生物标志物在食管鳞癌分化等级评估中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及生物标志物在食管鳞癌分化等级评估中的应用。
背景技术：
：食管癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，约占所有恶性肿瘤的20％,在全球范围内，其发病率排名第八位，死亡率排名第六位。食管癌的病理类型主要包括食管鳞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma，escc)和食管腺癌(esophagealadenocarcinoma，eadc)，同时食管癌还具有区域性分布的特点,大部分的食管癌主要发生在亚洲国家。在食管鳞癌的临床与基础研究中，癌症细胞分化程度作为食管鳞癌重要的组织病理学指标受到重视。癌症细胞分化程度就是指肿瘤细胞接近于正常细胞的程度，分化得越好(称为“高分化”)就意味着肿瘤细胞越接近相应的正常发源组织；而分化较低的细胞(称为“低分化”或“未分化”)和相应的正常发源组织区别就越大。高分化癌及肿瘤组织与正常组织相似，成熟度高，恶性度低。低分化癌与未分化癌肿瘤组织与正常组织相差很大，成熟度差，恶性度高。高分化癌通常转移少，发展慢，预后良好。低分化癌往往转移多，发展快，预后差。未分化癌更差。低分化癌与未分化癌对放疗、化疗较敏感，治疗时肿块较快地缩小或消失，但总的预后并不佳。肿瘤的发生和发展是一个涉及多因素的多步骤的非常复杂的病理过程,近年来,随着人们对分子生物学认识的不断深入,大量的研究已经证明许多基因的特异性变化在肿瘤发生发展过程中发挥着重要的作用。尽管到目前为止食管鳞癌发生和发展的确切机制尚不十分清楚，但是关于与食管鳞癌相关的分子生物学标记物的研究一直以来都是食管鳞癌研究领域的一个热门话题。寻找适宜的分子学指标不仅会更灵敏的反映食管鳞癌整体的分化程度，还可利用基因发生改变进一步弥补单纯病理分化程度描述的不足。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供可用于诊断食管鳞癌或评估食管鳞癌分化程度的生物标志物。本发明的第二目的在于提供一种可用于诊断食管鳞癌或评估食管鳞癌分化程度的系统。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明第一方面提供了一种试剂，所述的试剂能够特异性检测il1rapl2基因表达水平。进一步，所述的试剂包括引物、探针、抗体。所述的“il1rapl2”是指geneid为26280的基因。术语“引物”指这样的一段寡核苷酸，其能与靶序列杂交，通常在扩增过程中引发核酸扩增。术语“核酸”指任何形式的脱氧核糖核酸(dna)和/或核糖核酸(rna)，其中包括单链、双链、三链、线性和环状形式。也包括多核苷酸、寡核苷酸、核酸的嵌合体及其类似物。此处描述的核酸可以由熟知的脱氧核糖核酸和核糖核酸组成，所述脱氧核糖核酸和核糖核酸由碱基腺苷、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷和尿苷组成，或者可以由这些碱基的类似物或衍生物组成。此外，具有非传统磷酸二酯骨架的多个其它的寡核苷酸衍生物也包括在其中，如磷酸三酯、polynucleopeptides(pna)、甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、多核苷酸引物、封锁核酸(lna)及其类似物。术语“探针”指这样的一段寡核苷酸，其能与靶序列杂交，通常用来辅助对该靶序列的检测。术语“靶序列”指探针与其特异性结合的一段核酸序列。与扩增程序中用于引发靶核酸的引物不同，探针不需要使用聚合酶来延伸以扩增靶序列。然而，对于本
技术领域：
的普通技术人员显而易见的是，探针和引物在许多情况下在结构上是相似的或相同的。引物和探针可以通过任何合适的方法产生。例如，这些探针可以是化学合成的(一般地参见，ausubel(编著)currentprotocolsinmolecularbiology，2.11.synthesisandpurificationofoligonucleotides，johnwiley&sons，inc.(2000))，从天然来源分离的，通过重组方法产生的，或其组合。合成的寡核苷酸也可以通过使用matteucci等人，j.am.chem.soc.，3：3185-3191(1981)的三酯方法制备。可以选择地，自动化合成是优选的，例如，在使用氰乙基亚磷酰胺化学的appliedbiosynthesisdna合成仪上。优选地，探针和引物是化学合成的。用于制备本发明的探针和引物的合适的碱基可以选自天然发生的核苷酸碱基，如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶。也可以选自非天然发生的或“合成的”核苷酸碱基，如8-氧代-鸟嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟乙基)尿苷、2′-o-甲基胞苷、5-羧基甲基氨基-甲基-2-thioridine、5-羧基甲氨基甲基尿苷、二氢尿苷、2′-o-甲基假尿苷、β-d-半乳糖基queosine、2′-o甲基鸟苷、肌苷、n6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、n6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、β-d-甘露糖基queosine、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代-n6-异戊烯基腺苷、n-((9-β-d-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、n-((9-β-d-呋喃核糖基嘌呤-6-基)n-甲基氨甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸、wybutoxosine、假尿苷、queosine、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、n-((9-β-d-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、2′-o-甲基-5-甲基尿苷、2′-o-甲基尿苷、wybutosine和3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷。杂交探针或扩增引物可以是任何合适的长度。对探针或引物的长度没有下限或上限，只要探针与靶核酸杂交，并且能作为探针或引物有效地发挥作用(例如有助于删除或扩增)。本发明的探针和引物可以短至50、40、30、20、15或10个核苷酸或更短。同样地，探针或者引物可以长至20、40、50、60、75、100或200个核苷酸或更长。在特定的实施方案中，探针的长度为至少30个核苷酸或至少50个核苷酸。如果具有完全的互补性，即如果该链具有一个与探针的序列相同的序列，那么双链体在即使严紧条件下也将是相对稳定的，并且探针可以是短的，即范围在大约10-30个碱基对。如果在探针中预期到一些程度的错配，即如果预期到探针将与可变区域杂交，或与一组序列如特异性种类中的所有种类杂交，那么探针可以更长(即15-40碱基)，以平衡错配的影响。本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可(即其抗原结合片段)。本发明第二方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。进一步，所述的试剂盒还包括选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。本发明第三方面提供了一种芯片，所述的芯片包括本发明第一方面所述的试剂。本文中使用的术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。进一步，所述的芯片包括dna芯片、寡核苷酸芯片、蛋白芯片。本发明第四方面提供了一种组合物，所述的组合物包括抑制il1rapl2基因表达水平的试剂。本发明第五方面提供了一种诊断食管鳞癌或评估食管鳞癌分化程度的系统，所述的系统包括：(1)诊断食管鳞癌或评估食管鳞癌分化程度的装置，其包括控制单元和存储单元，用于评估受试者是否有患食管鳞癌的风险或所患食管鳞癌的分化程度；和(2)彼此通信地连接的信息通信终端装置，其提供关于来自受试者的生物标志物表达水平的数据；其中，所述诊断食管鳞癌或评估食管鳞癌分化程度的装置的控制单元包括：1)数据接收单元，其接收从所述信息通信终端设备传输的关于il1rapl2基因表达水平的数据；2)判别值计算单元，其基于由所述数据接收单元接收的所述il1rapl2基因表达水平以及具有存储在所述存储单元中的作为解释变量的il1rapl2基因表达水平的判别来计算判别值；3)判别值基准评价单元，其基于由所述判别值计算单元计算的判别值，对所述受试者中的食管鳞癌的风险进行评估或对所述受试者中的食管鳞癌分化程度进行评估；以及4)评估结果发送单元，其将由所述判别值基准评估单元获得的所述受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。进一步，所述的诊断食管鳞癌为区分食管鳞癌良性和恶性。进一步，所述的il1rapl2基因表达水平越高，提示受试者患食管鳞癌的风险越高或受试者所患食管鳞癌分化程度越低。本发明第六方面提供了生物标志物在构建诊断食管鳞癌或评估食管鳞癌分化程度的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统中的应用，所述的生物标志物包括il1rapl2。进一步，所述的诊断食管鳞癌为区分食管鳞癌良性和恶性。本发明第七方面提供了如下任一项所述的应用：(1)本发明第一方面所述的试剂在制备诊断食管鳞癌或评估食管鳞癌分化程度的产品中的应用；(2)本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断食管鳞癌或评估食管鳞癌分化程度的产品中的应用；(3)本发明第三方面所述的芯片在制备诊断食管鳞癌或评估食管鳞癌分化程度的产品中的应用；(4)本发明第四方面所述的组合物在制备治疗食管鳞癌的药物组合物中的应用。本文所述的“药物组合物”为呈适合于给予受试者的药学上可接受的形式的制剂。本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、载体和/或剂型。药物组合物可以散装或以剂量单位形式提供。为了易于给予和剂量的均匀性，尤其有利的是以剂量单位形式配制药物组合物。本文使用的术语“剂量单位形式”是指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物以及所需要的药用载体。本公开的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果决定并直接取决于此。剂量单位形式可为安瓿、小瓶、栓剂、糖衣丸、片剂、胶囊剂、iv袋或在气雾剂吸入器上的单一泵。