新型冠状病毒B.1.351南非突变株RBD的基因及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的基因及其应用。

背景技术：

2019新型冠状病毒sars-cov-2，引发新型冠状病毒肺炎covid-19，是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov（引发重症急性呼吸综合征）和mers-cov（引发中东呼吸综合征）。

冠状病毒是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的rna病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒粒子呈不规则形状，直径约60-220nm；基因组全长约27-32kb，是目前已知rna病毒中基因组最大的病毒。病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白（s，spikeprotein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点）；小包膜糖蛋白（e，envelopeprotein，较小，与包膜结合的蛋白）；膜糖蛋白（m，membraneprotein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成）。

冠状病毒的核酸为非节段单链（+）rna，长27-31kb，是rna病毒中最长的rna核酸链，突变可以说是新冠病毒这类rna病毒的最大特性。病毒入侵宿主细胞后，会大量复制自己来实现感染传播。在复制过程中，rna病毒并没有校正机制，出现复制错误无法自行纠正，在大量的复制中就容易出现新的变异，而新的变异的结果是导致疫苗有效性降低或者失效的主要原因。

据世界卫生组织官网显示，目前全世界已经发现数百种新冠病毒的变种，其中“南非”突变株出现于2020年12月，在南非首次发现，因此被命名为“南非”株，现已经在非洲、欧洲、亚洲和澳大利亚发现。相比于野生型病毒株，南非突变株共发生21个突变，8个在刺突spike蛋白上的突变，例如：l18f、d80a、d215g、r246i、k417n、e484k、n501y和a701v；还有刺突蛋白以外的orf1b缺失。目前的研究初步认为传染性增强，致病力是否增强正在研究，体外研究表明，其具有自然感染后免疫逃逸的可能性，并且影响了疫苗的效应。

这些位点是新冠病毒抗体或疫苗产生作用很重要的靶位点。如果这些位点发生变异，会增加抗体对病毒的识别难度，从而使病毒逃避“追杀”；spike区域发生突变，容易导致“抗体中和逃逸”现象出现，简单来说，南非株的这些突变特性有可能让它变得感染性更强、更容易传播有可能会让它更容易逃脱抗体的追杀，可能导致疫苗失效。

另研究证实，大多数中和抗体都针对新型冠状病毒的突刺蛋白(s)的受体结合域(rbd)，rbd是病毒进入宿主细胞的关键部位，rbd蛋白可以和细胞的ace2受体相互作用，打开细胞表面通道，使病毒颗粒得以进入细胞内，完成病毒入侵过程，因此研发针对新冠病毒突变株的重组rbd疫苗是有效防治病毒突变株的重点。

作为重组疫苗抗原组成，利用cho、293t等细胞真核表达系统制备疫苗抗原是保证其免疫原性和正确高级结构的最佳途径之一。然而，突变株野生型病毒序列在真核表达系统一般来说表达水平很低，但作为疫苗研发而言，高表达水平是首要前提，其受多个环节的影响，例如，抗原编码的核苷酸序列，载体选择、宿主细胞选择，发酵工艺、培养工艺优化等等，在这些因素中，首要需解决问题的是蛋白基因编码序列。

因此，如何提供一种经过设计可高效表达的新型冠状病毒南非突变株rbd核苷酸序列，并对其进行表达应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的设计优化后的基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供利用上述基因制备新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的方法。

本发明的再一目的在于提供上述基因在制备新型冠状病毒疫苗方面的应用。

根据本发明具体实施方式的新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的优化后的基因，其核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.6所示。

