具有抗血栓活性的低分子量多糖的制作方法

本申请为2020年05月19日提交的中国专利申请2020104223979的分案申请。

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有抗血栓活性的低分子量多糖。

背景技术：

马尾藻资源十分丰富，在暖水和温水海域广泛分布，如国外的鄂霍次克海、千岛群岛、日本和朝鲜等地，以及我国的香港、汕头、徐闻、湛江等地。马尾藻种类繁多，世界上已定名的有数百种，我国大陆沿岸的马尾藻约有100多种，已定名的有50多种。马尾藻为多年生藻类且多数在低潮带石沼或岩石上生长，产量大，易获取。褐藻中富含的活性多糖，岩藻聚糖硫酸酯是一种有硫酸基取代的水溶性杂多糖，因其低毒、良好的生物相容性和具有多种生物活性等特点，是开发海洋药物及保健食品的宝贵资源。岩藻聚糖硫酸酯，又叫褐藻糖胶、褐藻多糖硫酸酯、岩藻聚糖等，主要来源于褐藻细胞，也存在于海参等一些海洋无脊椎动物中。由于其具有抗凝血、降血脂、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗血栓等多种生物活性，在人类健康方面有良好的应用前景。

通常提取得到的岩藻聚糖硫酸酯多糖分子量较大，黏度较高，有溶解性差、不易被吸收，生物利用度低等缺点，所以将多糖降解为小分子量多糖。一般认为较小分子量的多糖，更易透过组织细胞抵达发挥活性的部位，且其有效部分更容易与发生反应的配体相结合，从而使其活性更强，但分子量过小可能其生物活性会有所减弱。实验发现，在多糖各测试组分中，硫酸基含量与抗氧化有显著的关联，无论是还原力实验(rp)还是自由基清除实验(rsa)都表明，与褐藻淀粉、藻酸盐相比，酸性组分岩藻聚糖硫酸酯的抗氧化效果更强。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有抗血栓活性的低分子量多糖的制备方法，该制备方法的提取工序能够提高马尾藻多糖提取量、保留下更多硫酸根，提高抗血栓活性。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种具有抗血栓活性的低分子量多糖的制备方法，包括：对马尾藻进行预处理工序得到预处理马尾藻末，对预处理马尾藻末进行提取工序得到马尾藻多糖粗液，对马尾藻多糖粗液进行纯化工序得到纯化马尾藻多糖，对纯化马尾藻多糖进行降解工序得到小分子量马尾藻多糖；提取工序中通过添加助剂磺酸钠和乙酸铵辅助盐酸溶液提取马尾藻多糖。盐酸浓度高会引起马尾藻多糖中糖苷键的断裂而形成较多的单糖和低聚糖，浓度太低影响马尾藻多糖的提取率，而通过添加提取助剂磺酸钠和乙酸铵，促进了细胞内物质的溶解，提高了马尾藻多糖提取量。磺酸钠和乙酸铵在溶液中防止盐酸对马尾藻多糖结构的破坏，使马尾藻多糖中的硫酸根更稳定，保留下更多硫酸根，提高了抗血栓活性。

优选地，预处理工序的条件为：马尾藻水洗干净，30-80℃烘干，粉碎后加入丙酮，在20-30℃下浸0.5-3h，除去丙酮以脱色脱脂得到马尾藻粉末。

优选地，提取工序的条件为：将马尾藻粉末加入到盐酸溶液中，添加助剂磺酸钠和乙酸铵提取，提取完毕后调ph至6-7，然后利用硅藻土进行过滤浓缩，加氯化钙脱胶后得到马尾藻多糖粗液。

更优选地，提取工序中盐酸溶液的浓度为0.01-0.5mol/l，例如，0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.25、0.3、0.4mol/l；进一步优选地，盐酸溶液的浓度为0.01-0.1mol/l。

更优选地，提取工序中预处理马尾藻末与盐酸溶液的使用量为固液比1：10-30(g/ml)。

更优选地，提取工序中磺酸钠的添加量为0.1-10wt％，例如，0.2、0.4、0.6、0.65、0.8、1、3、5、8wt％；进一步优选地，磺酸钠的添加量为0.5-5wt％。

