置于灭菌离心管中；
19.2)添加除杂液a到上述离心管中，在涡旋振荡器中匀质化5min；
20.3)将匀质化后的样品置于70℃的金属浴中孵育5min，期间每隔2min分钟上下颠倒混匀1次：
21.4)孵育结束后，将样品放于离心机中14000rpm离心1min；
22.其中，每200mg的粪便加入1ml的除杂液a；
23.裂解步骤具体包括以下步骤：
24.5)取第4)步骤的上清液于一新的灭菌离心管中；
25.6)加入裂解液b和蛋白酶k；
26.7)上下颠倒混匀多次后，放于70℃的金属浴中孵育10min，期间每隔3min分钟上下颠倒混匀1次：
27.8)孵育结束，加入无水乙醇；
28.9)轻轻上下颠倒混匀，吸取灭菌离心管溶液过核酸纯化吸附柱，放于离心机中12000rpm离心30s；
29.10)丢弃废液；
30.11)重复第9)步骤～第10)步骤直至裂解液全部过柱；
31.漂洗步骤具体包括以下步骤：
32.12)向吸附柱中加入漂洗液c，放于离心机中12000rpm离心30s；
33.13)丢弃废液；
34.14)向吸附柱中加入漂洗液d，放于离心机中12000rpm离心30s；
35.15)丢弃废液；
36.16)将吸附柱重新放于离心机中，放于离心机中12000rpm空离3min；
37.洗脱步骤具体包括以下步骤：
38.17)转移吸附柱到无菌离心管中，加入洗脱液e；
39.18)室温孵育1min后，放于离心机中12000rpm离心2min回收洗脱液；
40.其中，除杂液a、第4)步骤的上清液、裂解液b、蛋白酶k、第8)步骤的无水乙醇、漂洗液c、漂洗液d以及洗脱液e之间依次按照1000：600：600：25：600：600：600：60的比例进行配比添加。
41.本发明的有益效果为：
42.本发明提供的用于粪便微生物基因组的dna提取试剂盒及提取方法，医护工作者向粪便样本中添加除杂液a后，可方便去除蛋白质、多糖、酚类等杂质，以便分离出粪便微生物基因组核酸，再添加裂解液b，可破坏细胞膜、核膜，并使蛋白质与dna分离，抑制细胞中dnase的活性，以便裂解宿主细胞组织或者细菌、真菌、病毒等微生物，再添加漂洗液c以及漂洗液d，对蛋白质、多糖、酚类等杂质进行进一步的漂洗过滤，提高提取的dna纯度，最后添加洗脱液e，对粪便微生物基因组dna进行洗脱纯化分离。。相较于市售粪便dna提取试剂盒而言，本申请的dna提取试剂盒在保证dna提取效果满足需求的前提下，成本更低廉。通过上述过程和物质，不仅能够有效地去除粪便中的腐殖酸、多糖、多酚、色素等pcr抑制剂，而且能够方便、经济、快捷的得到纯度高、回收率高、完整性好的dna，使医护工作者通过本申请的dna提取试剂盒可以便捷高效地提取粪便微生物基因组dna，有助于医护工作者对肠道菌群进行研究，为后续pcr或高通量建库提供质量保证。
附图说明
43.图1是本发明具体实施方式中提供的基因组dna琼脂糖凝胶电泳质检所得gdna完整性的示意图；
44.图2是本发明具体实施方式中提供的用于粪便微生物基因组的dna提取试剂盒与国外一市售试剂盒菌群分别进行建库测序分析后分布对比示意图。
具体实施方式
45.下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
46.实施例一
47.为了使医护工作者通过本申请的dna提取试剂盒可以便捷高效地提取粪便微生物基因组dna，有助于医护工作者对肠道菌群进行研究，为后续pcr或高通量建库提供质量保证，进一步地，本实施例中提供的一种用于粪便微生物基因组的dna提取试剂盒，包括除杂液a、裂解液b、漂洗液c、漂洗液d以及洗脱液e，除杂液a、裂解液b、漂洗液c、漂洗液d以及洗脱液e依次加入试管中与粪便微生物相反应，以提取dna，除杂液a包括以下物质：ctab、edta、pvp30、nacl、tritonx
‑
100、tween
‑
20、柠檬酸以及柠檬酸钠；裂解液b包括以下物质：盐酸胍、ctab、pvp30、柠檬酸以及柠檬酸钠。优选地，在除杂液a中，ctab的质量比范围配置为1～3％m/m，edta的体积摩尔浓度范围配置为20～30mm，pvp30的质量比范围配置为1～3％m/m，nacl的体积摩尔浓度范围配置为1.5～2.0m，tritonx
‑
100的体积比范围配置为1～3％v/v，tween
‑
20的体积比范围配置为0.5～1％v/v，柠檬酸的体积摩尔浓度范围配置为0.1～0.5m，柠檬酸钠的体积摩尔浓度范围配置为0.2～1m，除杂液a的ph范围配置为4.0～4.5。优选地，在裂解液b中，盐酸胍的体积摩尔浓度范围配置为4～6m，ctab的质量比范围配