其中，seqidno.1：

agagtgcagccaacagagagcatcgtgaggttccccaacatcaccaacctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgcaacaaggttcgccagcgtgtacgcctggaacagaaaaaggatcagcaactgcgtggcagactacagtgtgctgtacaactccgcctccttctccaccttcaaatgctatggcgtgtcccccaccaagctgaacgatctgtgttttaccaacgtgtacgccgactccttcgtgattaggggcgacgaggtgcgccagatcgctcctggacagacaggaaacatcgccgactataactacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgattgcttggaactccaacaacctggacagtaaagtgggcggcaactacaattacctgtacagactgttcaggaagagcaacctgaaacccttcgaaagagacatctccacagagatctaccaggccggcagcaccccatgtaacggagtgaagggatttaactgctacttccccctgcagtcctacggcttccagccaacatacggcgtgggctaccagccttacagggtggtggtgctgtcttttgagctgctgcacgcccccgctacagtgtgtggacctaagaagtccaccaacctggtgaaaaacaaatgtgtcaatttc

seqidno.6：

gctagcccaccatgaaatgggttactttcttattattattgtttgtatctgattctgctttttcaagagtgcagccaacagagagcatcgtgaggttccccaacatcaccaacctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgcaacaaggttcgccagcgtgtacgcctggaacagaaaaaggatcagcaactgcgtggcagactacagtgtgctgtacaactccgcctccttctccaccttcaaatgctatggcgtgtcccccaccaagctgaacgatctgtgttttaccaacgtgtacgccgactccttcgtgattaggggcgacgaggtgcgccagatcgctcctggacagacaggaaacatcgccgactataactacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgattgcttggaactccaacaacctggacagtaaagtgggcggcaactacaattacctgtacagactgttcaggaagagcaacctgaaacccttcgaaagagacatctccacagagatctaccaggccggcagcaccccatgtaacggagtgaagggatttaactgctacttccccctgcagtcctacggcttccagccaacatacggcgtgggctaccagccttacagggtggtggtgctgtcttttgagctgctgcacgcccccgctacagtgtgtggacctaagaagtccaccaacctggtgaaaaacaaatgtgtcaatttctaagcggccgc

其中，斜体“gctagc”为酶切位点，下划线部分“ccacc”为kozak序列。

为了在宿主细胞特异性高表达，本发明选择中国仓鼠血清白蛋白序列中的信号肽，其氨基酸序列为mkwvtfllllfvsdsafs，优化后宿主细胞特异性高表达分泌蛋白信号肽核的苷酸序列如下：

seqidno.5：

atgaaatgggttactttcttattattattgtttgtatctgattctgctttttca。

新型冠状病毒b.1.351南非突变株的rbd蛋白的氨基酸序列如seqidno.9所示：

1mkwvtfllllfvsdsafsrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisn

61cvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgniad

121ynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpc

181ngvkgfncyfplqsygfqptygvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvn

241f

上述酶全长241个氨基酸，n端18个氨基酸为信号肽序列“mkwvtfllllfvsdsafs”。

因此，成熟的新型冠状病毒b.1.351南非突变株的rbd蛋白的氨基酸序列如seqidno.10所示：

rvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgniadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvkgfncyfplqsygfqptygvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnf

本发明还提供了包含上述新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的重组载体，优选为pcdna3.1+。将本发明的新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd插入到质粒pcdna3.1+的nhel/notl双酶切限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，从而得到重组表达载体。

本发明还提供新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的宿主细胞，优选为中国仓鼠cho细胞、293细胞。中国仓鼠cho细胞易实现大规模高密度培养、完整的蛋白糖基化修饰。宿主细胞特异性高表达分泌蛋白信号肽序列为中国仓鼠血清白蛋白序列中的信号肽，其氨基酸序列如下：mkwvtfllllfvsdsafs。

本发明还提供制备新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）用含有上述新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的基因的重组表达载体转化宿主细胞；

（2）培养宿主细胞，诱导新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的表达；

（3）回收并纯化所表达的新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd。

本发明还提供了上述核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.6所示的基因在制备新冠病毒疫苗方面的应用。运用基因工程手段产业化生产新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd蛋白，并配以合适的药学佐剂，将其应用于新型冠状病毒疫苗中。

本发明的有益效果：

本发明通过优化野生型新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的基因序列，并结合筛选确定了相对最佳序列，优化后序列产生的克隆表达效率比野生型新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd序列提高了约6倍，比单纯的中国仓鼠密码子偏性优化序列克隆表达效率提高了4倍。本发明的新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd可诱导小鼠产生高滴度病毒中和抗体。本发明的新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的基因可用于新型冠状病毒疫苗的生产中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示4种序列真核表达构建的克隆分泌的蛋白浓度比较情况；

