一种H7N7禽流感病毒检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种h7n7禽流感病毒检测试剂盒。
背景技术：
：流感病毒属正黏病毒科，流感病毒属，包括a、b、c三种型，a型流感病毒可以感染禽类、哺乳动物等，而b型和c型病毒只感染人，根据病毒ha和na抗原性的差异，将a型流感病毒分为不同的亚型，目前为止，ha亚型有h1-h18，na亚型有n1-n11。a型流感病毒在温血动物中广泛存在，也是目前导致人类和各种动物流感疾病的主型，在自然情况下流感病毒感染的宿主范围有一定的特异性，分离自人的流感病毒一般不能在鸡、鸭等禽类体内复制，同样禽流感病毒在灵长类动物体内的复制能力也极差，但早在1981年，美国就有禽流感病毒h7n7亚型感染人类引起结膜炎的报道，近年来又不断发生禽流感病毒(h5n1、h9n2、h7n7、h7n2、h7n3等亚型病毒)直接传染人的事件。能够快速、准确检测禽流感病毒，防止病毒传播非常重要。技术实现要素：本发明的目的是提供一种能快速、准确检测h7n7禽流感病毒的试剂盒。为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：本申请一方面公开了一种用于h7n7禽流感病毒检测的引物序列，h7上游引物为seqidno.1所示序列，h7下游引物为seqidno.2所示序列，h7探针为seqidno.3所示序列，n7上游引物为seqidno.4所示序列，n7下游引物为seqidno.5所示序列，n7探针为seqidno.6所示序列。本申请的另一方面公开了用于h7n7禽流感病毒检测的试剂盒组成，该试剂盒包括：10μmh7引物对、10μmn7引物对、10μmh7探针、10μmn7探针、5×taqman探针荧光定量pcr反应预混液、50×roxdye、超纯水、2.5mmdntpmix、5×rtbuffer、rnase-freewater、superrt(200u/μl)、阳性对照模板、阴性对照，所述的阳性对照模板为含有h7、n7序列的线性质粒，所述的阴性对照为pbs。本申请的再一方面还公开了一种h7n7禽流感病毒的使用方法，包括以下步骤：1.提取待测样品的基因组rna；2.将rna反转录成cdna，体系如下：表1反转录体系成分20μl反应体系(μl)终浓度2.5mmdntp4500μmh7、n7上游引物(10μm)1-h7、n7下游引物(10μm)1-rna模板x0.25g/lrnase-freewaterupto20μl-将上面配好的体系，70℃孵育10min，迅速冰浴2min，加入5×rtbuffer，轻轻吹打混匀，加入1μlsuperrt(200u/μl)，轻轻吹打混匀，42℃孵育50min，85℃孵育5min，反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却，或置于-20℃长期保存；3.配制荧光定量pcr反应体系，体系如下：表2荧光定量pcr反应体系成分体积(μl)taqman探针荧光定量pcr反应预混液(5×)4roxdye(50×)0.4h7、n7上游引物(10μm)0.5h7、n7下游引物(10μm)0.5h7探针(10μm)0.5n7探针(10μm)0.5超纯水13.6rt-pcr反应程序95℃10min，(95℃15s，54℃35s，72℃45s)40个循环，72℃10min；用10倍梯度稀释含有h7、n7序列的线性质粒作为标准品，进行实时荧光定量pcr，反应体系和反应程序同上，根据ct值与模板浓度的log值构建标准曲线；4.将待检样品的实时荧光定量pcr检测结果与标准曲线对照，得出检测结果。本发明进一步对所建立的h7n7双重荧光定量rt-pcr检测试剂盒的特异性、敏感性和稳定性进行分析，其中：特异性检测：本发明以h1n1、h1n5、h5n5、h7n6、h7n7、h7n4、h10n3、h11n9、h9n1、h6n7、h9n6、h9n7rna为模板，用本试剂盒进行荧光定量rt-pcr检测。敏感性检测：构建含有h7、n7序列的pcdna3.1-h7-n7质粒，质粒用微量核酸定量仪nanodrop进行定量，取10、102、103、104、105、106、107、108拷贝/μl的重组质粒作为标准品模板，分别加入到体系中进行扩增，根据ct值与模板浓度的log值构建标准曲线，用于计算本检测体系的最低检测限度。稳定性检测：在同一次试验中，同一个pcr板中，按照10×梯度稀释，设置三个稀释梯度，对h7n7禽流感病毒阳性核酸进行双重实时荧光rt-pcr检测，每个样本做三个重复，另外在不同pcr板上重复三次，计算各个稀释度样品的三个重复反应所获得的ct值的变异系数。本发明的有益效果是：提供了一种快速、准确检测h7n7禽流感病毒的试剂盒。附图说明图1h7n7基因在fam、hex通道的扩增结果图2h7n6、h7n4基因在fam通道的扩增结果图3h6n7、h9n7基因hex通道的扩增结果图4标准曲线具体实施方式下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例11.主要试剂h1n1、h1n5、h5n5、h7n6、h7n7、h7n4、h10n3、h11n9、h9n1、h6n7、h9n6、h9n7基因来自广州出入境检验检疫局，superrtcdnakit购自北京华越洋生物科技有限公司，taqman探针荧光定量pcr反应试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司，in-fusionhdcloningkit购自宝日医生物技术(北京)有限公司，pcdna3.1载体、大肠杆菌dh5α感受态细胞均购自赛默飞世尔科技公司；2.