更优选地，提取工序中乙酸铵的添加量为0.5-15wt％，例如，0.6、0.65、0.8、1、1.2、1.25、3、5、7、10、13wt％；进一步优选地，乙酸铵的添加量为1-10wt％。

更优选地，提取工序中提取压力为100-500kpa，例如，150、200、250、300、350、450kpa。

更优选地，提取工序中提取时间为0.5-6h，例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5h。

更优选地，提取温度为30-90℃，例如，35、40、50、60、70、80、85℃。

更优选地，氯化钙的浓度为0.01-1mol/l，例如，0.02、0.03、0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、0.9、0.95mol/l；进一步优选地，氯化钙的浓度为0.03-0.08mol/l。

优选地，纯化工序的条件为；通过阴离子交换柱层析，采用0-2mnacl溶液梯度洗脱方式对获得的马尾藻多糖粗液进行分级纯化，收集分级组分，减压浓缩后，冷冻干燥，得到马尾藻多糖。

优选地，降解工序的条件为；将马尾藻多糖配制成0.1-2wt％马尾藻多糖溶液，添加抗坏血酸溶液和过氧化氢溶液，搅拌反应0.5-3h，反应完毕后冷却、浓缩、冷冻干燥得到低分子量马尾藻多糖。

更优选地，抗坏血酸溶液的浓度为1-100mmol/l，例如，3、5、10、30、50、70、90、95mmol/l。

更优选地，过氧化氢溶液的浓度为1-100mmol/l，例如，3、5、10、30、50、70、90、95mmol/l。

更优选地，降解温度为50-90℃，例如，55、60、70、75、80、85℃。

本发明为了提高马尾藻多糖的降解效率，得到更多低分子量的马尾藻多糖，在降解工序中还可以添加降解助剂维生素p和甘草素。维生素p中含有多元羟基、并含有环状结构、不饱和键，甘草素中含有酚羟基、酮基，在降解马尾藻多糖时，维生素p和甘草素共同作用下，降低了多糖键的结合力，提高了降解马尾藻多糖的效率，并且不会破坏糖链结构。

进一步优选地，维生素p的添加量为0.01-5wt％，例如，0.03、0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、1、3、3.5、4、4.5wt％。

进一步优选地，甘草素的添加量为0.01-3wt％，例如，0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.6、2、2.4、2.8％。

本发明公开了一种低分子量马尾藻多糖。

优选地，低分子量马尾藻多糖的分子量最小达到5kda。

优选地，低分子量马尾藻多糖的硫酸根保有量最小达到18％。

本发明公开了一种低分子量马尾藻多糖在医药制备中的用途。

本发明由于在提取工序中采用了提取助剂磺酸钠和乙酸铵以及在降解工序中采用了降解助剂维生素p和甘草素，因而具有如下有益效果：提高了马尾藻多糖的提取率，增加了硫酸根的保有量，提高了抗血栓活性，得到了小分子量的马尾藻多糖，提高了降解速率。因此，本发明是一种抗血栓低分子量马尾藻多糖的制备方法。

附图说明

图1为降解前马尾藻多糖和降解后马尾藻多糖红外图；

图2为马尾藻多糖提取率；

图3为马尾藻多糖硫酸根保有量图；

图4为降解前、后马尾藻多糖的分子量图；

图5为低分子量马尾藻多糖抗血栓活性血栓阻塞时间图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：

实施例1：

一种抗血栓低分子量马尾藻多糖的制备方法，

(1)预处理的操作条件为：马尾藻水洗干净，50℃烘干，粉碎后加入丙酮，在25℃下浸2h，除去丙酮以脱色脱脂得到马尾藻粉末。

(2)提纯工序的操作条件为：将马尾藻粉末加入到盐酸溶液中，添加助剂磺酸钠和乙酸铵，在压力100kpa温度50℃下提取3h，提取完毕后调ph至6.5，硅藻土进行过滤浓缩，加氯化钙脱胶后得到马尾藻多糖粗液；马尾藻末与盐酸溶液的固液比为1：10(g/ml)，盐酸溶液的浓度为0.05mol/l，磺酸钠的添加量为盐酸溶液0.3wt％，乙酸铵的添加量为盐酸溶液的0.6wt％，氯化钙的浓度为0.3mol/l。