图2为rbdv2纯化样品sds-page图；

图3显示二免14天后小鼠血清抗rbd抗体滴度（rbd糖蛋白）；

图4显示假病毒中和试验结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1优化野生型新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd序列

在野生型新型冠状病毒rbd氨基酸序列的基础上做如下优化，得到初步优化的新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd核苷酸序列：

本发明按照中国仓鼠遗传密码子偏性，对编码序列中编码氨基酸序列的密码子进行优化，共获得3条候选优化序列。

根据密码子的偏爱性、实验室以往的蛋白高效表达经验、mrna二级结构等因素考虑，优化获得seqidno.1：

agagtgcagccaacagagagcatcgtgaggttccccaacatcaccaacctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgcaacaaggttcgccagcgtgtacgcctggaacagaaaaaggatcagcaactgcgtggcagactacagtgtgctgtacaactccgcctccttctccaccttcaaatgctatggcgtgtcccccaccaagctgaacgatctgtgttttaccaacgtgtacgccgactccttcgtgattaggggcgacgaggtgcgccagatcgctcctggacagacaggaaacatcgccgactataactacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgattgcttggaactccaacaacctggacagtaaagtgggcggcaactacaattacctgtacagactgttcaggaagagcaacctgaaacccttcgaaagagacatctccacagagatctaccaggccggcagcaccccatgtaacggagtgaagggatttaactgctacttccccctgcagtcctacggcttccagccaacatacggcgtgggctaccagccttacagggtggtggtgctgtcttttgagctgctgcacgcccccgctacagtgtgtggacctaagaagtccaccaacctggtgaaaaacaaatgtgtcaatttc

优化时考虑了5’端35个氨基酸对应的核苷酸的gc含量，保证其gc含量＞55%，即优化后前105bp中gc含量最终为59.05%；3’端50个氨基酸对应的核苷酸的gc含量，保证其gc含量＞55%，即优化后末尾150bp中gc含量最终为56%。

软件优化序列获得seqidno.2：

agagtgcagccaacagagagcatcgtgcgcttccccaacatcacaaacctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgctaccaggttcgcttccgtgtacgcctggaacaggaagagaatctccaactgcgtggctgactactccgtcctctacaactccgcttccttctcgaccttcaagtgctacggtgtgtcccctaccaagctgaacgacctctgcttcaccaacgtctacgctgactccttcgtgatccgcggcgacgaagtccgtcaaatcgctcctggtcagaccggaaacatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggttgcgtcatcgcttggaactccaacaacctcgacagtaaggtgggtggtaactacaactacctgtaccgcctgttccgcaagagcaacctgaagcccttcgaaagggacatctccaccgagatctaccaggccggctccacaccatgcaacggagtgaagggtttcaactgctacttccccctgcaatcctacggtttccagcccacctacggtgtgggataccagccttaccgcgtggtggtgctctccttcgagctcttgcacgcccctgctaccgtgtgtggtcctaagaagtccaccaacctcgtgaaaaacaaatgtgtcaatttc

软件优化序列获得seqidno.3：

cgtgttcagcctaccgaatctattgttcgttttcctaatattaccaacctgtgtccttttggtgaagtctttaatgctacccgttttgcttcagtttatgcatggaatcgtaaacgtattagtaactgtgttgcagattatagcgttctgtataacagcgccagctttagtacctttaaatgttatggtgtgagtccgactaaactgaatgatctgtgttttaccaatgtttatgcagatagctttgttattcgtggtgatgaagttcgccagattgcaccgggtcagaccggtaatattgccgattataattataaactgccggatgattttaccggttgtgtgattgcctggaattcaaataatctggatagcaaagtgggtggtaattataattatctgtatcgtctgtttcgcaaaagcaatctgaaaccgtttgaacgtgatatttctaccgaaatttatcaggcgggcagcacaccgtgtaatggtgttaaaggttttaactgttattttcctctgcagtcttatggttttcagccgacctatggtgttggttatcagccgtatcgcgttgtggttctgagttttgaactgctgcatgccccggcaacggtttgtggtcctaaaaagtcaaccaatctggttaaaaacaaatgtgtcaatttc