主要仪器设备thermalcyclerdicerealtimesystemtp800购自日本takara生物股份有限公司，xpr电子分析天平购自梅特勒-托利多上海有限公司，h2100r高速冷冻离心机购自湘仪离心机仪器有限公司，jh-d超纯水仪购自江辉环保科技有限公司，jc-chp-80s水套式二氧化碳培养箱购自青岛聚创环保集团有限公司；3.引物设计从ncbi上查找h7n7禽流感病毒株的ha基因序列(mn483253.1，seqidno.7)、na基因序列(mn483255.1，seqidno.8)，利用primerepress3.0.1软件，针对保守区设计特异性引物和taqman探针序列，h7上游引物为seqidno.1所示序列，h7下游引物为seqidno.2所示序列，h7探针为seqidno.3所示序列，n7上游引物为seqidno.4所示序列，n7下游引物为seqidno.5所示序列，n7探针为seqidno.6所示序列，h7探针荧光发射基团为fam，n7探针荧光发射基团为hex，淬灭基团为bhq-1；4.样品rna提取①样本采集活禽样品采集，取咽喉试子和泄殖腔试子，取咽喉试子时将试子深入喉头口及上颚裂来回刮取咽喉分泌液，取泄殖腔试子时将试子深入泄殖腔转一圈沾取粪便，然后将试子一起放入盛有2mlpbs的试管，充分洗涤试子，转入无菌离心管中备用；新鲜肌肉或脏器，取待测样品2g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mlpbs混匀，取上清转入无菌离心管中备用；血清、血浆或冷冻组织渗出液可直接取用；分离后的样本在2-8℃条件下保存应不超过24h，-80℃以下可长期保存，但应避免反复冻融；②在样本中，加入5-10倍体积trizol液，混匀；③室温放置5min，然后以每1mltrizol液加入0.2ml的氯仿，盖紧离心管，剧烈摇荡离心管15s；④取上层水相于一新的离心管，按每1mltrizol液加入0.5ml异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min；⑤重复步骤4；⑥小心弃去上清液，室温干燥5-10min；⑦将rna溶于水中，-20℃保存备用；5.将rna反转录成cdna，体系如下：表1反转录体系成分20μl反应体系(μl)终浓度2.5mmdntp4500μmh7、n7上游引物(10μm)1-h7、n7下游引物(10μm)1-rna模板x0.25g/lrnase-freewaterupto20μl-将上面配好的体系，70℃孵育10min，迅速冰浴2min，加入5×rtbuffer，轻轻吹打混匀，加入1μlsuperrt(200u/μl)，轻轻吹打混匀，42℃孵育50min，85℃孵育5min，反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却，或置于-20℃长期保存；6.配制荧光定量pcr反应体系，体系如下：表2荧光定量pcr反应体系成分体积(μl)taqman探针荧光定量pcr反应预混液(5×)4roxdye(50×)0.4h7、n7上游引物(10μm)0.5h7、n7下游引物(10μm)0.5h7探针(10μm)0.5n7探针(10μm)0.5超纯水13.6rt-pcr反应程序95℃10min，(95℃15s，54℃35s，72℃45s)40个循环，72℃10min；7.阳性质粒构建用针对h7n7禽流感病毒的h7基因、n7基因特异性引物分别进行普通pcr扩增，h7基因引物序列如seqidno.9、seqidno.10所示，n7基因引物序列如seqidno.11、seqidno.12所示，其扩增范围包括荧光定量rt-pcr扩增区域，将h7基因、n7基因pcr反应结束后，混合，加20μlcloningenhancer到pcr体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用noti、hindiii酶切pcdna3.1质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的pcr产物与纯化的线性载体混合均匀，加入in-fusion酶，50℃反应15min，转化e.colidh5α感受态细胞，将转化的感受态细胞涂于含有x-gal和iptg的琼脂平板，37℃培养12-16h，从平板上长出的蓝色、白色菌落中随机挑取3-4个白色菌落，提取质粒，用pcr反应液检测，扩增阳性的菌落，送生物公司测序，将鉴定序列正确的阳性菌落，用3-5ml液体lb培养基培养，37℃摇床振荡培养12-16h，提取质粒，使用bsshii酶切重组质粒，获得线性化质粒dna，作为构建标准曲线的阳性质粒，命名为pcdna3.1-h7-n7；8.制作标准曲线用10倍梯度稀释含有h7n7序列的线性质粒作为标准品，进行实时荧光定量pcr，反应体系和反应程序同步骤6，根据ct值与模板浓度的log值构建标准曲线，结果判定标准为：ct值≤33，判定为阳性；ct值≥35，判断为阴性；ct值在33-35之间为可疑，重复一次，如果ct值仍在33-35之间，则为阳性，每个样本设置三个重复；9.将待检样品的实时荧光定量pcr检测结果与标准曲线对照，得出检测结果。实施例2特异性验证实验步骤同实施例1，分别以h1n1、h1n5、h5n5、h7n6、h7n7、h7n4、h10n3、h11n9、h9n1、h6n7、h9n6、h9n7rna为模板，利用本试剂盒进行荧光定量rt-pcr扩增。由图1可知，只有h7n7禽流感病毒核酸在fam检测通道和hex检测通道都出现相应的特异性荧光扩增曲线，由图2可知，h7n6、h7n4由于含有h7基因，因此在fam检测通道出现扩增曲线，而hex检测通道则无扩增曲线，由图3可知，h6n7、h9n7由于含有n7，在hex检测通道出现扩增曲线，而fam检测通道则无扩增曲线，其他流感病毒两个荧光通道都无扩增曲线，说明该方法具有很强的特异性。