一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法和应用与流程

1.本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。


背景技术：

2.玉米黄质(zeaxanthin，3,3
’‑
二羟基-β-胡萝卜素)是一种含氧类胡萝卜素衍生物，首次在玉米中发现。高纯度的玉米黄质是一种橙色结晶粉末，很少或没有气味，可溶于醚、酯类和其他有机溶剂，不溶于水，主要由植物、藻类和微生物天然生产。玉米黄质具有很强的抗氧化和抗癌特性，在预防老年性黄斑变性和白内障中起着重要作用，因此被广泛用于食品、制药和营养行业。
3.玉米黄质的生产方法主要包括化学合成法、天然提取法和微生物发酵法。首先，玉米黄质可以用化学方法合成，但技术路线复杂，成本昂贵，生物活性差，因此化学合成的玉米黄质只能作为颜料使用。其次，玉米黄质也可从黄色的蔬菜和水果中提取，如玉米、辣椒、橘子、瓜类、芒果等，并且提取获得的玉米黄质具有多种功能活性。然而，提取率低，污染环境等问题限制了玉米黄质提取技术的发展。第三，微生物生产玉米黄质可以用野生或工程微生物，该方法具有原料成本低、环境污染小等优点。此外，微生物的代谢工程提供了另一种方法，通过异源生物合成途径的引入，基因工程的应用，在细菌、酵母和微藻中非天然生产具有安全性和高生物活性的玉米黄质。因此微生物发酵法生产玉米黄质具有明显的优势。特别是随着生物技术的快速发展，利用微生物发酵生产玉米黄质成为目前研究的热点之一。
4.解脂耶氏酵母作为一种油脂酵母可以为类胡萝素提供储存空间，具有广泛利用底物的能力，是公认的安全性菌株。但迄今为止，利用酵母生产玉米黄质的报道并不多，并且普遍产量较低，更未有在解脂耶氏酵母中，将玉米黄质作为目标代谢产物的研究报道。因此亟需开发玉米黄质合成的解脂耶氏酵母基因工程菌。