其中，新型冠状病毒南非突变株野生型rbd核苷酸序列如seqidno.4所示：

agagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaatattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttaaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccacttatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttc

本发明进一步在优化型的序列前插入信号肽序列、kozak序列ccacc和酶切位点gctagc，在优化序列末端加入终止密码子taa和酶切位点gcggccgc。

选取宿主细胞特异性高表达血清白蛋白信号肽序列，其核苷酸序列如:seqidno.5：atgaaatgggttactttcttattattattgtttgtatctgattctgctttttca。

含有信号肽的优化后的新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd核苷酸序列如seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8所示：

seqidno.6：

gctagcccaccatgaaatgggttactttcttattattattgtttgtatctgattctgctttttcaagagtgcagccaacagagagcatcgtgaggttccccaacatcaccaacctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgcaacaaggttcgccagcgtgtacgcctggaacagaaaaaggatcagcaactgcgtggcagactacagtgtgctgtacaactccgcctccttctccaccttcaaatgctatggcgtgtcccccaccaagctgaacgatctgtgttttaccaacgtgtacgccgactccttcgtgattaggggcgacgaggtgcgccagatcgctcctggacagacaggaaacatcgccgactataactacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgattgcttggaactccaacaacctggacagtaaagtgggcggcaactacaattacctgtacagactgttcaggaagagcaacctgaaacccttcgaaagagacatctccacagagatctaccaggccggcagcaccccatgtaacggagtgaagggatttaactgctacttccccctgcagtcctacggcttccagccaacatacggcgtgggctaccagccttacagggtggtggtgctgtcttttgagctgctgcacgcccccgctacagtgtgtggacctaagaagtccaccaacctggtgaaaaacaaatgtgtcaatttctaagcggccgc

seqidno.7：

gctagcccaccatgaaatgggttactttcttattattattgtttgtatctgattctgctttttcaagagtgcagccaacagagagcatcgtgcgcttccccaacatcacaaacctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgctaccaggttcgcttccgtgtacgcctggaacaggaagagaatctccaactgcgtggctgactactccgtcctctacaactccgcttccttctcgaccttcaagtgctacggtgtgtcccctaccaagctgaacgacctctgcttcaccaacgtctacgctgactccttcgtgatccgcggcgacgaagtccgtcaaatcgctcctggtcagaccggaaacatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggttgcgtcatcgcttggaactccaacaacctcgacagtaaggtgggtggtaactacaactacctgtaccgcctgttccgcaagagcaacctgaagcccttcgaaagggacatctccaccgagatctaccaggccggctccacaccatgcaacggagtgaagggtttcaactgctacttccccctgcaatcctacggtttccagcccacctacggtgtgggataccagccttaccgcgtggtggtgctctccttcgagctcttgcacgcccctgctaccgtgtgtggtcctaagaagtccaccaacctcgtgaaaaacaaatgtgtcaatttctaagcggccgc

seqidno.8：

gctagcccaccatgaaatgggttactttcttattattattgtttgtatctgattctgctttttcacgtgttcagcctaccgaatctattgttcgttttcctaatattaccaacctgtgtccttttggtgaagtctttaatgctacccgttttgcttcagtttatgcatggaatcgtaaacgtattagtaactgtgttgcagattatagcgttctgtataacagcgccagctttagtacctttaaatgttatggtgtgagtccgactaaactgaatgatctgtgttttaccaatgtttatgcagatagctttgttattcgtggtgatgaagttcgccagattgcaccgggtcagaccggtaatattgccgattataattataaactgccggatgattttaccggttgtgtgattgcctggaattcaaataatctggatagcaaagtgggtggtaattataattatctgtatcgtctgtttcgcaaaagcaatctgaaaccgtttgaacgtgatatttctaccgaaatttatcaggcgggcagcacaccgtgtaatggtgttaaaggttttaactgttattttcctctgcagtcttatggttttcagccgacctatggtgttggttatcagccgtatcgcgttgtggttctgagttttgaactgctgcatgccccggcaacggtttgtggtcctaaaaagtcaaccaatctggttaaaaacaaatgtgtcaatttctaagcggccgc