实施例3灵敏度验证根据标准曲线，计算最低检测限度，实验结果表明，由pcdna3.1-h7-n7阳性质粒构建的标准曲线的循环阈值(ct值)与模板浓度log值具有良好的线性关系，相关系数为0.999，根据多重荧光rt-pcr检测方法结果判定标准，灵敏度为72拷贝/μl。实施例4稳定性验证在同一次试验中，同一个pcr板中，按照10×梯度稀释，设置三个稀释梯度，对h7n7禽流感病毒阳性核酸进行双重实时荧光rt-pcr检测，检测方法同实施例1，每个样本做三个重复(见表3)，另外在不同pcr板上重复三次，计算各个稀释度样品的三个重复反应所获得的ct值的变异系数(见表4)。从试验结果可得，同一个pcr板中的变异系数在0.11-0.32％之间，不同pcr板的变异系数在0.28-0.47％之间，说明本方法双重rt-pcr检测方法误差小、重复性好，可对h7n7禽流感病毒进行稳定、可靠的检测。表3h7n7禽流感病毒双重荧光rt-pcr检测方法的批内重复结果表4h7n7禽流感病毒双重荧光rt-pcr检测方法的批间重复结果序列表<110>广州博识生物科技有限公司<120>一种h7n7禽流感病毒检测试剂盒<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgaaacggtggaacgaacaa20<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtcgaccgttcttttccctttt22<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgtccctaggatttgct17<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aagacccgaagaggccaaa19<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gctcccacatagggcaattaaac23<210>6<211>132<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6agcagcggttacaaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgtttcatactt60cttgccattgcaatgggccttgttttcatatgtgtgaagaatggaaacatgcggtgcact120atttgtatataa132<210>7<211>1683<212>dna<213>influenzaavirus<400>7atgaacactcaaatcctggtattcgccctggtggcgatcattccaacaagtgcggacaag60atctgccttgggcatcatgccgtgccaaatggaaccagagtgaacacattaactgaaagg120ggggtggaagtcgttaatgcgactgaaacggtggaacgaacaaatgtccctaggatttgc180tcaaaagggaaaagaacggtcgacctcggtcaatgtgggcttctgggaactatcactgga240ccaccccaatgtgatcaatttctagaattttcagccgatctaatcattgaaaggcgagaa300ggaagtgatgtttgttatcctgggaaattcgtgaatgaagaagctctgaggcaaattctc360cgggagtctggcgggattgacaaagagacaatgggattcacatacagtgggataagaacc420aatggagcaacaagtgcatgtaggagatcaggatcttcattctatgcagagatgaagtgg480ctcctttcaaacacagacaatgctgctttcccgcagacgactaagtcatacaaaaacaca540agaagagacccagctctgatagtatggggaatccaccattccggatcaaccgcagaacag600actaagctatacgggagtgggagcaagttaataacagttgggagttctaactaccaacag660tcttttgtaccgagcccaggagcgagaccacaagtgaatggccaatctggaaggattgac720tttcattggcttatactggatcccaatgacacagtcactttcagtttcaatggggccttc780atagctccagaccgcgcaagttttttgagagggaagtctatgggaattcagagtggggta840caggttgatgcaaattgtgaaggagattgctatcacagtggggggacaataataagcaat900ttgccctttcagaacataaatagcagagcagtagggaaatgcccgagatatgtcaagcaa960gagagtttaatgctggcaacagggatgaaaaatgttcccgaactcccaaagggaagaggc1020ctattcggcgctatagcaggtttcattgaaaatggatgggaaggcctgattgacgggtgg1080tatggcttcagacatcaaaatgcacaaggagagggaactgctgcagattaccaaagcacc1140caatctgcaattgatcaaataacagggaaattaaaccggcttatagaaaaaaccaaccaa1200cagtttgagttgatagacaatgaattcactgaggttgaaaagcaaattggcaatgtgata1260aactggaccagggattccatgacggaggtgtggtcctacaatgctgaactcttggtagca1320atggagaatcaacacacaattgatctggctgactcagaaatgaacaaactatacgagcgg1380gtgagaaggcaactgagagagaacgctgaagaagatggcactggctgttttgaaatattt1440cacaagtgtgatgacaattgcatggccagtatcagaaacaacacttatgaccacagcaaa1500tacaggggggaagcgatgcaaaatagaatacagattgacccggtcaagctaagcagcggt1560tacaaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgtttcatacttcttgccatt1620gcaatgggccttgttttcatatgtgtgaagaatggaaacatgcggtgcactatttgtata1680taa1683<210>8<211>1416<212>dna<213>influenzaavirus<400>8atgaatccaaatcagaaactatttgcattatctggagtggcaatagcactcagtgtgctg60aacctattgataggaatctcaaatgtcggattgaatgtatctctacacctaaagggagaa120ggacccaaacaagaggagaatttaacatgcacgaccattaatcaaaacaacactactgtt180gtggaaaacacatacgtaaataatacaacaataattaccaagggagctgaatcgaaaaca240tcaagctatctgctgctgaacaagagcctatgcaatgttgaaggatgggtcgtgatagca300aaagacaatgcagtaagatttggggaaagtgagcaaatcattgttactagggagccatat360gtgtcatgcgaccctacaggatgcaaaatgtatgccctgcaccaaggaactaccattagg420aacaaacattcaaatggaacaattcacgacagaacagctttcagaggtctcatctccact480ccattgggcactccaccaaccgtaagtaacagtgactttatgtgtgttgggtggtcaagc540acaacttgccatgatgggattggtagaatgactatctgtatacaaggaaacaatgacaat600gctacagcaacggtttactataacagaaggctgaccactaccattaagacctgggccagg660aacattctgagaacccaagagtcagaatgtgtgtgccacaatggcacatgtgcagttgta720atgactgacggatcagctagtagtcaagcctatacaaaggtgatgtatttccacaggggg780ttgataataaaggaagaggcattaaagggatcagccagacacattgaagaatgctcctgt840tacggacacagccaaaaggtgacctgtgtatgcagagacaactggcagggggcaaatagg900cctattatagaaattgatatgaacacattggagcacacaagtaggtacgtgtgcactgga960attctcacagacaccagcagacctggggacaaatccagtggtgattgttccaatccaatc1020actgggagtcctggcgctccaggagtgaagggatttggattcctaaatggggataataca1080tggcttggtaggactatcagccccagatcaagaagtggatttgaaatgttgaaaatacct1140aatgcaggtactgatcccaattctagaatagcagaacgacaagaaattgttgacaatagc1200aattggtcaggctattccggaagcttcattgactattggaacgataacagtgaatgctac1260aacccgtgtttctacgtagagttaattagaggaagacccgaagaggccaaatatgtgtgg1320tggacaagtaacagtttaattgccctatgtgggagcccattcccagttgggtccggttcc1380ttccccgatggggcacagatccaatacttttcgtaa1416<210>9<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gccctctagactcgagcggccgcaacaagtgcggacaagatctgc45<210>10<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10tccacaatgattagatcggctgaaaatt28<210>11<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gccgatctaatcattgtggaacgataacagtgaatgctaca41<210>12<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cagcggtttaaacttaagcttttacgaaaagtattggatctgtgcc46当前第1页12