置为0.5～1.5％m/m，pvp30的质量比范围配置为0.5～1.5％m/m，柠檬酸的体积摩尔浓度范围配置为0.1～0.5m，柠檬酸钠的体积摩尔浓度范围配置为0.2～1m，裂解液b的ph范围配置为4.0～4.5。医护工作者向粪便样本中添加除杂液a后，可方便去除蛋白质、多糖、酚类等杂质，以便分离出粪便微生物基因组核酸，再添加裂解液b，可破坏细胞膜、核膜，并使蛋白质与dna分离，抑制细胞中dnase的活性，以便裂解宿主细胞组织或者细菌、真菌、病毒等微生物，再添加漂洗液c以及漂洗液d，对蛋白质、多糖、酚类等杂质进行进一步的漂洗过滤，提高提取的dna纯度，最后添加洗脱液e，对粪便微生物基因组dna进行洗脱纯化分离。其中，nacl用以提供高盐环境，使dna充分溶解于液相中，沉淀dna时总会加入高浓度的盐，加nacl的目的是破坏能使蛋白质保持稳定的两个因素，使蛋白和dna分离并沉淀下来。而此时盐的阳离了会与dna结合形成dna
‑
阳离子盐溶于溶液中，再用无水乙醇可以将dna
‑
阳离子盐沉淀下来。ctab是一种在高盐下能和核酸结合形成可溶、稳定的复合物，低盐浓度下可沉淀的表面活性剂，在低离子强度(0.1
‑
0.5m nacl)下，可沉淀核酸与酸性多聚糖，而蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液中。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/l的nacl)，ctab与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。edta是酶抑制剂，可螯合二价金属，抑制金属依赖性的酶。因此，通过添加edta，可螯合mg
2+
或mn
2+
离子，抑制细胞中dnase酶的活性，该酶可降解dna，edta是一种二价离子熬合剂，能熬合mg
2+
和ca
2+
等二价阳离子，而多种rna酶的活性是需要依赖二价阳离子的，所以edta能通过熬合二价阳离子来抑制rna酶的活性，以保证提取的微生物基因组dna的完整性。pvp30可减少酚类、醌类、单宁类物质的影响，起抗氧化作用，络合多酚和萜类物质，防止多酚类褐变而氧化，去除多糖和色素，由于色素是pcr强抑制剂，必须去除。tritonx
‑
100是一种比较温和的去垢剂，作为添加剂可使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白，使得蛋白酶k在1％tritonx
‑
100的溶液中仍然保持活性，以便后续添加蛋白酶k来将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使dna分子完整地分离出来。且tritonx
‑
100对细菌等微生物没有杀伤作用，以保证提取的微生物dna的完整性。tween
‑
20是一种非离子型表面活性剂，用于洗脱未结合的蛋白、减少非特异性结合。一些融合蛋白在0.2％triton x
‑
100或0.25％tween
‑
20的存在下不能有效结合，而其他融合蛋白则不受影响。柠檬酸用以使试剂维持在酸性环境中。柠檬酸钠可以控制反应体系的离子强度，同时还有一定的缓冲作用，保证体系ph的相对稳定状态。盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，它并不是一种足够强的变性剂，可以允许完整的rna从富含rnase的组织中提取出来。相较于市售粪便dna提取试剂盒而言，本申请的dna提取试剂盒在保证dna提取效果满足需求的前提下，成本更低廉。通过上述过程和物质，不仅能够有效地去除粪便中的腐殖酸、多糖、多酚、色素等pcr抑制剂，而且能够方便、经济、快捷的得到纯度高、回收率高、完整性好的dna，使医护工作者通过本申请的dna提取试剂盒可以便捷高效地提取粪便微生物基因组dna，有助于医护工作者对肠道菌群进行研究，为后续pcr或高通量建库提供质量保证。
48.优选地，漂洗液c包括以下物质：盐酸胍、nacl以及无水乙醇。在漂洗液c中，盐酸胍的体积摩尔浓度范围配置为2～4m，nacl的体积摩尔浓度配置为0.15m，无水乙醇的体积比配置为56％v/v。盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，但不是一种足够强的变性剂，可以允许完整的rna从富含rnase的组织中提取出来，盐酸胍溶液可溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，从核酸上解离下来，此外，rna酶可被盐酸胍等还原剂灭活。用无水乙
醇和水相混溶制成56％v/v乙醇，用56％v/v乙醇沉淀dna，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对dna很安全。通过配比低浓度的0.15m的nacl，可沉淀核酸与酸性多聚糖。通过上述物质，可去除残余的蛋白质等大分子物质，充分沉淀dna，以便提取完整的dna。