实施例2重组rbd蛋白的表达与纯化

将seqidno.6所示的完整目的基因进行nhel/notl双酶切，之后连接到经过同样酶切的pcdna3.1+真核表达载体中，得到重组载体；

将重组载体分别转化大肠杆菌，按常规方法进行质粒扩增，之后用天根生物有限公司试剂盒提取质粒。

转染中国仓鼠cho细胞：按照lipofectin试剂盒手册配制，得到dna-脂质体混合物，并加入dmem培养基培养的中国仓鼠cho细胞中，37℃温育2h；换液成含10%fbs的dmem培养基，继续培养48h。

neomycin抗性克隆筛选：把转染后的细胞从培养瓶中分离，按1×105细胞/孔加到96孔板中，以含500μg/mlneomycin的dmem培养基(加10%bsf)继续培养转染后的细胞，经7d后，选取形成克隆的细胞，扩增培养到6孔板。

表达rbd克隆分析：neo抗性克隆经培养后，以1.5×105/ml细胞密度接种到t25培养瓶，在含5%co2培养箱中37℃培养72h，取上清得到rbd蛋白。

以同样的方式构建含信号肽序列的野生型新型冠状病毒b.1.351南非突变株序列、及其优化株seqidno.7、seqidno.8的表达载体，并进行转化、表达。

对获得的上清液进行鉴定，并分析rbd蛋白含量。

通过鉴定野生株序列、及seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8均可表达新型冠状病毒b.1.351南非突变株的rbd蛋白，对上述四种序列真核表达构建的克隆分泌的蛋白浓度比较，结果见表1、图1。

新型冠状病毒b.1.351南非突变株的rbd蛋白的氨基酸序列如seqidno.9所示：

1mkwvtfllllfvsdsafsrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisn

61cvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgniad

121ynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpc

181ngvkgfncyfplqsygfqptygvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvn

241f

成熟的新型冠状病毒b.1.351南非突变株的rbd蛋白的氨基酸序列如seqidno.10所示：

rvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgniadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvkgfncyfplqsygfqptygvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnf

表14种序列真核表达构建的克隆分泌的蛋白浓度比较（μg/ml）

结果如表1所示，seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8表达的蛋白浓度分别为11.43μg/ml、3.8μg/ml、2.43μg/ml，均高于野生型序列所表达的蛋白浓度，同时，seqidno.6表达的蛋白浓度显著高于seqidno.7、seqidno.8所表达的蛋白浓度。

通过10kda膜包对seqidno.6表达蛋白进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kda超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释后，通过离子交换层析进行纯化，备用。如图2所示，纯化获得的rbd蛋白rbdv2分子量在34kd左右，sds-page图显示rbd蛋白条带均一，纯度较好。

实施例3小鼠免疫实验

取20只6～8周龄大的雌性balb/c小鼠，随机分为以下各组：

免疫1组（10μg免疫组）：第0、14天分别肌肉注射100μl疫苗。所用疫苗为10μgrbdv2+100μgal(oh)3，其中，rbdv2即为实施例2制备得到的cho细胞表达的新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd糖蛋白，按100μl体积含有10μgrbd和100μgal(oh)3用生理盐水配伍疫苗。

免疫2组（5μg免疫组）：第0、14天分别肌肉注射100μl疫苗。所用疫苗为5μgrbdv2+100μgal(oh)3，其中，rbdv2即为实施例2制备得到的cho细胞表达的新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd糖蛋白，按100μl体积含有5μgrbdv2和100μgal(oh)3用生理盐水配伍疫苗。