技术实现要素：

5.本发明通过构建解脂耶氏酵母生产玉米黄质的合成途径，所构建的基因工程菌株含有2个拷贝的优化的pantoea agglomerans来源的β-胡萝卜素羟化酶基因crtz和1个拷贝的yarrowia lipolytica内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因hmg。优选的，所述的重组菌株含有bordetella petrii来源的nadh依赖型hmg辅酶a还原酶基因hmg，escherichia coli来源的乙酰辅酶a乙酰基转移酶基因atob。优选的，所述的重组菌株中过表达了将hmg-coa还原为甲羟戊酸的yarrowia lipolytica内源的基因hmg，并同时过表达将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的yarrowia lipolytica内源的基因erg12，成功获得了高产玉米黄质的解脂耶氏酵母生产菌株。因此，本发明的第一个目的是提供一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法。本发明的第二个目的是提供一种产玉米黄
质的解脂耶氏酵母基因工程菌。本发明的第三个目的是一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的应用。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.作为本发明的第一个方面，一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其是将2个拷贝的优化的crtz基因依次导入解脂耶氏酵母基因工程菌xk17中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌my1；再将hmg基因导入工程菌my1，得到解脂耶氏酵母基因工程菌my3；接着，将优化的hmg基因和优化的atob基因，整合到解脂耶氏酵母基因工程菌my3中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌ha，所述优化的crtz基因、优化的hmg基因和优化的atob基因的核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
8.具体的，所述产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
9.步骤一、以产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌xk17作为底盘菌株，利用crispr/cas9系统，将优化的crtz基因整合到解脂耶氏酵母基因工程菌xk17的染色体的e1-3位点，得到重组菌dn1；再向重组菌dn1的a-3位点导入优化的crtz基因，得到产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌my1，优化的crtz基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；解脂耶氏酵母基因工程菌xk17参见专利申请号为cn202010107322.1的发明专利申请文献；
10.步骤二、利用crispr/cas9系统，将hmg基因导入解脂耶氏酵母基因工程菌my1染色体的a1-2位点，得到产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌my3，所述的hmg基因在ncbi中登录号为gb:nc_006071；
11.步骤三、将优化的hmg基因和优化的atob基因通过酶切位点hindⅲ和ndeⅰ构建到质粒pmd18t-ku70-hisg中，得到质粒pmd18t-ku70-hisg-hmg-atob，对质粒pmd18t-ku70-hisg-hmg-atob线性化后，导入解脂耶氏酵母基因工程菌my3中，获得ha菌株，其中，所述优化的hmg基因、优化的atob基因以及质粒pmd18t-ku70-hisg的序列分别如seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示。
12.根据本发明，本发明的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，还包括：
13.步骤四、将线性化后的质粒pina1269-hmg1-erg12，转化入解脂耶氏酵母基因工程菌ha中，得到玉米黄质高产菌株ha-eh，其中，所述质粒pina1269-hmg1-erg12的核苷酸序列参见专利申请号为201610817882.x的发明专利申请文献。
14.作为本发明的第二个方面，一种生产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌，其通过上述所述的方法构建获得。
15.作为本发明的第三个方面，一种如上述所述的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌在生产玉米黄质中的应用，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌能够利用葡萄糖高产玉米黄质。
16.本发明的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法的有益效果：本发明过表达了基因hmg、atob和erg12，使碳通量尽可能多的流入玉米黄质合成途径，减少对底物的浪费，能极大幅度地提高玉米黄质的产量。
17.本发明的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌，其有益效果：
18.(1)玉米黄质的产量高：本发明的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌能使玉米黄质在摇瓶水平达到720mg/l的产量。
19.(2)获得的菌株经过连续传代培养稳定性良好，能够用于大规模的商业化生产，所得的玉米黄质能够被安全的利用，前景良好。
附图说明
20.图1为解脂耶氏酵母异源生物合成玉米黄质的代谢途径。
21.图2为整合基因bphmg、atob和erg13，获得的不同转化株生产玉米黄质的结果图。
22.图3为整合基因bphmg和atob，获得的不同转化株生产玉米黄质的结果图。
23.图4为整合基因bphmg和erg13，获得的不同转化株生产玉米黄质的结果图。
24.图5为整合基因atob和erg13，获得的不同转化株生产玉米黄质的结果图。
25.图6为利用质粒pina1269-hmg1-erg12，整合hmg和erg12基因，获得的不同转化株生产玉米黄质的结果图。
26.图7为菌株xk17、dn1、my1、my3、ha2和ha-eh2摇瓶发酵生产玉米黄质的结果图。
具体实施方式
27.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
