一种Tirzepatide的制备方法与流程

一种tirzepatide的制备方法
技术领域
1.本发明涉及多肽药物制备领域，具体涉及一种tirzepatide的制备方法。


背景技术：

2.糖尿病是一种慢性病症，其特征在于因胰岛素分泌、胰岛素作用或此二者的缺陷所导致的高血糖症。在2型糖尿病中，胰岛素分泌受损及胰岛素抗性的组合效应与血糖升高有关。us9474780b2首次公开报道了tirzepatide，tirzepatide具有葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(gip)和胰高血糖素样肽-1(glp-1)双受体激动的作用，是礼来制药的重磅在研产品，目前正在进行临床三期研究，预计2022年将获批上市。被认为是最有可能给索玛鲁肽带来市场挑战的glp-1类似物降糖药物。其肽序如下：h-tyr
1-aib
2-glu
3-gly
4-thr
5-phe
6-thr
7-ser
8-asp
9-tyr
10-ser
11-ile
12-aib
13-leu
14-asp
15-lys
16-ile
17-ala
18-gln
19-lys
20
(aeea-aeea-γ-glu-eicosanedioic acid)-ala
21-phe
22-val
23-gln
24-trp
25-leu
26-ile
27-ala
28-gly
29-gly
30-pro
31-ser
32-ser
33-gly
34-ala
35-pro
36-pro
37-pro
38-ser
39-nh2。
3.cn107207576a公开了一种固相制备tirzepatide的方法，固相逐步合成39个氨基酸的直链肽，选择性脱除lys
20
侧链保护基alloc，固相偶联侧链修饰基团，裂解得多肽产物，该方法步骤多，周期长，杂质多，纯化难。
4.cn110903355a公开了一种固相制备tirzepatide的方法，同样采用逐步偶联的方法，其中lys
20
侧链的接入选择fmoc-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic acid(mono-tbu))-oh，1-4位氨基酸的接入选择4肽片段boc-tyr(tbu)-aib-glu(tbu)-gly-oh，裂解得多肽产物，该法虽然选择了部分片段偶联的方式，但仍不可避免相关缺失肽和消旋肽杂质的生成。
5.现有技术固相合成tirzepatide过程中，由于tirzepatide氨基酸的个数较多，且序列中含有大量疏水性氨基酸，偶联过程中易于形成分子内氢键，产生严重的β折叠，引起树脂缩聚，若进行逐步偶联，会增加氨基酸偶联的难度，降低偶联的效率，导致缩聚之后的每一步偶联都举步维艰，容易产生大量缺失肽；若进行片段偶联，只有选取合适的片段以及片段的组合才能抑制或减少缺失肽、消旋肽等杂质的产生，提高粗肽的纯度及收率。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明为解决现有技术中tirzepatide合成时易于形成分子内氢键，产生严重的β折叠，引起树脂缩聚，产生大量缺失肽的问题，提供了一种tirzepatide的制备方法，主要包括以下步骤：
7.(1)固相多肽合成法制备tirzepatide异肽树脂，其中，tirzepatide异肽树脂中thr或ser以式(1)结构存在，
[0008][0009]
其中，r1是h或ch3；
[0010]
r2是氨基保护基；
[0011]
(2)将步骤(1)得到的tirzepatide异肽树脂裂解，得到tirzepatide异肽；
[0012]
(3)将步骤(2)得到的tirzepatide异肽在中性或碱性水溶液中搅拌，得到tirzepatide。
[0013]
上述制备方法中，20位赖氨酸采用fmoc-lys(alloc)-oh或fmoc-lys[aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosaned(mon-tbu)]-oh进行偶联。赖氨酸采用fmoc-lys(alloc)-oh时，tirzepatide主链异肽树脂选择性脱除alloc保护基后，经侧链修饰得到tirzepatide异肽树脂，裂解后得到tirzepatide异肽；赖氨酸采用lys[aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosaned(mon-tbu)]-oh时，可直接合成得到tirzepatide异肽树脂，裂解后得到tirzepatide异肽。
[0014]
上述制备方法中，除了异肽片段以外的其他氨基酸之间的偶联可以采用片段偶联或者逐步偶联的方式进行。在一些实施方案中，采用二肽、三肽或五肽片段的方式进行；在一些实施方案中，只采用逐步偶联的方式进行。
[0015]
如无特殊说明，本文中所提到的“异肽”，均指将tirzepatide肽序中的thr或ser残基侧链上的羟基进行异构化形成酯键的结构，即thr或ser以式(1)结构存在。如“异肽片段”是指thr或ser以式(1)结构存在的肽片段；“tirzepatide异肽树脂”是指thr或ser以式(1)结构存在的tirzepatide肽树脂；“tirzepatide主链异肽树脂”是指thr或ser以式(1)结构存在的tirzepatide主链肽树脂。
[0016]
作为优选，所述步骤(1)中以式(1)结构存在的thr或ser选自thr5、thr7、ser8、ser
11
、ser
32
、ser
33
、ser
39
中的一个或多个。在一些实施方案中，tirzepatide异肽树脂中以式(1)结构存在的thr或ser个数是一个；在一些实施方案中，tirzepatide异肽树脂中以式(1)结构存在的thr或ser个数是两个或者两个以上，且式(1)中氨基保护基r2可以相同，也可以不同。