佐剂对照组：第0、14天分别肌肉注射100μl疫苗，所用佐剂为100μgal(oh)3。

生理盐水对照组：第0、14天分别肌肉注射100μl生理盐水。

以上各组均在第28天取血。

用elisa法测各组小鼠血清中抗rbd的抗体滴度。操作步骤参见精编分子生物学实验指南[m].科学出版社,2008.。

结果如图3所示，二免两周10μg免疫组小鼠特异性抗体滴度可达1×10^6.26，5μg免疫组小鼠特异性抗体滴度可达1×10^5.31，而佐剂组为1×10^1.70，生理盐水组为1×10^1.88。免疫组（10μg或者5μg组）的抗体滴度远高于生理盐水对照组或佐剂对照组的抗体滴度。

实施例4假病毒中和试验

按照常规方法进行假病毒中和试验，操作步骤参见“establishmentandvalidationofapseudovirusneutralizationassayforsars-cov-2.emergingmicrobesandinfections，2020，9”文献中所述的方法，假病毒购自北京天坛药物生物技术开发公司，产品号80044。中和抗体在体外与假病毒中和，使得假病毒丧失感染细胞的能力，进入细胞的假病毒会表达fluc蛋白，与发光底物反应后，通过机器检测其发光值，通过与假病毒对照组发光值比较，计算其抑制百分比，通过计算公式可以计算出当假病毒50%被抑制时抗体的稀释倍数，来计算其ed50，用ed50来表示抗体对假病毒中和活性大小。

1)样品准备：实施例3得到的4组小鼠免疫后血清56℃水浴灭活0.5-1小时；

2)将96孔板四周的36个孔中加入260μl高压灭菌水封边，减少因边缘孔培养基蒸发带来的误差；

3)第2列（细胞对照cc）加入dmem完全培养基150μl/孔，第3列（病毒对照vc）列加入dmem完全培养基100μl/孔，在b4-b11孔（即96孔板的第4-11列）中加入培养基142.5μl/孔，其余孔加入培养基100μl/孔，每列6孔；

4)b4-b11孔中加入待测小鼠免疫血清样品（第一孔按1:100加入，倍比稀释。）7.5μl；

5)对b4-b11孔中液体轻柔的反复吹吸6-8次，然后转移50μl液体至对应的c4-c11孔（即96孔板的第c排4-11列），之后所有孔都3倍倍比稀释；

6)用dmem完全培养基将假病毒稀释至1.3×10⁴tcid50/ml，于第3~11列每孔加50μl；

7)将上述96孔板置于细胞培养箱中（37℃，5%co2）孵育1小时；

8)待孵育30min后，开始消化huh7细胞，将细胞浓度稀释至2×10⁵cells/ml；

9)孵育结束后，每孔加入100μl细胞，使每孔细胞为2×10⁴cells；

10)放入37℃，5%co2细胞培养箱中培养24小时；

11)培养完毕后，吸弃150μl上清，加入100μlbright-glotm荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min后，反复吹打，转移150μl液体至白板中；

12)使用perkinelmerensight多功能成像酶标仪读取发光值（rlu）；

计算中和抑制率：

其中，vc-病毒对照vc，cc-细胞对照cc。

中和抗体滴度被表示为抑制率为50%时对应的血清稀释度的倒数或者抑制率为50%时对应的抗体浓度。

阳性判断值：中和实验过程中需要设置阴性对照，阳性对照，作为参照，来判断实验是否成立，阴性对照ed50小于30，阳性ed50大于30作为判断值。

结果如图4所示，二免两周高剂量10μg免疫组小鼠病毒中和抗体滴度可达1×10^2.42，低剂量5μg免疫组小鼠特异性抗体滴度可达1×10^2.19，而佐剂组为1：10，生理盐水组未检测到中和抗体。高剂量10μg免疫组（10μgrbdv2+100μgal(oh)3）和低剂量5μg免疫组（5μgrbdv2+100μgal(oh)3）的病毒中和抗体滴度＞1：100，明显高于剂对照组和生理盐水对照组。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>北京华芢生物技术有限公司

<120>新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的基因及其应用

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>669

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<213>人工序列(artificialsequence)

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