(3)纯化工序的操作条件为；通过阴离子交换柱层析，采用1mnacl溶液梯度洗脱方式对获得的马尾藻多糖粗液进行分级纯化，收集分级组分，减压浓缩后，冷冻干燥，得到马尾藻多糖。

(4)降解工序的操作条件为：将马尾藻多糖配制成0.8wt％马尾藻多糖溶液，添加抗坏血酸溶液和过氧化氢溶液，于70℃下搅拌反应2h，反应完毕后冷却、浓缩、冷冻干燥得到低分子量马尾藻多糖；抗坏血酸的浓度为20mm，过氧化氢添加量为20mm。

实施例2：

一种抗血栓低分子量马尾藻多糖的制备方法，

(1)预处理的操作条件为：马尾藻水洗干净，50℃烘干，粉碎后加入丙酮，在25℃下浸2h，除去丙酮以脱色脱脂得到马尾藻粉末。

(2)提纯工序的操作条件为：将马尾藻粉末加入到盐酸溶液中，添加助剂磺酸钠和乙酸铵，在压力100kpa温度50℃下提取3h，提取完毕后调ph至6.5，硅藻土进行过滤浓缩，加氯化钙脱胶后得到马尾藻多糖粗液；马尾藻末与盐酸溶液的固液比为1：10(g/ml)，盐酸溶液的浓度为0.05mol/l，磺酸钠的添加量为盐酸溶液3wt％，乙酸铵的添加量为盐酸溶液的6wt％，氯化钙的浓度为0.3mol/l。

(3)纯化工序的操作条件为；通过阴离子交换柱层析，采用1mnacl溶液梯度洗脱方式对获得的马尾藻多糖粗液进行分级纯化，收集分级组分，减压浓缩后，冷冻干燥，得到马尾藻多糖。

(4)降解工序的操作条件为：将马尾藻多糖配制成0.8wt％马尾藻多糖溶液，添加抗坏血酸溶液和过氧化氢溶液，于70℃下搅拌反应2h，反应完毕后冷却、浓缩、冷冻干燥得到低分子量马尾藻多糖；抗坏血酸的浓度为20mm，过氧化氢添加量为20mm。

实施例3：

一种抗血栓低分子量马尾藻多糖的制备方法，

(1)预处理的操作条件为：马尾藻水洗干净，50℃烘干，粉碎后加入丙酮，在25℃下浸2h，除去丙酮以脱色脱脂得到马尾藻粉末。

(2)提纯工序的操作条件为：将马尾藻粉末加入到盐酸溶液中，添加助剂磺酸钠和乙酸铵，在压力100kpa温度50℃下提取3h，提取完毕后调ph至6.5，硅藻土进行过滤浓缩，加氯化钙脱胶后得到马尾藻多糖粗液；马尾藻末与盐酸溶液的固液比为1：10(g/ml)，盐酸溶液的浓度为0.05mol/l，磺酸钠的添加量为盐酸溶液3wt％，乙酸铵的添加量为盐酸溶液的6wt％，氯化钙的浓度为0.3mol/l。

(3)纯化工序的操作条件为；通过阴离子交换柱层析，采用1mnacl溶液梯度洗脱方式对获得的马尾藻多糖粗液进行分级纯化，收集分级组分，减压浓缩后，冷冻干燥，得到马尾藻多糖。

(4)降解工序的操作条件为：将马尾藻多糖配制成马尾藻多糖溶液，添加抗坏血酸溶液和过氧化氢溶液，添加降解助剂维生素p和甘草素，于70℃下搅拌反应2h，反应完毕后冷却、浓缩、冷冻干燥得到低分子量马尾藻多糖；马尾藻多糖溶液为0.8wt％，抗坏血酸溶液的浓度为20mm，过氧化氢溶液的浓度为20mm；维生素p的添加量为0.05wt％，甘草素的添加量为0.05wt％。