[0017]
更为优选，所述步骤(1)中以式(1)结构存在的thr或ser选自ser
11
、ser
32
、ser
33
中的一个或多个。
[0018]
进一步优选，所述以式(1)结构存在的thr或ser是ser
11
和ser
32
。
[0019]
进一步优选，所述以式(1)结构存在的thr或ser是ser
32
。
[0020]
作为优选，所述步骤(1)式(1)中r2选自cbz、dde、alloc、boc、moz、trt、dmb、mmt、mtt。
[0021]
更为优选，所述式(1)中r2选自boc、moz。
[0022]
作为优选，所述步骤(3)中中性或碱性水溶液ph是7-11。
[0023]
更为优选，所述中性或碱性水溶液ph是7-9。
[0024]
tirzepatide异肽树脂经裂解后在中性或碱性水溶液中，可发生o
→
n迁移反应，最终得到tirzepatide。机理如下：
[0025][0026]
以式(1)结构存在的异肽片段具有极佳的溶解性，当其作为偶联组分用于多肽合成时，能够有效破坏肽链的分子内氢键，使其形成“无序卷曲”状态，从而减轻β折叠，减轻树脂缩聚，极大改善了疏水氨基酸的偶联效果，最终减少缺失肽的产生，提高了目标产物的收率与纯度。
[0027]
现有技术中，将thr或ser残基侧链上的羟基异构化成酯主要有液相法和固相法，具体如下：
[0028]
1.液相法：将保护的氨基酸与1h-苯并三唑反应得到酰基苯并三唑中间体，再将该中间体与保护的ser/thr在diea-乙腈体系中反应，得到异肽片段，最后将异肽片段用于主链肽缩合。2.固相法：可以分为以下两种方式：(1)将保护的ser/thr与树脂偶联，利用酯缩合条件将ser/thr的侧链羟基与保护的氨基酸反应获得异肽片段树脂，异肽片段树脂裂解后得到异肽片段，最后将异肽片段用于主链肽缩合；(2)将保护的ser/thr通过酯缩合条件直接在主链肽树脂上构建获得异肽结构，形成主链异肽树脂。一些实施方案中，异肽片段的合成采用液相法；一些实施方案中，异肽片段的合成采用固相法。
[0029]
将上述制备得到的tirzepatide粗品经进一步纯化和冻干，得到tirzepatide纯品。
[0030]
固相合成tirzepatide过程中，由于tirzepatide氨基酸的个数较多，且序列中含有大量疏水性氨基酸，易于形成分子内氢键，产生严重的β折叠，引起树脂缩聚，逐步偶联时，会增加氨基酸偶联的难度，降低偶联的效率，导致缩聚之后的每一步偶联都举步维艰，容易产生大量缺失肽。而本发明利用式(1)结构制备tirzepatide，由于以式(1)结构存在的异肽片段具有极佳的溶解性，当其作为偶联组分用于多肽合成时，能够有效破坏肽链的分子内氢键，使其形成“无序卷曲”状态，从而减轻β折叠，减轻树脂缩聚，极大改善了疏水氨基酸的偶联效果，最终减少缺失肽的产生，提高了目标产物的收率与纯度，是一种适合tirzepatide大规模生产的制备方法。
附图说明
[0031]
图1为boc-ser[o(fmoc-pro)]-oh异肽片段的合成反应流程图；
[0032]
图2为moz-ser{o[fmoc-ser(otbu)]}-oh异肽片段的合成反应流程图；
[0033]
图3为boc-ser{o[fmoc-tyr(otbu)]}-oh异肽片段的合成反应流程图；
[0034]
图4为alloc-ser{o[fmoc-thr(otbu)]}-oh异肽片段的合成反应流程图；
[0035]
图5为boc-thr{o[fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly]}-oh异肽片段的合成反应流程图；
[0036]
图6为boc-thr[o-(fmoc-phe)]-oh异肽片段的合成反应流程图。
具体实施方式
[0037]
本发明公开了一种tirzepatide的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。
[0038]
在本发明具体实施方式中，所有偶联有保护基的氨基酸均可通过市售获得，制备tirzepatide过程中偶联有保护基的氨基酸见表1。本发明涉及的英文缩写对应的中文名称如表2所示。
[0039]
表1制备tirzepatide过程中偶联有保护基的氨基酸
[0040][0041]
表2本发明涉及的英文缩写对应的中文名称
[0042]
[0043][0044]
本发明提供的tirzepatide的合成方法中所用试剂均可通过市售获得。
[0045]
根据下述实施例，对本发明技术方案进行进一步详细描述。
[0046]
实施例1 tirzepatide的制备1
[0047]
(1)boc-ser[o(fmoc-pro)]-oh异肽片段的合成
[0048]
称取47.6g bth溶于600ml dcm中，室温下缓缓滴入14.3g socl2，滴加完毕后得到澄清透明溶液。将33.7g fmoc-pro-oh分批加入其中，期间不断产生大量白色固体。加料完毕后室温继续反应2.5h，抽滤收集滤液，滤饼以etoac洗涤3次，有机相合并后减压浓缩至干。所得固体重新溶于600ml etoac中，以饱和na2co3溶液洗涤3次，无水mgso4干燥，蒸除溶剂后得到43.8g fmoc-pro-bt中间体，产率100％。
[0049]
称取8.76g fmoc-pro-bt，与4.10g boc-ser-oh混合溶于200ml乙腈中，加入7.74g diea，室温搅拌反应12h。反应结束后加入1mol/lhcl酸化，减压蒸除溶剂。将残余物重新溶于300ml etoac中，以1mol/l hcl洗涤，无水mgso4干燥后减压蒸除溶剂，残余物经柱层析纯化，得boc-ser[o(fmoc-pro)]-oh异肽片段8.80g，产率84.0％。图1为boc-ser[o(fmoc-pro)]-oh异肽片段的合成反应流程图。
