一种迷果芹多糖PSGP-2及其制备方法与应用

一种迷果芹多糖psgp
‑
2及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及一种迷果芹多糖psgp
‑
2及其制备方法与应用，属于生物医药领域。


背景技术：

2.迷果芹（sphallerocarpusgracilics（bess.）k.－pol）是伞形科（umbellferae）迷果芹属（sphallerocarpusbess.ex dc.）单种野生植物。其肉质根性状呈长纺锤形或圆锥形，表面淡黄灰色，有明显的纵皱及横长突起的皮孔样疤痕；顶端圆钝且有残基，四周有黑褐色，似鳞片状的叶鞘基环绕，其下有致密的环状横纹。其根质硬，易折断，断面乳白色，具胡萝卜香气，味淡，微甜。迷果芹的肉质根比较发达，在秋季能够积累大量多糖，营养较为丰富。
3.多糖作为生命体必须的营养成分，不仅涉及人体内的各种生命活动，同时还能储存能量、支持结构并能防御外界对生命体的攻击。多糖不仅作为重要的生命体物质组成部分，而且它还具有着抗肿瘤，抗氧化等多种活性作用，且对正常细胞无杀伤作用。
4.目前，肿瘤已成为威胁人类健康的重要疾病。然而，使用化疗药物治疗肿瘤疾病虽然能杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的增长，但对正常细胞的损害也大，易引发多种不良反应，且长时间服用容易产生耐药性。
5.联合用药已具有悠久的历史，在传统中医药方里，多味中药的共同使用就是联合用药的表现。在现代医学中，将天然产物与化疗药物联合使用治疗肿瘤疾病已具有较好的进展。例如：将紫杉醇与阿帕替尼联合治疗，可对晚期胃癌患者起到良好的治疗效果；长春碱和神经酰胺联合能够协同促进肝癌和结直肠癌的凋亡等。
6.多糖可以结合胆汁酸并且增加粪便排泄，从而降低人体胆固醇，排泄有毒代谢物和次级胆汁酸可以降低患癌症的风险。肝脏中的胆汁酸主要以胆汁盐的方式存在，主要为甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠，肠道内胆酸盐与多糖结合后可直接排泄出体外，并能够减少脂质的乳化吸收，由此体现其降血脂作用。
7.cn93105147.9公开了迷果芹饮品，但该方法未对迷果芹多糖进行报道。目前也未见有关迷果芹纯化多糖psgp
‑
2在抗肿瘤药物中的应用及其制备方法研究报道。该发明首次研究了一种迷果芹纯化多糖psgp
‑
2在降血脂和抗肿瘤药物中的应用及其制备方法，可以为迷果芹多糖的进一步开发提供一定的理论依据。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种水法提取的具有直接抗肿瘤活性，协同抗肿瘤活性以及降血脂活性的迷果芹多糖。以下为本发明具体技术方案：本发明所述的一种迷果芹多糖psgp
‑
2，所述迷果芹多糖psgp
‑
2由鼠李糖2.463%、阿拉伯糖9.301%、甘露糖40.019%、葡萄糖19.435%、半乳糖28.782%组成。所述迷果芹多糖psgp
‑
2的平均相对分子量为31623da。
9.本发明所述的迷果芹多糖psgp
‑
2的制备方法，包含以下步骤：
第一步，迷果芹粗多糖的提取：将迷果芹粉碎，粉碎后的迷果芹用乙醇萃取进行脱脂处理，过滤，晾干，得到固体药材，用水对固体药材进行多次萃取，过滤，将滤液合并，使用水提醇沉法获得迷果芹粗多糖；第二步，迷果芹粗多糖脱蛋白和杂质小分子：将第一步中获得的迷果芹粗多糖用水溶解，加入木瓜蛋白酶溶液，水浴反应，离心，过滤，用savege试剂法脱蛋白，取上层溶液减压旋蒸，透析，定期换水，冷冻干燥，得粗糖聚物sgp
