本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基及培养方法。
背景技术：
：间充质干细胞(mesenchymalstemcells，msc)是中胚层来源的、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。目前，主要从脐带、骨髓、脂肪组织、牙髓、胎盘中提取间充质干细胞。间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，为临床治疗各种疾病，如神经系统疾病、肾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗提供了新的途径。脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有取材方便，来源丰富，生物学特性稳定，免疫原性低的特点，使其成为未来干细胞在医疗应用的理想种子细胞。此外，脐带间充质干细胞能在培养过程中可分泌多种干细胞因子，包括成纤维细胞生长因子(fgf)、血管内皮生长因子(vegf)、表皮生长因子（egf）等在内的各种生长因子，这些生长因子可促进细胞生长，维持细胞干性，并且在美容护肤领域有广泛的应用，收集条件培养基是获得这些活性成分的有效方法。目前培养脐带间充质干细胞所使用的培养基配方多为dmem/f12+血清，或在此基础上添加一些其他的细胞生长所需的营养物质，可适用于脐带间充质干细胞的大规模培养。但是，血清中未知成分较多，甚至有可能包括一些未知的过敏原和病原体，无法保证所培养的细胞的安全性，对细胞的临床应用造成障碍。而目前脐带间充质干细胞使用的无血清培养基对细胞的培养效果不佳，存在细胞生长缓慢且活性差，培养基中细胞因子含量低等问题，影响了脐带间充质干细胞生物制品的推广应用。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基，不添加血清，提高脐带间充质干细胞的培养效率，促进细胞因子的分泌。本发明的目的之二在于提供一种人脐带间充质干细胞的培养方法。本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基，由基础培养基和添加在基础培养基中的以下成分组成：谷胱甘肽、α-生育酚、桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺、亚硒酸钠、维生素c、胰岛素。进一步地，以终浓度计，各组分的用量为：谷胱甘肽12-16μg/ml、α-生育酚1-3μg/ml、桉脂素5.5-8.5ng/ml、戊酸雌二醇5-10ng/ml、乙酰唑胺3.5-5ng/ml、亚硒酸钠5-10μg/ml、维生素c8-11μg/ml、胰岛素10-15μg/ml。进一步地，以终浓度计，各组分的用量为：谷胱甘肽14μg/ml、α-生育酚2μg/ml、桉脂素7.5ng/ml、戊酸雌二醇8ng/ml、乙酰唑胺4.5ng/ml、亚硒酸钠7μg/ml、维生素c10μg/ml、胰岛素13μg/ml。进一步地，所述基础培养基为dmem/f12培养基。本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种人脐带间充质干细胞的培养方法，采用上述培养基进行细胞培养。进一步地，所述人脐带间充质干细胞的培养方法包括以下步骤：（1）取基础培养基，加入谷胱甘肽、α-生育酚、桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺、亚硒酸钠、维生素c、胰岛素，混合均匀；（2）将待培养的人脐带间充质干细胞接种在步骤（1）的培养基中，在37℃，5%co2的条件下进行扩增培养，连续培养7天即完成。进一步地，培养基中接种的人脐带间充质干细胞的密度为1-5×104个/ml。进一步地，培养过程中每2天更换一次培养基。相比现有技术，本发明的有益效果在于：1、本发明提供一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基，培养基中不添加外源性血清，成分明确，各组分协同作用，促进脐带间充质干细胞的增殖和细胞因子的分泌。2、培养基中添加的桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺等成分不仅避免了在培养基中添加血清成存在安全隐患的成分，而且通过上述成分的加入能提高脐带间充质干细胞的增殖效率，在短时间内可以获取大量的脐带间充质干细胞，并且提高培养液中细胞因子的含量，为脐带间充质干细胞的安全应用提供保障。3、本发明还提供了一种人脐带间充质干细胞的培养方法，采用本发明提供的培养基，安全高效，过程简便易于操作。具体实施方式下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。制备扩增用人脐带间充质干细胞：（1）取新鲜健康脐带，用pbs冲洗干净后，用镊子剔去血管，将分离的脐带胶质剪成1-2mm3的组织块，平铺至t75培养瓶底部，加入含10%fbs，100u/ml青霉素，100u/ml链霉素的α-mem培养基置于37℃，5%的co2培养箱培养；（2）培养7d时，组织块周边有脐带间充质干细胞出现，继续培养，待脐带间充质干细胞达到80%的融合时，弃去脐带组织块和原有培养液，生理盐水洗涤后加入0.25%的胰酶消化，将消化后的细胞用于下述扩增培养中。实施例1一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基，由dmem/f12培养基和添加在上述培养基中的以下成分组成：谷胱甘肽、α-生育酚、桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺、亚硒酸钠、维生素c、胰岛素；以终浓度计，各组分的用量为：谷胱甘肽14μg/ml、α-生育酚2μg/ml、桉脂素7.5ng/ml、戊酸雌二醇8ng/ml、乙酰唑胺4.5ng/ml、亚硒酸钠7μg/ml、维生素c10μg/ml、胰岛素13μg/ml。一种人脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：（1）取dmem/f12培养基，加入谷胱甘肽、α-生育酚、桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺、亚硒酸钠、维生素c、胰岛素，混合均匀；（2）将待培养的人脐带间充质干细胞接种在步骤（1）的培养基中，培养基中接种的人脐带间充质干细胞的密度为3×104个/ml，在37℃，5%co2的培养箱中进行扩增培养，培养过程中每2天更换一次培养基，连续培养7天即完成。实施例2一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基，由dmem/f12培养基和添加在上述培养基中的以下成分组成：谷胱甘肽、α-生育酚、桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺、亚硒酸钠、维生素c、胰岛素；以终浓度计，各组分的用量为：谷胱甘肽12μg/ml、α-生育酚1μg/ml、桉脂素5.5ng/ml、戊酸雌二醇5ng/ml、乙酰唑胺3.5ng/ml、亚硒酸钠5μg/ml、维生素c8μg/ml、胰岛素10μg/ml。