[0050]
(2)tirzepatide异肽树脂的制备
[0051]
称取5.00g rink amide mbha树脂(sd＝0.46mmol/g，总替代度2.30mmol)，加入到固相反应器中，用dmf溶胀后抽干。加入50ml 20％哌啶-dmf溶液反应15min脱除fmoc保护，抽干，dmf洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
[0052]
称取6.9mmol fmoc-ser(otbu)-oh，1.12g hobt，溶于50ml dmf中，冰浴下加入0.96g dic，活化5min，将活化后的反应液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，dmf洗涤6次，得到fmoc-ser(otbu)-rink mbha树脂。
[0053]
将上述步骤得到的fmoc-ser(otbu)-rink mbha树脂于固相反应器中，dmf溶胀洗涤，20％哌啶/dmf溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，dmf洗涤6次，茚三酮检测阳性。称取fmoc-pro-oh(2.33g，6.9mmol)和hobt(1.12g，8.3mmol)溶于50ml dmf，冰浴下加入dic(1.05g，8.3mmol)，活化5min。将活化后的反应液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，dmf洗涤6次。
[0054]
重复上述脱保护、缩合步骤继续偶联fmoc-pro-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，步骤(1)制得的boc-ser[o(fmoc-pro)]-oh，fmoc-gly-gly-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-lys(aeea-aeea-γglu-eicosanedioic tbu ester)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh。反应完后，脱除fmoc保护，dmf和dcm分别洗涤3次，干燥得到tirzepatide异肽树脂
asp(otbu)-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh。反应完后，脱除fmoc保护，dmf和dcm分别洗涤3次，干燥得到tirzepatide异肽树脂21.12g。
[0068]
(3)tirzepatide异肽的制备
[0069]
将步骤(2)制得的tirzepatide异肽树脂加入到220ml冷冻裂解试剂92.5％tfa/2.5％tis/2.5％h2o/2.5％mpr(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2l冰冻乙醚，析出白色沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤3次，真空干燥得tirzepatide异肽13.32g。
[0070]
(4)tirzepatide的制备
[0071]
将步骤(3)制得的tirzepatide异肽溶于666ml pbs溶液中(ph＝7.6)，使终浓度为20mg/ml，室温搅拌使其重排成目标tirzepatide，hplc监测反应进程，约12h后反应完成，所得产物经rp-hplc纯化，收集主峰后浓缩冻干，得3.96g产物，纯度99.0％，总产率31.65％。
[0072]
实施例3 tirzepatide的制备3
[0073]
(1)moz-ser[o(fmoc-pro)]-oh异肽片段的合成
[0074]
称取47.6g bth溶于600ml dcm中，室温下缓缓滴入14.3g socl2，滴加完毕后得到澄清透明溶液。将33.7g fmoc-pro-oh分批加入其中，期间不断产生大量白色固体。加料完毕后室温继续反应2.5h，抽滤收集滤液，滤饼以etoac洗涤3次，有机相合并后减压浓缩至干。所得固体重新溶于600ml etoac中，以饱和na2co3溶液洗涤3次，无水mgso4干燥，蒸除溶剂后得到43.8g fmoc-pro-bt中间体，产率100％。
[0075]
称取8.76g fmoc-pro-bt，与5.38g moz-ser-oh混合溶于200ml乙腈中，加入7.74g diea，室温搅拌反应12h。反应结束后加入1mol/l hcl酸化，减压蒸除溶剂。将残余物重新溶于300ml etoac中，以1mol/l hcl洗涤，无水mgso4干燥后减压蒸除溶剂，残余物经柱层析纯化，得moz-ser[o(fmoc-pro)]-oh异肽片段9.77g，产率75.4％。合成反应流程图与图1相似。
[0076]
(2)boc-ser{o[fmoc-tyr(otbu)]}-oh的合成
[0077]
称取45.9g fmoc-tyr(otbu)-oh溶于600ml dcm中，冰浴下分批加入20.6g dcc，低温搅拌10min后加入14.3g(120mmol)bth，继续搅拌30min，随后移至室温反应12h。反应结束后抽滤除去沉淀，滤饼以etoac洗涤3次，有机相合并后减压浓缩至干。所得固体重新溶于600mletoac中，以饱和na2co3溶液洗涤3次，无水mgso4干燥，蒸除溶剂后得到53.7g fmoc-tyr(otbu)-bt中间体，产率95.9％。