实施例4：

一种抗血栓低分子量马尾藻多糖的制备方法，

(1)预处理的操作条件为：马尾藻水洗干净，50℃烘干，粉碎后加入丙酮，在25℃下浸2h，除去丙酮以脱色脱脂得到马尾藻粉末。

(2)提纯工序的操作条件为：将马尾藻粉末加入到盐酸溶液中，添加助剂磺酸钠和乙酸铵，在压力100kpa温度50℃下提取3h，提取完毕后调ph至6.5，硅藻土进行过滤浓缩，加氯化钙脱胶后得到马尾藻多糖粗液；马尾藻末与盐酸溶液的固液比为1：10(g/ml)，盐酸溶液的浓度为0.05mol/l，磺酸钠的添加量为盐酸溶液3wt％，乙酸铵的添加量为盐酸溶液的6wt％，氯化钙的浓度为0.3mol/l。

(3)纯化工序的操作条件为；通过阴离子交换柱层析，采用1mnacl溶液梯度洗脱方式对获得的马尾藻多糖粗液进行分级纯化，收集分级组分，减压浓缩后，冷冻干燥，得到马尾藻多糖。

(4)降解工序的操作条件为：将马尾藻多糖配制成马尾藻多糖溶液，添加抗坏血酸溶液和过氧化氢溶液，添加降解助剂维生素p和甘草素，于70℃下搅拌反应2h，反应完毕后冷却、浓缩、冷冻干燥得到低分子量马尾藻多糖；马尾藻多糖溶液为0.8wt％，抗坏血酸溶液的浓度为20mm，过氧化氢溶液的浓度为20mm；维生素p的添加量为0.4wt％，甘草素的添加量为0.4wt％。

对比例1：

本对比例与实施例2相比，不同之处仅在于，提取工序中仅添加助剂磺酸钠。

对比例2：

本对比例与实施例2相比，不同之处仅在于，提取工序中仅添加助剂乙酸铵。

对比例3：

本对比例与实施例2相比，不同之处仅在于，提取工序中未添加提取助剂。

对比例4：

本对比例与实施例4相比，不同之处仅在于，降解工序中仅添加助剂维生素p。

对比例5：

本对比例与实施例4相比，不同之处仅在于，降解工序中仅添加助剂甘草素。

试验例1：

1.红外光谱测定：

用溴化钾压片法，在傅立叶变换红外光谱仪上于500-4000cm^-1范围内进行检测。结果如图1所示，a为降解后马尾藻多糖；b为降解前马尾藻多糖；马尾藻多糖降解前后，红外吸收峰位置没有明显差别，但降解前马尾藻多糖红外强度明显强于降解后马尾藻多糖，3330cm^-1出现的吸收峰代表了羟基的伸缩振动，2960cm^-1的吸收峰为碳氢伸缩振动，1630cm^-1和1450cm^-1的两个吸收峰分别代表羰基的非对称和对称伸缩振动，碳氧氢键的弯曲振动在1050cm^-1，1220cm^-1的吸收峰为硫氧双键伸缩振动，碳氧硫键的不对称伸缩振动峰在800cm^-1。

2.马尾藻多糖提取率的测定

记录实施例及对比例经过纯化工序获得的马尾藻多糖的质量。

马尾藻多糖提取率按以下公式计算：

马尾藻多糖提取率＝马尾藻多糖的质量/马尾藻的质量×100％。

如图2所示，实施例2中马尾藻多糖的提取率最高，对比例3中马尾藻多糖的提取率最低，实施例2与对比例3相比，对比例3中未添加提取助剂，实施例2中马尾藻多糖的提取率大于对比例3，表明实施例2中提取助剂磺酸钠和乙酸铵的添加提升了马尾藻多糖的提取率；对比例1与对比例2同对比例3相比，对比例1中仅添加了磺酸钠，马尾藻多糖的提取效率与对比例3相差无几，表明磺酸钠的添加不能提高马尾藻多糖的提取率，对比例2中仅添加了乙酸铵，同样马尾藻多糖的提取率与对比例3基本一致，表明乙酸铵的添加不能提高马尾藻多糖的提取率，结合实施例2，磺酸钠和乙酸铵任一种物质单一添加时，对马尾藻多糖提取率几乎没有影响，仅两种物质同时加入时，提高了马尾藻多糖的提取率；实施例2与实施例1相比，实施例1中磺酸钠和乙酸铵的量小于实施例2，实施例1相比于对比例3的马尾藻多糖的提取率仍有提高，同样证明了磺酸钠和乙酸铵的添加提高了马尾藻多糖的提取率。