49.优选地，漂洗液d包括以下物质：tris以及无水乙醇。在漂洗液d中，tris的体积摩尔浓度配置为25mm，无水乙醇的体积比配置为70％v/v，漂洗液d的ph范围配置为7～7.5。由于70％v/v乙醇里dna是不溶的，而盐离子却可溶，所以可用70％乙醇洗涤dna沉淀，乙醇对于蛋白质、核酸的沉淀效应随分子量加大而增大。通过配比70％v/v乙醇的漂洗dna，是为了去除残余的盐类，去除过量sds和酚等杂物，因为sds在70％v/v乙醇中保持溶解状态，不与dna共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂，避免对以后pcr反应造成影响。通过添加tris，使溶液具有一定的缓冲作用，保证体系ph的相对稳定状态。
50.优选地，洗脱液e包括以下物质：tris以及edta。在洗脱液e中，tris的体积摩尔浓度配置为10mm，edta的体积摩尔浓度配置为0.5mm，洗脱液e的ph配置为8.0。通过配比edta，使edta熬合二价阳离子来抑制rna酶以及dnase酶的活性，以保证提取的微生物基因组dna的完整性。通过配比tris，使溶液具有一定的缓冲作用，保证体系ph的相对稳定状态。
51.实施例二
52.如图1和图2所示，为了使医护工作者通过本方法简单便捷地实现核酸提取，操作简单易行，提取效果可靠优良，进一步地，本实施例中提供的一种用于粪便微生物基因组的dna提取试剂盒的提取方法，按如下除杂步骤、裂解步骤、漂洗步骤以及洗脱步骤依次执行：
53.一、除杂步骤具体包括以下步骤：
54.1)称取新鲜粪便置于灭菌离心管中；
55.2)添加除杂液a到上述离心管中，在涡旋振荡器中匀质化5min；
56.3)将匀质化后的样品置于70℃的金属浴中孵育5min，期间每隔2min分钟上下颠倒混匀1次：
57.4)孵育结束后，将样品放于离心机中14000rpm离心1min；
58.其中，每200mg的粪便加入1ml的除杂液a；
59.二、裂解步骤具体包括以下步骤：
60.5)取第4)步骤的上清液于一新的灭菌离心管中；
61.6)加入裂解液b和蛋白酶k；
62.7)上下颠倒混匀多次后，放于70℃的金属浴中孵育10min，期间每隔3min分钟上下颠倒混匀1次：
63.8)孵育结束，加入无水乙醇；
64.9)轻轻上下颠倒混匀，吸取灭菌离心管溶液过核酸纯化吸附柱，放于离心机中12000rpm离心30s；
65.10)丢弃废液；
66.11)重复第9)步骤～第10)步骤直至裂解液全部过柱；
67.三、漂洗步骤具体包括以下步骤：
68.12)向吸附柱中加入漂洗液c，放于离心机中12000rpm离心30s；
69.13)丢弃废液；
70.14)向吸附柱中加入漂洗液d，放于离心机中12000rpm离心30s；
71.15)丢弃废液；
72.16)将吸附柱重新放于离心机中，放于离心机中12000rpm空离3min；
73.四、洗脱步骤具体包括以下步骤：
74.17)转移吸附柱到无菌离心管中，加入洗脱液e；
75.18)室温孵育1min后，放于离心机中12000rpm离心2min回收洗脱液；
76.其中，除杂液a、第4)步骤的上清液、裂解液b、蛋白酶k、第8)步骤的无水乙醇、漂洗液c、漂洗液d以及洗脱液e之间依次按照1000：600：600：25：600：600：600：60的比例进行配比添加。
77.具体通过以下实验组及对照组进行说明分析。
78.一、主要试剂和仪器
79.(1)试剂
80.实验组：ctab、edta、pvp30、nacl、tritonx
‑
100、tween
‑
20、tris、盐酸胍、柠檬酸和柠檬酸钠由macklin提供；无水乙醇由国药集团生产；
81.对照组：qiaamp fast dna stool mini kit(市售的粪便微生物基因组dna提取试剂盒)
82.(2)仪器
83.multiskan
tm
go酶标仪来自thermofisher scientific；pcr 2720仪来自thermofisher scientific；台式离心机5430来自eppendorf；涡旋振荡器vortex
‑
6来自其林贝尔；凝胶成像系统ks
‑
680d来自上海培清；3.0fluorometer来自thermofisher scientific。
84.二、样本来源
85.验证dna提取试剂盒对微生物基因组dna提取效果的粪便样本来源于新鲜采集的人粪便。
86.三、实验组配方
87.除杂液a：2％(m/m)ctab、25mm edta、1％(m/m)pvp30、1.5m nacl、2％(v/v)tritonx
‑
100、0.5％(v/v)tween
‑