[0078]
称取11.20g fmoc-tyr(otbu)-bt，与4.10g boc-ser-oh混合溶于200ml乙腈中，加入7.74g diea，室温搅拌反应12h。反应结束后加入1mol/l hcl酸化，减压蒸除溶剂。将残余物重新溶于300ml etoac中，以1mol/l hcl洗涤，无水mgso4干燥后残余物经柱层析纯化，得boc-ser{o[fmoc-tyr(otbu)]}-oh异肽片段10.61g，产率82.04％。图3为boc-ser{o[fmoc-tyr(otbu)]}-oh异肽片段的合成反应流程图。
[0079]
(3)tirzepatide异肽树脂的制备
[0080]
称取10.00g rink amide mbha树脂(sd＝0.52mmol/g，总替代度5.20mmol)，加入到固相反应器中，用dmf溶胀后抽干。加入100ml 20％哌啶-dmf溶液反应15min脱除fmoc保护，抽干，dmf洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
[0081]
称取15.6mmol fmoc-ser(otbu)-oh，2.52g hobt，溶于120ml dmf中，冰浴下加入2.16g dic，活化5min，将活化后的反应液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测呈阴
性，抽干，dmf洗涤6次，得到fmoc-ser(otbu)-rink mbha树脂。
[0082]
将上述步骤得到的fmoc-ser(otbu)-rink mbha树脂于固相反应器中，dmf溶胀洗涤，20％哌啶/dmf溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，dmf洗涤6次，茚三酮检测阳性。称取fmoc-pro-oh(5.26g，15.6mmol)和hobt(2.53g，18.7mmol)溶于100ml dmf，冰浴下加入dic(2.36g，18.7mmol)，活化5min。将活化后的反应液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，dmf洗涤6次。
[0083]
重复上述脱保护、缩合步骤继续偶联fmoc-pro-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，步骤(1)制得的moz-ser[o(fmoc-pro)]-oh，fmoc-gly-gly-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-lys(aeea-aeea-γglu-eicosanedioic tbu ester)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-ile-oh，步骤(2)制得的boc-ser{o[fmoc-tyr(otbu)]}-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh。反应完后，脱除fmoc保护，dmf和dcm分别洗涤3次，干燥得到tirzepatide异肽树脂40.41g。
[0084]
(4)tirzepatide异肽的制备
[0085]
将步骤(3)制得的tirzepatide异肽树脂加入到390ml冷冻裂解试剂92.5％tfa/2.5％tis/2.5％h2o/2.5％mpr(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2l冰冻乙醚，析出白色沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤3次，真空干燥得tirzepatide异肽27.11g。
[0086]
(5)tirzepatide的制备
[0087]
将步骤(4)制得的tirzepatide异肽溶于1355ml pbs溶液中(ph＝8.0)，使终浓度为20mg/ml，室温搅拌使其重排成目标tirzepatide，hplc监测反应进程，约12h后反应完成，所得产物经rp-hplc纯化，收集主峰后浓缩冻干，得7.86g产物，纯度99.4％，总产率31.41％。
[0088]
实施例4 tirzepatide的制备4
[0089]
(1)alloc-ser{o[fmoc-thr(otbu)]}-oh片段的合成
[0090]
称取39.7g fmoc-thr(otbu)-oh溶于600ml dcm中，冰浴下分批加入20.6g dcc，低温搅拌10min后加入14.3g(120mmol)bth，继续搅拌30min，随后移至室温反应12h。反应结束后抽滤除去沉淀，滤饼以etoac洗涤3次，有机相合并后减压浓缩至干。所得固体重新溶于600mletoac中，以饱和na2co3溶液洗涤3次，无水mgso4干燥，蒸除溶剂后得到47.4g fmoc-thr(otbu)-bt中间体，产率95.2％。
[0091]
称取10.00g fmoc-thr(otbu)-bt，与3.78g alloc-ser-oh混合溶于200ml乙腈中，加入7.74g diea，室温搅拌反应12h。反应结束后加入1mol/l hcl酸化，减压蒸除溶剂。将残余物重新溶于300ml etoac中，以1mol/l hcl洗涤，无水mgso4干燥后减压蒸除溶剂。残余物经柱层析纯化，得alloc-ser{o[fmoc-thr(otbu)]}-oh异肽片段8.06g，产率71.0％。图4为alloc-ser{o[fmoc-thr(otbu)]}-oh异肽片段的合成反应流程图。
[0092]
(2)tirzepatide异肽树脂的制备
[0093]