‑
w；第三步，迷果芹多糖psgp
‑
2的分离纯化：将第二步得到的粗糖聚物sgp
‑
w用水溶解，用deae
‑
cellulose 52 柱层分析法进行洗脱，洗脱液真空浓缩，透析，冷冻干燥，得到gp
‑
2，将gp
‑
2用水溶解，用sephadex g
‑
100柱层分析法进行洗脱，洗脱液真空浓缩，透析，冷冻干燥，得到迷果芹多糖psgp
‑
2。
10.进一步地，在所述的第一步中，将迷果芹粉碎成1
‑
2cm，粉碎后的迷果芹与乙醇的固液比为1:4（重量：体积），水与固体药材的质量比1:10，萃取次数为2次，萃取时间为3 h。
11.进一步地，在所述的第二步中，果芹粗多糖与水的质量比为1:10，木瓜蛋白酶溶液的浓度为5%，木瓜蛋白酶溶液与溶解后果芹粗多糖水溶液的体积比为1:5，水浴反应的温度67℃，水浴反应的时间为3.5 h，进一步地，在所述的第三步中，粗糖聚物sgp
‑
w与水的质量比为1:15，在deae
‑
cellulose 52 柱层分析法中，采用水和nacl溶液进行梯度洗脱；在sephadex g
‑
100柱层分析法中，采用水进行洗脱。
12.进一步地，所述nacl溶液的浓度为0.1m、0.3m、0.5m。
13.本发明所述的迷果芹多糖psgp
‑
2在制备抗肿瘤药物中的应用。
14.进一步地，所述肿瘤为胃癌、卵巢癌、膀胱癌、鼻咽癌和乳腺癌。
15.进一步地，所述的迷果芹多糖psgp
‑
2单独用于制备抗肿瘤药物；或者，迷果芹多糖psgp
‑
2与阿霉素联合使用，用于制备抗肿瘤药物。所述的迷果芹多糖psgp
‑
2与抗肿瘤药物在肿瘤治疗中具有协同作用，迷果芹多糖psgp
‑
2与阿霉素联合制备抑制4t1肿瘤细胞增长的药物。
16.本发明中的迷果芹多糖psgp
‑
2在制备降血脂食品中的应用，迷果芹多糖psgp
‑
2具有良好的胆酸盐结合能力，具有较好的降血脂作用。
17.本发明的有益效果为：本发明与现有技术相比，具有以下显著性优点：本发明的迷果芹多糖sgp
‑
2具有良好的抗肿瘤活性，特别是协同抗肿瘤活性。迷果芹多糖psgp
‑
2为天然提取物，对正常细胞无毒，具有良好的安全性。本发明中的迷果芹多糖psgp
‑
2与doxorubicin联用可抑制4t1肿瘤细胞的增长，提高肿瘤抑制率，抑制率大于单独doxorubicin用药的抑制率，具有减少化疗药物的用量，降低化疗药物的不良反应的优点，可供癌症治疗的药物使用。本发明中的迷果芹多糖psgp
‑
2具有良好的胆酸盐结合能力，具有较好的降血脂作用。本发明所得迷果芹多糖psgp
‑
2为纯品。
附图说明
18.图1为迷果芹多糖gp
‑
2的deae洗脱曲线图。
19.图2为迷果芹多糖psgp
‑
2的sephadex
‑
g100洗脱曲线图。
nacl洗脱液分离的产物。根据gp
‑
2洗脱主峰显示的位置，读出相应的横坐标确定试管数，并将这些试管内的溶液合并于旋蒸瓶中，用旋转蒸发仪在70℃下真空浓缩，透析48 h，冷冻干燥得gp
‑
2样品。
36.取40 mg gp
‑
2样品，用2 ml去离子水溶解，上样至凝胶柱，填料为sephadexg
‑
100，用去离子水洗脱，以每根试管5 ml进行进样。采用苯酚
‑
硫酸法进行显色反应，对洗脱液每管取样1 ml，加入1 ml新配制的6% 苯酚溶液和3 ml浓硫酸。然后在490 nm紫外波长下测量吸光度值，绘制sephadex g