3.硫酸根含量的测定

马尾藻多糖溶液的配制：称取实施例和对比例马尾藻多糖0.1g，蒸馏水定容25ml。

硫酸根含量的测定采用离子色谱法，

标准曲线：用五氧化二磷减压干燥法将无水硫酸钾干燥2h，加超纯水溶解配制so4^2-浓度梯度为5、10、20、30、40、50、80和100μg/ml的标准溶液。

色谱条件：选用ics-2000lonchromatographysystem(dionex，usa)。分离柱为lonpacas11-hc(4mm×250mm)为，保护柱为dionexlonpacag11-hc(4mm×50mm)，30mmol/lkoh为淋洗液，asrsultraiⅱ为抑制器，抑制电流为238ma，流速为1.0ml/min，进样体积为25μl，程序时间为8min。样品液和各个浓度梯度的硫酸根标准溶液经0.45μm水膜过滤后上机检测。

硫酸根含量的计算：k2so4标准曲线制作：以标准品的硫酸根洗脱峰面积为纵坐标，硫酸根浓度为横坐标，绘制标准曲线y＝0.0017x+0.0045，r²＝0.991。

样品硫酸根含量的测定：取硫酸根峰面积的平均值，将待测组分的洗脱峰面积的平均值带入标准曲线，即可求出样品中硫酸根的含量。

如图3所示，实施例2中得到的马尾藻多糖的硫酸根保有量最高，对比例3中硫酸根保有最低，实施例2与对比例3相比，实施例2的提取工序中添加了磺酸钠的乙酸铵，实施例2得到的马尾藻多糖中硫酸根的保有量明显大于对比例3，表明磺酸钠和乙酸铵的添加增加了马尾藻多糖中硫酸根的保有量；对比例1与对比例2同对比例3相比，对比例1的提取工序中仅添加了磺酸钠，但对比例1得到的马尾藻多糖中硫酸根保有量与对比例3无明显差异，表明磺酸钠的添加不能提高马尾藻多糖中硫酸根的保有量，对比例2的提取工序中仅添加了乙酸铵，对比例2得到的马尾藻多糖中硫酸根保有量相比于对比例3有轻微的提升，但幅度并不明显，表明乙酸铵的添加对硫酸根的保有量有提升的作用，结合实施例2，表明磺酸钠的添加对马尾藻多糖硫酸根保有量的提升没有影响，乙酸铵的添加可以稍微提高马尾藻多糖硫酸根的保有量，在磺酸钠和乙酸铵共同添加时，显著提高了马尾藻多糖中硫酸根的保有量；实施例2和实施例1相比，实施例1中磺酸钠和乙酸铵的添加量小于实施例2，实施例1中硫酸根的保有量相比于对比例3同样有提高。

4.马尾藻多糖相对分子量：高效液相色谱法

各实施例和对比例得到的降解前、后的马尾藻多糖和岩藻聚糖硫酸酯标准品分别用0.2mol/lnacl配成10mg/ml溶液，用高效凝胶过滤色谱来确定分子量的大小。

操作条件：选用agillent1100高效液相色谱仪；色谱柱：tsk-gelg4000pwx1(7.8×30cm)；检测器：示差检测器(g1362arid)；流动相：0.2mol/lnac1l；流速：0.5ml/min；柱温：0℃；标准品：分子量为1kda、5kda、50kda、66.9kda、150kda、410kda、670kda的葡聚糖。