一种人脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：（1）取dmem/f12培养基，加入谷胱甘肽、α-生育酚、桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺、亚硒酸钠、维生素c、胰岛素，混合均匀；（2）将待培养的人脐带间充质干细胞接种在步骤（1）的培养基中，培养基中接种的人脐带间充质干细胞的密度为1×104个/ml，在37℃，5%co2的培养箱中进行扩增培养，培养过程中每2天更换一次培养基，连续培养7天即完成。实施例3一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基，由dmem/f12培养基和添加在上述培养基中的以下成分组成：谷胱甘肽、α-生育酚、桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺、亚硒酸钠、维生素c、胰岛素；以终浓度计，各组分的用量为：谷胱甘肽16μg/ml、α-生育酚3μg/ml、桉脂素8.5ng/ml、戊酸雌二醇10ng/ml、乙酰唑胺5ng/ml、亚硒酸钠10μg/ml、维生素c11μg/ml、胰岛素15μg/ml。一种人脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：（1）取dmem/f12培养基，加入谷胱甘肽、α-生育酚、桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺、亚硒酸钠、维生素c、胰岛素，混合均匀；（2）将待培养的人脐带间充质干细胞接种在步骤（1）的培养基中，培养基中接种的人脐带间充质干细胞的密度为5×104个/ml，在37℃，5%co2的培养箱中进行扩增培养，培养过程中每2天更换一次培养基，连续培养7天即完成。对比例1对比例1提供一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基，和对比例1的区别为：省去桉脂素，其余均和实施例1相同。对比例2对比例2提供一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基，和对比例1的区别为：将桉脂素替换为1,8-桉叶素，其余均和实施例1相同。对比例3对比例3提供一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基，和对比例1的区别为：省去戊酸雌二醇，其余均和实施例1相同。对比例4对比例4提供一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基，和对比例1的区别为：省去乙酰唑胺，其余均和实施例1相同。对比例5对比例5提供一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基，和对比例1的区别为：省去桉脂素、乙酰唑胺，将其替换为等量的胎牛血清，其余均和实施例1相同。对比例6对比例6提供一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基，和对比例1的区别为：省去桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺，将其替换为等量的胎牛血清，其余均和实施例1相同。采用0.4%台盼蓝进行细胞染色，细胞计数后统计实施例1至3，对比例1至6中脐带间充质干细胞的增殖倍数及细胞活率，结果如表1所示。增殖倍数=培养7天统计的细胞总数量/初始接种数量；细胞活率=活细胞数量/总细胞数量×100%。表1组别增殖倍数细胞活率实施例152.4799.35%实施例250.8998.32%实施例351.6398.47%对比例125.7681.56%对比例228.3584.79%对比例331.6588.52%对比例433.0785.49%对比例535.4790.92%对比例624.5984.83%由表1可以看出，实施例1至3中的细胞增殖倍数高于对比例1至6，细胞增殖活性较好，增殖效率以及细胞活率均优于对比例1至6。对比例1至2中分别省去了桉脂素或者将桉脂素替换为1,8-桉叶素，细胞的增殖活性和实施例1相比下降显著，说明本发明添加的桉脂素有助于提高脐带间充质干细胞的增殖活性，提高细胞的扩增效率。对比例3和对比例4中分别省去了戊酸雌二醇、乙酰唑胺，脐带间充质干细胞的增殖活性及活率均有不同程度的下降，对比例5中省去了桉脂素、乙酰唑胺，替换为等量的胎牛血清，对比例6中省去桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺三种成分后替换为等量的胎牛血清，脐带间充质干细胞的增殖倍数及活率均不及实施例1，说明本发明的培养基在不添加胎牛血清的情况下，通过桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺等成分的协同作用，提高了脐带间充质干细胞的增殖效率，在短时间内可以获取大量具有活性的脐带间充质干细胞。将实施例1至3，对比例1至6的培养基分别添加在12孔板中，每组培养基设置3个孔，接种脐带间充质干细胞，细胞密度为1×104个/ml，置于37℃，5%co2的培养箱中培养48h，采用酶联免疫法（elisa）对实施例1至3，对比例1至6中培养液中的细胞因子进行检测：表皮生长因子（egf）、血管内皮生长因子（vegf）、成纤维细胞生长因子（fgf）的含量如表2所示。表2样品egf（ng/ml）vegf（ng/ml）fgf（ng/ml）实施例162.9853.54120.26实施例260.3754.78118.47实施例361.4953.61119.25对比例125.3623.9657.44对比例228.9429.2262.67对比例331.7335.3968.15对比例435.6434.3672.39对比例541.8139.9180.28对比例626.3930.3165.90由表2可以看出，实施例1至3中细胞因子含量高于对比例1至6，这是因为对比例1至6中调整了培养基的组成，对比例1至2中分别省去了桉脂素或者将桉脂素替换为1,8-桉叶素，对比例3和对比例4中分别省去了戊酸雌二醇、乙酰唑胺，对比例5中省去了桉脂素、乙酰唑胺，替换为等量的胎牛血清，对比例6中省去桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺三种成分后替换为等量的胎牛血清，培养液中细胞因子的含量均有不同程度的下降，说明本发明培养基成分中的桉脂素、戊酸雌二醇、乙酰唑胺协同作用，有效促进脐带间充质干细胞分泌细胞因子。上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。当前第1页12