称取10.00g ramaga mbha树脂(sd＝0.4mmol/g，总替代度4.0mmol)，加入到固相
反应器中，用dmf溶胀后抽干。加入100ml 20％哌啶-dmf溶液反应15min脱除fmoc保护，抽干，dmf洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
[0094]
称取12.0mmol fmoc-ser(otbu)-oh，1.94g hobt，溶于100ml dmf中，冰浴下加入1.81g dic，活化5min，将活化后的反应液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，dmf洗涤6次，得到fmoc-ser(otbu)-rink mbha树脂。
[0095]
将上述步骤得到的fmoc-ser(otbu)-rink mbha树脂置于固相反应器中，dmf溶胀洗涤，20％哌啶/dmf溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，dmf洗涤6次，茚三酮检测阳性。称取fmoc-pro-oh(4.04g，12mmol)和hobt(1.94g，14.4mmol)溶于100ml dmf，冰浴下加入dic(1.81g，14.4mmol)，活化5min。将活化后的反应液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，dmf洗涤6次。
[0096]
重复上述步骤继续偶联fmoc-pro-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，实施例1步骤(1)制得的boc-ser[o(fmoc-pro)]-oh，fmoc-gly-gly-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-lys(aeea-aeea-γglu-eicosanedioic tbu ester)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，步骤(1)制得的alloc-ser{o[fmoc-thr(otbu)]}-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh。反应完后，称取4mmol pd(pph3)4和400mmol苯硅烷溶于300ml dcm中，加入至树脂中，室温下搅拌2h，反应结束后，抽干，dmf洗涤3次后脱除n端fmoc保护基，得到tirzepatide异肽树脂34.77g。
[0097]
(3)tirzepatide异肽的制备
[0098]
将步骤(2)制得的tirzepatide异肽树脂加入到350ml冷冻裂解试剂92.5％tfa/2.5％tis/2.5％h2o/2.5％mpr(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2l冰冻乙醚，析出白色沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤3次，真空干燥得tirzepatide异肽20.06g。
[0099]
(4)tirzepatide的制备
[0100]
将步骤(3)制得的tirzepatide异肽溶于1003ml pbs缓冲溶液中(ph＝7.4)，使终浓度为20mg/ml，室温搅拌使其重排成目标tirzepatide，hplc监测反应进程，约12h后反应完成，所得产物经rp-hplc纯化，收集主峰后浓缩冻干，得5.66g产物，纯度99.2％，总产率29.40％。
[0101]
实施例5 tirzepatide的制备5
[0102]
(1)boc-thr{o[fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly]}-oh片段的合成
[0103]
1.1boc-thr-2-ctc树脂的合成
[0104]
称取2-ctc树脂30g(sd＝1.17mmol/g，总替代度35.1mmol)，加入到固相反应器中，用dmf溶胀后抽干。称取boc-thr-oh(13.10g，60mmol)悬浮于300ml dcm中，加入diea(19.35g，150mmol)后，室温溶解，将混合溶液加入至树脂中，室温反应2h。反应结束后加入10ml甲醇，封闭1h，抽干，以dmf和dcm分别洗涤3次，真空干燥，得到boc-thr-2-ctc树脂，重量为35.07g，替代度为0.79mmol/g。
[0105]
1.2boc-thr[o(fmoc-gly)]-2-ctc树脂的合成
[0106]
称取步骤1.1制得的boc-thr-2-ctc树脂(10mmol)12.66g加入到固相反应器中，加入dcm溶胀后抽干。称取8.92g fmoc-gly-oh溶于120ml dcm和10ml dmf的混合溶剂中，冰浴下加入4.54g dic和370mg dmap，搅拌30min后，将反应液加入boc-thr-2-ctc树脂中，室温反应12h。反应完成后抽干，以dmf和dcm分别洗涤3次，真空干燥，得到boc-thr[o(fmoc-gly)]-2-ctc树脂15.46g，产率100％。
[0107]
1.3boc-thr{o[fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly]}-2-ctc树脂的合成
[0108]
将步骤1.2制得的boc-thr[o(fmoc-gly)]-2-ctc树脂置于固相反应器中，加入dmf溶胀后抽干，加入150ml 20％哌啶-dmf溶液反应15min脱除fmoc保护，dmf洗涤6次，按照偶联步骤依次偶联fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh。偶联结束后以dmf和dcm分别洗涤3次，抽干待用。