‑
100洗脱曲线，如图2所示。图2为迷果芹多糖psgp
‑
2的sephadex
‑
g100洗脱曲线图，横坐标为试管数，纵坐标为吸光度值，根据吸光度值的变化，图2中共显示1个洗脱主峰。根据洗脱主峰显示的位置，读出相应的横坐标确定试管数，并将这些试管内的溶液合并于旋蒸瓶中，使用旋转蒸发仪在70℃下真空浓缩，用水透析48 h，冷冻干燥，得到迷果芹多糖psgp
‑
2。
37.实施例2
ꢀꢀ
迷果芹多糖psgp
‑
2纯度和分子量的测定配制1 mg/ml psgp
‑
2多糖水溶液，紫外光谱在200
‑
400 nm处扫描，检测样品中游离的核酸和蛋白质的存在，结果如图3所示。图3为迷果芹多糖psgp
‑
2在200
‑
400 nm处扫描紫外光谱图，由图3可知，迷果芹多糖psgp
‑
2在260 nm和280 nm两个波长处都没有吸收峰，说明不含有游离的核酸和蛋白质。
38.运用高效凝胶渗透色谱 (hpgpc) 法对多糖样品的纯度进行分析，并测定分子量。取5 mg迷果芹多糖psgp
‑
2，加入5 ml超纯水制成1 mg/ml的多糖溶液。使用高效凝胶色谱仪测定其保留时间，结果如图4所示。图4为迷果芹多糖psgp
‑
2的hpgpc图，由图4可知，迷果芹多糖psgp
‑
2为单一狭窄的对称峰，可以判断其为单一组分纯品，其平均相对分子量为31623da。
39.实施例3
ꢀꢀ
迷果芹多糖psgp
‑
2的红外分析迷果芹psgp
‑
2多糖，经研细、压片机压片后在波长4000cm
‑1ꢀ‑ꢀ
400cm
‑1范围内进行红外光谱扫描分析，对其进行结构解析，结果如图5所示。图5为迷果芹多糖psgp
‑
2的红外谱图，由图5可知，可以确定psgp
‑
2相应的结构信息，具体为：波长3434.60 cm
‑1处的峰为
‑
oh的伸缩振动，波长2927.41 cm
‑1处的峰为c
‑
h键的伸缩振动，波长1612.20 cm
‑1处的峰表示有结合水的存在，波长1388.50 cm
‑1处的峰表示c
‑
h的变角振动，波长1070.30 cm
‑1处的峰表示其存在吡喃糖环。由此可见，psgp
‑
2是。一种具有五元糖环结构的多糖实施例4
ꢀꢀ
迷果芹多糖psgp
‑
2的核磁分析迷果芹多糖psgp
‑
2（约60 mg）溶解在d2o中。使用600 mhz的bruker核磁共振光谱仪进行检测。结果如图6所示，图6为迷果芹多糖psgp
‑
2的1h
‑
nmr图。异头氢信号在δ5.08
ꢀ‑
5.06 ppm，这是psgp
‑
2中存在α构型糖残基的信号。由此可见，psgp
‑
2为α构型吡喃糖。
40.实施例5
ꢀꢀ
迷果芹多糖psgp
‑
2的单糖分析选用葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖为单糖标准品。将每种单糖标准品称取1mg放入反应瓶中，加入4ml 的3 m 的三氟乙酸溶液（tfa），在氮气保护下120℃下水解处理10 h。反应后，75℃下减压浓缩，以除去多余的tfa。再加入50mg盐酸羟胺和1ml吡啶，90℃下反应40min。待冷却后，加入1ml乙酸酐进行乙酰化反应。反应完全后的样品，采用3 ml三氯甲烷进行萃取，使用0.22
ꢀµ
m有机微孔滤膜进行过滤，滤液进行gc
‑
ms分析。
41.将5mg的迷果芹多糖psgp
‑