如图4所示，不同实施例和对比例得到了马尾藻多糖降解前的分子量在520kda左右，经过1.5h的降解，实施例3和实施例4得到的降解后马尾藻多糖分子量不低于5kda，对比例4、对比例5和实施例2得到的降解后马尾藻多糖分子量在40kda左右，实施例4与实施例2相比，实施例4的降解工序中添加了降解助剂维生素p和甘草素而实施例2中并未添加降解助剂，表明维生素p和甘草素提高了马尾藻多糖的降解效果，对比例4、对比例5同实施例2相比，对比例4降解工序中仅添加了维生素p，而对比例4得到的降解后马尾藻多糖分子量与实施例2无明显差异，表明维生素p的添加没有提升马尾藻多粮的降解效果，对比例5降解工序中仅添加了甘草素，对比例5得到的降解后马尾藻多糖分子量仍然与实施例2无显著差异，表明甘草素的添加不能提升马尾藻多糖的降解效果，结合实施例4，表明维生素p和甘草素任一物质的单独添加不能提高马尾藻多糖的降解效果，在维生素p和甘草素共同存在下，马尾藻多糖的降解效果有显著提高；实施例3与实施例4相比，实施例3中维生素p和甘草素的添加量小于实施4，实施例3得到的降解后马尾藻多糖分子量仍有显著降低，同样表明维生素p和甘草素在共同作用下提高了马尾藻多糖的降解效果。

5.抗血栓活性检测

肝素钠溶液：用生理盐水溶解肝素钠干粉，配制成1mg/ml。

实施例1、实施例2、实施例3、实施例4：分别用生理盐水溶解配制成0.2mg/ml。

对氨基甲酸乙酯麻醉液：用生理盐水配成质量分数为20％的溶液。

(1)60只雄性wistar大鼠，按体重随机分为6组，即对照组(注射生理盐水，1ml/kg)、肝素组(1mg/kg)，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4为1.0mg/kg，每组10只，分别标记。

(2)用对氨基甲酸乙酯腹腔注射将大鼠麻醉后，固定于动物解剖板上，切开大鼠颈部皮肤，剥离右侧颈动脉约10mm，剥离过程中尽量减少对颈动脉牵拉刺激，避免损伤血管表面和神经，并注意把神经从动脉血管表面剥离，以免影响实验结果。开启血栓形成仪，设置好参数，将血栓探头上的压板打开，将剥离好的颈总动脉勾入探头的沟槽内，(探头上标出的方向应与大鼠颈动脉血流方向一致)，轻轻放下压板，使血栓探头与动物身体保持平行，将上端软线放入固定支架的夹子内固定，调整好高度和方向。

(3)剥离股静脉给药后5min，按动运行键，博动信号稳定时，通过刺激电极给予1.2ma电流刺激，以损伤动颈动脉血管的内皮细胞，从而激活凝血因子，启动凝血机制，造成血小板和纤维蛋白聚集，形成一种混合性血栓。使用红外血流检测探头对血栓形成引起的血流脉动变化进行全程的监测，及时监测血栓开始形成的时间，血栓阻塞血管的百分比的变化以及全阻塞时间。

(4)血栓形成稳定后立即剪开腹部，进行腹主动脉取血，每管取血1.7ml，加入柠檬酸钠抗凝管中(内含0.3ml的3.8％柠檬酸钠抗凝剂)，每只大鼠取3管血，混匀后，3000r/min离心10min，取上清，用试剂盒检测6-kelo-pgf1、txb2。

抗血栓效果如图5所示，对照组血栓全阻塞时间最短，肝素组血栓全阻塞时间延长，表明肝素具有抗凝血效果；肝素组与对比例1、对比例2、对比例3的血栓全阻塞时间相差无几，表明对比例1中仅添加磺酸钠、对比例2中仅添加乙酸铵和对比例3中无提取助剂得到的小分量马尾藻多糖的抗血栓活性与肝素组基本一致，实施例2和实施例3中添加了磺酸钠和乙酸铵，得到了更高硫酸根保有量的小分子量马尾藻多糖，取得了较好的抗血栓效果；肝素组与对比例4、对比例5相比，对比例4中添加降解助剂维生素p和对比例5中添加甘草素得到的低分子量马尾藻多糖的抗血栓效果相当于肝素组，表明因维生素p和甘草素不能进一步降低马尾藻多糖的分子量，而没有提高抗血栓效果，实施例3和实施例4中共同添加提取助剂磺酸钠和乙酸铵，提高马尾藻多糖中硫酸根的保有量，共同添加维生素p和甘草素，得到了更低分子量的马尾藻多糖，并且具有最优的抗血栓效果。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。