[0109]
1.4boc-thr{o[fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly]}-oh的合成
[0110]
将步骤1.3制得的boc-thr{o[fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly]}-2-ctc树脂加入200ml的20％tfe/80％dcm(v:v)裂解液中，室温搅拌2h。反应结束后抽滤收集滤液，再以dcm洗涤树脂，滤液合并减压浓缩后得到泡状固体9.67g，产率97.9％。图5为boc-thr{o[fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly]}-oh异肽片段的合成反应流程图。
[0111]
(2)tirzepatide异肽树脂的合成
[0112]
称取10.00g ramaga mbha树脂(sd＝0.40mmol/g，总替代度4.0mmol)，加入到固相反应器中，用dmf溶胀后抽干。加入100ml 20％哌啶-dmf溶液反应15min脱除fmoc保护，抽干，dmf洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
[0113]
称取12.0mmol fmoc-ser(otbu)-oh，2.02g hobt，溶于100ml dmf中，冰浴下加入1.90g dic，活化5min，将活化后的反应液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，dmf洗涤6次，得到fmoc-ser(otbu)-rink mbha树脂。
[0114]
将上述步骤得到的fmoc-ser(otbu)-rink mbha树脂置于固相反应器中，dmf溶胀洗涤，20％哌啶/dmf溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，dmf洗涤6次，茚三酮检测阳性。称取fmoc-pro-oh(4.04g，12mmol)和hobt(1.94g，14.4mmol)溶于100ml dmf，冰浴下加入dic(1.81g，14.4mmol)，活化5min。将活化后的反应液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，dmf洗涤6次。
[0115]
重复上述脱保护、缩合步骤继续偶联fmoc-pro-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，实施例1中步骤(1)制得的boc-ser[o(fmoc-pro)]-oh，fmoc-gly-gly-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-lys(aeea-aeea-γglu-eicosanedioic tbu ester)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-ile-oh，实施例3步骤(2)制得的boc-ser{o[fmoc-tyr(otbu)]}-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-phe-oh，步骤(1)制得的boc-thr{o[fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly]}-oh。反应完后，脱除boc保护，dmf和dcm分别洗涤3次，干燥得到tirzepatide异肽树脂34.88g。
[0116]
(3)tirzepatide异肽的制备
[0117]
将步骤(2)制得的tirzepatide异肽树脂加入到350ml冷冻裂解试剂92.5％tfa/
2.5％tis/2.5％h2o/2.5％mpr(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2l冰冻乙醚，析出白色沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤3次，真空干燥得tirzepatide异肽11.62g。
[0118]
(4)tirzepatide的制备
[0119]
将步骤(3)制得的tirzepatide异肽溶于581ml pbs缓冲溶液中(ph＝7.4)，使终浓度为20mg/ml，室温搅拌使其重排成目标tirzepatide，hplc监测反应进程，12h后反应完成，所得产物经rp-hplc纯化，收集主峰后浓缩冻干，得6.07g产物，纯度99.3％，总产率31.53％。
[0120]
实施例6 tirzepatide的制备6
[0121]
(1)boc-thr[o-(fmoc-phe)]-oh片段的合成
[0122]
称取47.6g bth溶于600ml dcm中，室温下缓缓滴入14.3g socl2，滴加完毕后得到澄清透明溶液。将38.7g fmoc-phe-oh分批加入其中，期间不断产生大量白色固体。加料完毕后室温继续反应2.5h，抽滤收集滤液，滤饼以etoac洗涤3次，有机相合并后减压浓缩至干。所得固体重新溶于600mletoac中，以饱和na2co3溶液洗涤3次，无水mgso4干燥，蒸除溶剂后得到48.8g fmoc-phe-bt中间体，产率100％。
[0123]