2置入反应瓶中，加入4ml的3m的tfa溶液，于120℃的油浴锅中反应10 h。使用旋转蒸发仪在75℃下旋干多余的tfa。加入50mg的盐酸羟胺和0.5 ml的吡啶，90℃反应40 min，冷却后加入0.5 ml的醋酸酐，90℃乙酰化反应40 min。减压浓缩蒸干，用1ml的氯仿萃取，过滤，滤液进行gc
‑
ms分析。上述实验结果如图7a，图7b所示，图7b为迷果芹多糖psgp
‑
2的单糖组成分析的gc
‑
ms谱图，图7a为混合单糖标准品的gc
‑
ms分析图（1：鼠李糖；2：阿拉伯糖；3：岩藻糖；4：木糖；5：甘露糖；6：葡萄糖；7：半乳糖），图7b为psgp
‑
2的gc
‑
ms图。由图7a中可知每种单糖的保留时间。由图7b可知，共显示5个峰，对照上图的保留时间，确定相应单糖种类，得到迷果芹psgp
‑
2多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，且其单糖组成比例分别为2.463%、9.301%、40.019%、19.435%、28.782%。
42.实施例6
ꢀꢀ
迷果芹多糖psgp
‑
2的扫描电镜分析将干燥迷果芹多糖psgp
‑
2样品均匀地平铺在胶带上，使用离子建设仪喷上一层导电金粉，制得的样品放置在样品台上，使用扫描电镜在不同放缩倍数下观察其形态。psgp
‑
2的扫描电镜图片如图8所示。图8为迷果芹多糖psgp
‑
2的扫描电镜图，其中，a为放缩250倍时扫描电镜图，b为放缩2000倍时扫描电镜图，c为放缩4000倍时扫描电镜图，d为放缩6000倍时扫描电镜图。由图8可知，在低倍数下（250倍），psgp
‑
2图像显示有不规则的卷曲薄片状结构。但是随着倍数的放大，可以看到平滑薄膜形状，说明psgp
‑
2不具有规整性。
43.实施例7 迷果芹多糖psgp
‑
2的直接抗肿瘤活性研究将0.2 mg/ml的迷果芹多糖psgp
‑
2作用于人胃癌细胞mgc
‑
803、人卵巢癌细胞a2780、人膀胱癌细胞t24、人鼻咽癌细胞cne
‑
2和小鼠乳腺癌细胞4t1共五种肿瘤细胞（此五种癌细胞均购自中国生命科学学院）中，以mtt法初步研究其直接抗肿瘤活性。
44.1、细胞培养：在培养瓶中分别接种上述各细胞使其贴壁生长，将培养瓶放入温度为37℃且co2含量为5%的培养箱中培养。待细胞贴壁长满培养瓶后进行传代或冻存。
45.2、种板：分别取处于对数生长期的上述五种癌细胞，用pbs缓冲液（磷酸根浓度0.01m，ph为7.2
‑
7.4）轻微洗涤3次。加入2ml的0.25% 的胰蛋白酶
‑
edta消化液消化细胞，然后加入2ml含10%胎牛血清的rpmi.1640培养基终止胰蛋白酶消化，离心(1000 r/ min) 5min，去上清液，加入2ml新鲜的含10%胎牛血清的rpmi.1640培养基，轻轻吹打，制成单个细胞悬浮液，通过细胞计数，以每孔150μl的容量接种于96孔板中，每孔细胞数范围为20000
‑
30000，培养箱中培养48h。
46.3、加药：给药组：将迷果芹多糖psgp
‑
2溶解在水中，配置成10 mg/ml的迷果芹多糖sgp
‑
2水溶液，把迷果芹多糖psgp
‑
2水溶液用不含胎牛血清的rpmi.1640不完全培养液稀释成0.2 mg/ml的溶液作用于上述五种癌细胞，对其的抗肿瘤活性进行探究，以及筛选出抗肿瘤效果最好的肿瘤细胞，以供后续研究。每孔加150
ꢀµ
l，每个浓度设6个复孔。同时设置空白对照组：每孔加150
µ
l不含胎牛血清的rpmi.1640培养基，培养箱中培养24h后，弃掉培养基，每孔加入100
ꢀµ
l的1
×