28.1、本发明实施例中的解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)采用xk17作为出发菌株，参见专利申请号为cn202010107322.1的发明专利申请文献。
29.2、质粒phr_e1-3_hrgfp、pcrispryl_e1-3、phr_a-3_hrgfp、pcrispryl_a-3、phr_a1-2_hrgfp和pcrispryl_a1-2参见schwartz,c.,shabbir-hussain,m.,frogue,k.,blenner,m.,wheeldon,i.2017.standardized markerless gene integration for pathway engineering in yarrowia lipolytica.acs synth biol,6(3),402-409所记载的方法制备而成。
30.3、质粒pina1269-hmg1-erg12：其核苷酸序列参见专利申请号为201610817882.x的发明专利申请文献。
31.实施例1：构建菌株my1
32.(1)将pantoea agglomerans来源的β-胡萝卜素羟化酶基因crtz的优化序列(核苷酸序列如seq id no.1)分别通过酶切位点nheⅰ和bsshⅱ构建到质粒phr_e1-3_hrgfp和质粒phr_a-3_hrgfp中，得到质粒phr_e1-3_crtz和phr_a-3_crtz。
33.(2)将步骤(1)中所得的质粒phr_e1-3_crtz和质粒pcrispryl_e1-3转化入解脂耶氏酵母xk17中，获得重组菌株dn1。其中，转化使用试剂盒frozen ez yeast transformation ii
tm
(购自zymo research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。将步骤(1)中所得的质粒phr_a-3_crtz和质粒pcrispryl_a-3同时转入解脂耶氏酵母dn1中，获得菌株my1。
34.实施例2：构建菌株my3
35.(1)将yarrowia lipolytica内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因hmg的序列(ncbi中登录号为gb:nc_006071)通过酶切位点nheⅰ和bsshⅱ构建到质粒phr_a1-2_hrgfp中，得到质粒phr_a1-2_hmg。
36.(2)将步骤(1)中所得的质粒phr_a1-2_hmg和质粒pcrispryl_a1-2转化入解脂耶氏酵母my1中，获得my3。经验证，解脂耶氏酵母my3的a1-2位点导入了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因hmg。
37.实施例3：获得玉米黄质高产菌株ha
38.本实施例的基因和质粒来源：
39.hmg基因为来自bordetella petrii的nadh依赖型3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因hmg，其优化序列的核苷酸序列如seq id no.2所示；
40.atob基因为escherichia coli来源的乙酰辅酶a乙酰基转移酶atob，其优化序列的核苷酸序列如seq id no.3所示；
41.erg13基因为yarrowia lipolytica内源的hmg辅酶a合成酶erg13的序列(ncbi中登录号为gb:nc_006072.1)；
42.质粒pmd18t-ku70-hisg，其核苷酸序列如seq id no.4所示。
43.(1)将优化的hmg基因的序列，优化的乙酰辅酶a乙酰基转移酶atob的优化序列和erg13的序列通过酶切位点hindⅲ和ndeⅰ构建到质粒pmd18t-ku70-hisg中，得到质粒pmd18t-ku70-hisg-hmg-atob-erg13；
44.将hmg的优化序列和atob的优化序列通过酶切位点hindⅲ和ndeⅰ构建到质粒pmd18t-ku70-hisg中，得到质粒pmd18t-ku70-hisg-hmg-atob；
45.将hmg的优化序列和erg13的序列通过酶切位点hindⅲ和ndeⅰ构建到质粒pmd18t-ku70-hisg中，得到质粒pmd18t-ku70-hisg-hmg-erg13；
46.将atob的优化序列和erg13的序列通过酶切位点hindⅲ和ndeⅰ构建到质粒pmd18t-ku70-hisg中，得到质粒pmd18t-ku70-hisg-atob-erg13。
47.(2)通过酶切位点ndeⅰ和ecorⅰ将(1)中的4种质粒分别线性化后，转化入实施例2所得的菌株my3中，获得6个hae菌株、2个ha菌株、4个he菌株和6个ae菌株。
48.6个hae菌株的产量分别为122mg/l、133mg/l、126mg/l、137mg/l、145mg/l和142mg/l，结果如图2所示。
49.2个ha菌株的产量分别为292mg/l和394mg/l，结果如图3所示。
50.4个he菌株的产量分别为134mg/l、133mg/l、134mg/l和90mg/l，结果如图4所示。
51.6个ae菌株的产量分别为259mg/l、281mg/l、268mg/l、274mg/l、271mg/l、和247mg/l，结果如图5所示。
52.hae菌株、ha菌株、he菌株和ae菌株的玉米黄质的产量分别为122-145mg/l、292-394mg/l、90-134mg/l和247-281mg/l。
53.经过比较，ha的产量比较高，将两株ha进行后续试验。
54.实施例4：获得玉米黄质高产菌株ha-eh
55.将线性化后的质粒pina1269-hmg1-erg12，转化入实施例3获得的两株解脂耶氏酵母基因工程菌ha中，整合yarrowia lipolytica内源的基因hmg和基因erg12基因，获得两个ha-eh菌株。两株ha-eh1和ha-eh2菌株的产量分别为480mg/l和720mg/l，结果如图6所示。
56.实施例5：测定菌株产玉米黄质的产量
57.将菌株解脂耶氏酵母xk17，实施例1制备的菌株dn1和my1，实施例2制备的菌株my3，实施例3制备的菌株ha2，实施例4制备的ha-eh2，分别接种于2ml ypd培养基(该ypd培
养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)，培养24小时，然后以初始od
600
为0.01的接种量接种于新的50ml ypd培养基进行培养。发酵培养4天后，使用dmso和丙酮进行玉米黄质的提取。之后利用高效液相色谱仪c
18
反相色谱柱对类胡萝卜素进行定性和定量分析，检测的结果参见图7。
58.图7的结果说明，菌株ha-eh2产玉米黄质的能力大幅度提升，在发酵的第4天，玉米黄质的产量为720mg/l。
59.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。