称取9.76g fmoc-phe-bt，与4.38g boc-thr-oh混合溶于200ml乙腈中，加入7.74g diea，室温搅拌反应12h。反应结束后加入1mol/l hcl酸化，减压蒸除溶剂。将残余物重新溶于300ml etoac中，以1mol/l hcl洗涤，无水mgso4干燥后残余物经柱层析纯化，得boc-thr[o-(fmoc-phe)]-oh异肽片段9.96g，产率84.6％。图6为boc-thr[o-(fmoc-phe)]-oh异肽片段的合成反应流程图。
[0124]
(2)fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly-thr(otbu)-oh片段的合成
[0125]
2.1fmoc-thr(otbu)-2-ctc树脂的制备
[0126]
称取2-ctc树脂30g(sd＝1.17mmol/g，总替代度35.1mmol)，加入到固相反应器中，用dmf溶胀后抽干。称取fmoc-thr(otbu)-oh(23.86g，60mmol)悬浮于300ml dcm中，加入diea(19.35g，150mmol)后，室温溶解，将混合溶液加入至树脂中，室温反应2h。反应结束后加入10ml甲醇，封闭1h，抽干，以dmf和dcm分别洗涤3次，真空干燥得fmoc-thr(otbu)-2-ctc树脂，重量为40.07g，替代度为0.70mmol/g。
[0127]
2.2fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly-thr(otbu)-2-ctc树脂的制备
[0128]
称取步骤2.1制得的fmoc-thr(otbu)-2-ctc树脂(10mmol)14.29g置于固相反应器中，加入dmf溶胀抽干后，加入150ml 20％哌啶-dmf溶液，室温反应15min脱除fmoc保护，随后以dmf洗涤6次后抽干待用。称取8.92gfmoc-gly-oh和4.86g hobt溶于100ml dmf中，冰浴下加入4.54g dic，活化30min后将反应液加入树脂中，室温反应2h。反应完成后茚三酮检验呈阴性，抽干，树脂以dmf洗涤6次，进入下一个偶联循环，依次偶联fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh，反应完成后，抽干，以dmf和dcm分别洗涤3次，真空干燥，得到fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly-thr(otbu)-2-ctc树脂23.37g，产率100％。
[0129]
2.3fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly-thr(otbu)片段的制备
[0130]
将步骤2.2制得fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly-thr(otbu)-2-ctc树脂加至200ml的20％tfe/80％dcm(v:v)裂解液中，室温搅拌2h。反应结束后抽滤收集滤液，再以dcm洗涤树脂，滤液合并减压浓缩后得到fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly-thr(otbu)，重量为9.02g，产率99.3％。。
[0131]
(3)tirzepatide异肽树脂的制备
[0132]
称取10.00g rink amide mbha树脂(sd＝0.52mmol/g，总替代度5.20mmol)，加入到固相反应器中，用dmf溶胀后抽干。加入100ml 20％哌啶-dmf溶液反应15min脱除fmoc保护，抽干，dmf洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
[0133]
称取15.6mmol实施例1步骤(1)制得的boc-ser[o(fmoc-pro)]-oh，2.52g hobt，溶于120ml dmf中，冰浴下加入2.16g dic，活化5min，将活化后的反应液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，dmf洗涤6次，得到boc-ser[o(fmoc-pro)]-rink mbha树脂。
[0134]
将上述步骤得到的boc-ser[o(fmoc-pro)]-rink mbha树脂置于固相反应器中，dmf溶胀洗涤，20％哌啶/dmf溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，dmf洗涤6次，茚三酮检测阳性。称取fmoc-pro-oh(5.26g，15.6mmol)和hobt(2.52g，18.7mmol)溶于10ml dmf，冰浴下加入dic(2.36g，18.7mmol)，活化5min。将活化后的反应液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，dmf洗涤6次。
[0135]
重复上述脱保护、缩合步骤继续偶联fmoc-pro-pro-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，实施例2步骤(1)制得的boc-ser{o[fmoc-ser(otbu)]}-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-gly-gly-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-lys(alloc)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，步骤(1)制得的boc-thr[o-(fmoc-phe)]-oh、步骤(2)制得的fmoc-tyr(otbu)-aib-glu(otbu)-gly-thr(otbu)-oh。反应完后，称取5mmol pd(pph3)4和500mmol苯硅烷溶于300ml dcm中，加入至树脂中，室温下搅拌2h，反应结束后抽滤得到tirzepatide主链肽树脂，dmf洗涤3次。称取8.94g tbuo-ste-glu(aeea-aeea-oh)-otbu(10.4mmol)与1.68g hobt(12.5mmol)混合溶于100ml dmf中，溶解后低温冷却30min，加入1.57g dic(12.5mmol)，低温活化10min，将活化液加入至上述tirzepatide主链肽树脂中反应2h，茚三酮检测阴性，抽干，dmf洗涤3次后脱除n端fmoc保护基，得到tirzepatide异肽树脂42.34g。