mtt药物（1 mg/ml）和不含胎牛血清的rpmi.1640不完全培养液的混合溶液，继续培养4小时。使用酶标仪测定，进行初步筛选。在490 nm处测定每孔的od值。各样品的抑制率按以下计算公式换算：抑制率(%)=(1
‑
od
样品
/od
对照
)
×
100其中，od样品是给药组的od值，od空白是空白组的od值在0.2 mg/ml迷果芹多糖 psgp
‑
2的较低浓度下，对人胃癌细胞mgc
‑
803的抑制率
doxorubicin 在反应24h后，对小鼠乳腺癌细胞4t1的抑制率为45.22%；0.25 mg/ml 迷果芹多糖psgp
‑
2 在反应24h后，对小鼠乳腺癌细胞4t1的抑制率为19.35%；然而，将20 μm doxorubicin和0.25 mg/ml 迷果芹多糖psgp
‑
2联合使用后，对小鼠乳腺癌细胞4t1的抑制率达60.20%，与单独使用20 μm doxorubicin用药比较，对小鼠乳腺癌细胞4t1抑制率提高近15%。将0.5 mg/ml 迷果芹多糖psgp
‑
2在反应24h后，对小鼠乳腺癌细胞4t1的抑制率为46.58%；然而，将20 μm doxorubicin和0.5 mg/ml 迷果芹多糖psgp
‑
2联合使用后，对小鼠乳腺癌细胞4t1的抑制率为71.42%，与单独使用20 μm doxorubicin用药比较，对小鼠乳腺癌细胞4t1抑制率提高25%以上。mtt实验数据表明，与doxorubicin单独用药相比，迷果芹多糖psgp
‑
2与doxorubicin联用可以提高肿瘤抑制率，由此可见psgp
‑
2和doxorubicin具有协同增效抗肿瘤作用。
52.迷果芹多糖psgp
‑
2联合doxorubicin对小鼠乳腺癌细胞4t1的am/pi染色成像如图10所示。图9为迷果芹多糖psgp
‑
2联合doxorubicin对4t1细胞的am/pi荧光染色图，绿色为活细胞，红色为死细胞。由图10可知，随着迷果芹多糖psgp
‑
2浓度的增加，荧光呈红色的面积在增加，表示细胞在孵卵12h后小鼠乳腺癌细胞4t1死亡数目增加。可见迷果芹多糖psgp
‑
2和doxorubicin在细胞水平上促进肿瘤细胞凋亡，具有协同增效抗肿瘤作用。
53.使用jc
‑
1 染色检测线粒体膜电位变化实验研究迷果芹多糖psgp
‑
2联合doxorubicin对4t1细胞肿瘤抑制作用的实验结果如图11所示。图11为迷果芹多糖psgp
‑
2联合doxorubicin对4t1细胞的染色线粒体膜的结果图，由图11可知，与单独的20 μm doxorubicin用药相比，随着迷果芹多糖psgp
‑
2样品浓度的增加，红色荧光强度显著下降，绿色荧光显著增强，由此可见显示细胞线粒体膜电位下降，迷果芹多糖psgp
‑
2与doxorubicin联合使用具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。
54.由此可见，将迷果芹多糖psgp
‑
2与doxorubicin联合用药，具有抗肿瘤协同增效作用，有望进一步开发。
55.实施例9将0，0.0625 mg/ml，0.125 mg/ml，0.25 mg/ml，0.5 mg/ml，1.0 mg/ml的迷果芹多糖psgp
‑
2溶液作用于人正常肝细胞l
‑
02中，以mtt法初步研究其直接抗肿瘤活性。
56.1、细胞培养：在培养瓶中接种l
‑
02细胞使其贴壁生长，将培养瓶放入温度为37℃且co2含量为5%的培养箱中培养。待细胞贴壁长满培养瓶后进行传代或冻存。