在治疗应用中，在影响所选剂量的其他因素中，剂量根据药物、受体患者的年龄、体重和临床状况、以及给予疗法的临床医生或从业者的经验和判断而变化。通常，剂量应为治疗有效量。剂量可以mg/kg/天的度量单位来提供(所述剂量可针对患者的体重(以kg计)、体表面积(以m2计)和年龄(以岁计)来进行调节)。药物组合物的有效量为提供如临床医生或其他合格观察者所注意到的客观可识别的改善的量。例如，减轻障碍、疾病或病症的症状。本文使用的术语“剂量有效方式”是指在受试者或细胞中产生期望的生物效应的药物组合物的量。例如，剂量单位形式可包含1ng-2mg、或0.1mg-2g、或10mg-1g、或50mg-500mg、或1μg-20mg、或1μg-10mg、或0.1mg-2mg。药物组合物可采取任何合适的形式(例如液体、气雾剂、溶液剂、吸入剂、雾剂、喷雾剂；或固体、粉剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、贴剂等等)用于通过任何期望的途径(例如经肺、吸入、鼻内、口服、含服、舌下、胃肠外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、胸膜内、鞘内、透皮、透粘膜、直肠等)给予。例如，本公开的药物组合物可呈用于通过吸入或吹入(经口或鼻)的气雾剂给予的水溶液剂或粉剂的形式、呈用于口服给予的片剂或胶囊剂的形式、呈适合于通过直接注射或通过添加到用于静脉内输注的无菌输注液体中给予的无菌水溶液剂或分散体的形式、或呈用于透皮或透粘膜给予的洗剂、霜剂、泡沫剂、贴剂、混悬剂、溶液剂或栓剂的形式。药物组合物可呈适合于胃肠外给予的无菌水溶液剂或分散体的形式。本文使用的术语“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。药物组合物可呈适合于通过直接注射或通过添加到用于静脉内输注的无菌输注液体中给予的无菌水溶液剂或分散体的形式，并且包含溶剂或分散介质，溶剂或分散介质含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其合适的混合物或者一种或多种植物油。作为游离碱或药理学上可接受的盐的本公开的化合物的溶液剂或混悬剂可在适当地混有表面活性剂的水中制备。以下给出合适的表面活性剂的实例。分散体还可例如在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备。进一步，所述的诊断食管鳞癌为区分食管鳞癌良性和恶性。本发明的优点和有益效果：本发明首次发现了一种可用于诊断食管鳞癌或评估食管鳞癌分化程度的生物标志物，所述生物标志物为il1rapl2。使用该生物标志物可以评估食管鳞癌的分化程度，对制定最佳治疗方案、提高治疗效果具有重要意义。附图说明图1是il1rapl2在食管鳞癌中表达情况箱线图；图2是il1rapl2的roc曲线(g1-g2/g3)图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，本领域技术人员可以根据上述本
发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。实施例1分析il1rapl2在tcga数据库中的表达情况1、数据收集检索关键词“食管癌”、“esophagealcarcinoma”、“esca”，采用tcga数据库产生的食管鳞癌rna-seq数据。根据临床信息，筛选histological_type为esophagussquamouscellcarcinoma。分化详细数据见表1，以下数据可用来整合分析。表1食管鳞癌患者转录组数据datatypeg1(高分化)g2(中分化)g3(低分化)mrna1538192、肿瘤分级相关基因的筛选使用工具为r-3.3.3，分析方法为linearbylinearassociationtest，具体做法是根据每个基因的表达量的四分位数将每个样本划分到为4个表达量区间，然后检测表达量区间与tumorgrade的相关性。分析前，对mrna分别进行了以下处理：删除了不易检测到的基因(即该基因为0的样本数大于总的样本量的20％)后，将17207个基因用于差异表达分析。采用标准是p-value<0.05，得到1864个与肿瘤分级相关基因(846positiveassociated，1018negativeassocated)。将这1864个基因做不同分级之间的表达差异分析。分析方法为：方差分析，分组之间的多重比较采用tukey's‘honestsignificantdifference’方法。两组比较的tukeyhsd方法校正后的p<0.05认为是显著的。结果：g2v.s.g1有455个差异的基因，g3v.s.g1有928个差异的基因，g3v.s.g2有186个差异的基因。在表达上，g1(高分化)与g2(中分化)、g3(低分化)之间的差异较大，分别为455个、928个，交集332个；而g2(中分化)与g3(低分化)之间的差异较小。本发明中所述的il1rapl2在g1(高分化)、g2(中分化)、g3(低分化)之间均有显著差异(如图1所示)。3、roc曲线分析使用r语言中的proc包分析il1rapl2的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制roc曲线。结果：如图2中il1rapl2的roc曲线(g1-g2/g3)显示，il1rapl2的auc值高为0.744，且具有较高的特异性和敏感性，说明il1rapl2应用于食管鳞癌的分化程度评估具有较高的准确性。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页12