[0136]
(4)tirzepatide异肽的制备
[0137]
将步骤(3)制得的tirzepatide异肽树脂加入到390ml冷冻裂解试剂92.5％tfa/2.5％tis/2.5％h2o/2.5％mpr(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2l冰冻乙醚，析出白色沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤3次，真空干燥得tirzepatide异肽27.16g。
[0138]
(5)tirzepatide的制备
[0139]
将步骤(4)制得的tirzepatide异肽溶于1358ml gly-naoh缓冲溶液(ph＝9.0)中，使终浓度为20mg/ml，室温搅拌使其重排成目标tirzepatide，hplc监测反应进程，12h后反应完成，所得产物经rp-hplc纯化，收集主峰后浓缩冻干，得7.86g产物，纯度99.5％，总产率31.41％。
[0140]
实施例7 tirzepatide的制备7
[0141]
(1)boc-ser-rink amide mbha树脂的制备
[0142]
称取5.00g rink amide mbha树脂(sd＝0.46mmol/g，总替代度2.30mmol)，加入到固相反应器中，用dmf溶胀后抽干。加入50ml 20％哌啶-dmf溶液反应15min脱除fmoc保护，
抽干，dmf洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
[0143]
称取6.9mmol boc-ser-oh，1.12g hobt，溶于50ml dmf中，冰浴下加入0.96g dic，活化5min，将活化后的反应液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，dmf洗涤6次，得到boc-ser-rink mbha树脂。
[0144]
(2)boc-ser[o(fmoc-pro)]-rink amide mbha树脂的制备。
[0145]
将步骤(1)得到的boc-ser-rink mbha树脂于固相反应器中，dcm溶胀洗涤三次。称取fmoc-pro-oh(2.33g，6.9mmol)溶于40ml dcm和10ml dmf混合溶剂中，冰浴下加入dic(1.05g，8.3mmol)，活化5min。将活化后的反应液加入到固相反应器中，加入催化量dmap(84mg，0.69mmol)，室温反应12h，抽干，dmf和dcm各洗涤三次，真空干燥后得boc-ser[o(fmoc-pro)]-rink amide mbha树脂6.17g，测得替代度为0.37mmol/g。
[0146]
(3)tirzepatide异肽树脂的制备
[0147]
将步骤(2)得到的boc-ser[o(fmoc-pro)]-rink mbha树脂置于固相反应器中，dmf溶胀洗涤，20％哌啶/dmf溶液(v/v)脱保护两次，第一次5min，第二次15min，dmf洗涤6次，茚三酮检测阳性。称取fmoc-pro-oh(5.26g，15.6mmol)和hobt(2.52g，18.7mmol)溶于10ml dmf，冰浴下加入dic(2.36g，18.7mmol)，活化5min。将活化后的反应液加入到固相反应器中，反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，dmf洗涤6次。
[0148]
重复上述脱保护、缩合步骤继续偶联fmoc-pro-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-lys(aeea-aeea-γglu-eicosanedioic tbu ester)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh。反应完后，脱除fmoc保护，dmf和dcm分别洗涤3次，干燥得到tirzepatide异肽树脂19.14g。
[0149]
(4)tirzepatide异肽的制备
[0150]
将步骤(3)制得的tirzepatide异肽树脂加入到190ml冷冻裂解试剂92.5％tfa/2.5％tis/2.5％h2o/2.5％mpr(v/v)中，反应2h。过滤，滤液浓缩，加入2l冰冻乙醚，析出白色沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤3次，真空干燥得tirzepatide异肽11.24g。
[0151]
(5)tirzepatide的制备
[0152]
将步骤(4)制得的tirzepatide异肽溶于562ml gly-naoh缓冲溶液中(ph＝11.0)，使终浓度为20mg/ml，室温搅拌使其重排成目标tirzepatide，hplc监测反应进程，约12h后反应完成，所得产物经rp-hplc纯化，收集主峰后浓缩冻干，得3.16g产物，纯度99.2％，总产率28.54％。