57.2、种板：分别取处于对数生长期的细胞，用pbs缓冲液（磷酸根浓度0.01m，ph为7.2
‑
7.4）轻微洗涤3次。加入2ml的0.25% 的胰蛋白酶
‑
edta消化液消化细胞，然后加入2ml含10%胎牛血清的rpmi.1640培养基终止胰蛋白酶消化，离心(1000 r/ min) 5min，去上清液，加入2ml新鲜的含10%胎牛血清的rpmi.1640培养基，轻轻吹打，制成单个细胞悬浮液，通过细胞计数，以每孔150μl的容量接种于96孔板中，每孔细胞数范围为20000
‑
30000，培养箱中培养48h。
58.3、加药：给药组：将迷果芹多糖psgp
‑
2溶解在水中，配置成10 mg/ml的迷果芹多糖psgp
‑
2水溶液，把迷果芹多糖psgp
‑
2水溶液用不含胎牛血清的rpmi.1640不完全培养液稀释成相应浓度（0，0.0625 mg/ml，0,125 mg/ml，0.25 mg/ml，0.5 mg/ml，1.0 mg/ml）的溶液作用于上述的l
‑
02细胞，对其细胞毒性进行测定。每孔加150
ꢀµ
l，每个浓度设6个复孔。同时设置空白对照组：每孔加150
µ
l不含胎牛血清的rpmi.1640培养基，培养箱中培养24h后，弃
掉培养基，每孔加入100
ꢀµ
l的1
×
mtt药物（1 mg/ml）和不含胎牛血清的rpmi.1640不完全培养液的混合溶液，继续培养4小时。使用酶标仪测定，进行初步筛选。在490 nm处测定每孔的od值。各样品的抑制率按以下计算公式换算：细胞活力(%)=(od
样品
/od
对照
)
×
100其中，od样品是给药组的od值，od空白是空白组的od值如图12所示，细胞活力值不低于100%，说明迷果芹纯化多糖psgp
‑
2对正常细胞并无杀伤作用，其不具有毒副作用，具有较好的安全性。
59.实施例10通过体外胆酸盐结合实验评价了psgp
‑
2的降血脂活性。选择牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠作为结合剂。计算不同浓度的多糖溶液与其的结合率。使用磷酸盐缓冲液（0.1mol / l，ph = 6.3）配置10 mg / ml的胃蛋白酶溶液和10 mg / ml的胰蛋白酶溶液。在具塞试管中加入5mg的多糖样品和3ml的胃蛋白酶溶液，然后加入1 ml 加入0.01mol / l hcl溶液，在37℃下摇动1小时。反应结束后，使用0.1 mol / l 的naoh溶液将ph值调节到6.3，然后加入4 ml胰蛋白酶溶液，在37℃下摇动1小时。向每个具塞试管中分别加入4 ml甘氨胆酸钠溶液（0.4 mmol / l，由ph 6.3的0.1 mol / l磷酸缓冲液制备）和4 ml牛磺胆酸钠溶液（ph 6.3的0.1 mol / l磷酸盐缓冲液制备）。在37℃摇动1小时后，将混合物转移到离心管中。通过以4000 rpm离心10分钟来收集上清液。用于紫外光度计下387nm处测定甘氨酸钠胆酸钠和牛磺胆酸钠的含量。
60.结合率(%) = (加入量一剩余量) / 加入量实验结果表明。psgp
‑
2的牛磺胆酸钠结合率为28.58%，甘氨胆酸钠的结合率为48.01%，结合率较高，体现良好的降血脂价值。
61.实施例仅用来进一步解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，在不脱离本发明技术特征的情况下，利用本发明所揭示技术内容所作出局部更动或修饰的等效变换，均仍属于本发明保护范围内。