20、0.5m柠檬酸、1m柠檬酸钠、ph为4.2。
88.裂解液b：4m盐酸胍、1％(m/m)ctab、1％(m/m)pvp30、0.5m柠檬酸、1m柠檬酸钠、ph为4.0～4.5。
89.漂洗液c：2m盐酸胍、0.15m nacl、56％(v/v)无水乙醇。
90.漂洗液d：25mm tris、70％(v/v)无水乙醇、ph为7～7.5。
91.洗脱液e：10mm tris、0.5mm edta、ph为8.0。
92.四、dna提取、dna浓度及纯度测定的具体操作步骤
93.(1)实验组
94.1.称取200mg的新鲜粪便置于2ml的灭菌离心管中；
95.2.添加1ml的除杂液a到上述离心管中，在涡旋振荡器中匀质化5min；
96.3.将匀质化后的样品置于70℃的金属浴中孵育5min，期间每隔2min分钟上下颠倒混匀1次：
97.4.孵育结束后，将样品放于离心机中14000rpm离心1min；
98.5.取上清液600ul于一新的2ml灭菌离心管中；
99.6.加入600ul裂解液b和25ul的蛋白酶k；
100.7.上下颠倒混匀15次后，放于70℃的金属浴中孵育10min，期间每隔3min分钟上下颠倒混匀1次：
101.8.孵育结束，加入600ul的无水乙醇；
102.9.轻轻上下颠倒混匀，吸取600ul过核酸纯化吸附柱，于离心机中12000rpm离心30s；
103.10.丢弃废液；
104.11.重复9～10直至裂解液全部过柱；
105.12.向吸附柱中加入600ul的漂洗液c，于离心机中12000rpm离心30s；
106.13.丢弃废液；
107.14.向吸附柱中加入600ul的漂洗液d，于离心机中12000rpm离心30s；
108.15.丢弃废液；
109.16.将吸附柱重新放于离心机中，于离心机中12000rpm空离3min；
110.17.转移吸附柱到1.5ml的无菌离心管中，加入60ul的洗脱液e；
111.18.室温孵育1min后，放于离心机中12000rpm离心2min；
112.19.用酶标仪和qubit3.0检测基因组dna的浓度和纯度；
113.20.1.5％琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的完整性。
114.(2)对照组
115.1.用市售的qiaamp fast dna stool mini kit粪便dna提取试剂盒按操作说明书进行操作，提取粪便dna；
116.2.用酶标仪和qubit3.0检测基因组dna的浓度和纯度；
117.3.1.5％琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的完整性。
118.五、实验结果
119.(1)gdna溶液浓度及纯度测定
120.以人粪便为样本使用本发明专利和市售的qiaamp fast dna stool mini kit进行实验对比，质检如下表1：
121.表1浓度及纯度测定
[0122][0123]
备注：为保证实验结果的准确性，实验组和对照组分别在同一批号的试剂盒中各选取三个相同的样品进行平行实验，其中，qi1、qi2、qi3为qiaamp fast dna stool mini kit试剂盒的3个平行实验，cg1、cgi2、cg3为本发明试剂盒的3个平行实验。
[0124]
(2)对上述实验产生的6个核酸进行1.5％琼脂糖凝胶核酸电泳质检，查看gdna的完整性如图1。
[0125]
(3)取qi1和cg2进行细菌16s v4建库测序分析，进行菌群分布比对如示意图2，细菌16s v4建库引物序列、扩增反应体系及反应条件见如下表2、表3、表4。
[0126]
表2引物序列
[0127]
primer f5
’‑
gtgycagcmgccgcggtaa
‑3’
primer r5
’‑
ggactacnvgggtwtctaat
‑3’
[0128]
表3扩增反应体系
[0129]
kapa 2
×
mix10ulprimer f/r1ultemplate2ulnf
·
h2o7ul
[0130]
表4反应条件
[0131][0132]
(4)结果分析
[0133]
从核酸质检来看，证明了本发明对粪便微生物基因组dna提取效果较好，纯度与qiaamp fast dnastool mini kit相当且完整性好，浓度虽低点，但此回收率足以满足下游实验；
[0134]
从菌群相对丰度分布来看，本发明对样本微生物菌群相对丰度分布无影响，再次证明本发明的可行和优势。
[0135]
本发明是通过优选实施例进行描述的，本领域技术人员知悉，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，其他落入本申请的权利要求内的实施例都属于本发明保护的范围。