用于检测EBV-miRNA-BART10-3P的引物、试剂盒及检测方法

本发明属于医学和生物
技术领域：
，具体涉及一种用于检测ebv-mirna-bart10-3p的引物、试剂盒及检测方法。
背景技术：
：鼻咽癌(nsopharyngealcarcinoma，npc)指发生于鼻咽粘膜上皮的恶性肿瘤。鼻咽癌发病率男性比女性高，男女比为2：1～10：1,易发病年龄段在30～50岁之间。鼻咽癌发病率如此之高，可早期诊断率却非常低，因为鼻咽癌的发病常常不易发觉，75％的患者首次就诊时已经是晚期，其中60％的患者为局部晚期，15％的患者为晚期并发生转移。鼻咽癌患者中，就诊时仅是一期的患者，30年前占5％，近30年来鼻咽癌的治疗效果提高了两倍，可一期鼻咽癌的诊断率仍然只有5％。因此鼻咽癌早期诊断是争取最佳治疗效果的关键。目前，鼻咽癌的早期诊断的手段有鼻咽镜及病理学检查，影像学检查以及血清学检查等。鼻咽镜检查是鼻咽癌早期诊断的重要手段，结果比较直观可靠，但这种侵入性的检查手段并不被大多数患者容易接受，而且尽管组织病理检查是诊断鼻咽癌的金标准，但不适于作为常规的筛查手段；影像学检查，一般都是无创的，病人都能接受，是诊断肿瘤的重要辅助手段，但是对于肿瘤尤其是原位癌或者癌前病变的早期诊断价值尚待评估。许多鼻咽癌患者的血清中含有较高的eb病毒的抗体滴度。鼻咽癌患者血清中的vca-iga和ea-iga抗体滴度可以被用来辅助诊断判断鼻咽癌和大致判断病人的预后，eb病毒早期抗原(ea-iga)提示病毒进入复制阶段，其特异性较高，但灵敏度较差；vca-iga是病毒的衣壳抗原，提示病毒大量复制，虽然有较好的敏感性，但特异性很差。eb病毒游离dna的检测，灵敏度较高，但是需要指出的是，eb病毒抗体阳性，只能说明感染过eb病毒，离早期诊断鼻咽癌还相去甚远，况且，ebv的人群感染率超过90％。因此，基于eb病毒的血清学检查可以有效的评估鼻咽癌的发病风险但仍旧不是鼻咽癌早期诊断的有效手段。因此，发展一种新的有效特异的,敏感度高的鼻咽癌的早期诊断方法显得尤为重要和迫切，可以为鼻咽癌的小核酸分子诊断提供严格的可供参考的临床诊断和筛查标准，为鼻咽癌小核酸诊断试剂盒的开发奠定理论及规范基础。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于检测ebv-mirna-bart10-3p的引物、试剂盒及检测方法。本发明所采取的技术方案是：本发明的第一个方面，提供一种引物，所述引物用于检测mirna-bart10-3p，所述引物的核苷酸序列为：上游引物：cgggctacataaccatggagtt(seqidno：1)；下游引物：atccagtgcagggtccgagg(seqidno：2)。本发明的第二个方面，提供一种检测试剂，含有本发明第一个方面所述的引物。本发明的第三个方面，提供一种试剂盒，含有本发明第二个方面所述的检测试剂。在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包含可检测标记物。在本发明的一些实施方式中，所述可检测标记物为探针或荧光染料。在本发明的一些优选实施方式中，所述可检测标记物为荧光染料。在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包含反转录引物，所述反转录引物的核苷酸序列为：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacagcc(seqidno：3)。通用的茎环结构，自身形成的茎环结构不仅能够有效地延长mirna的逆转录产物长度，同时它自身互补的构象可以避免与其他同源基因结合，减少了非特异性扩增的几率。本发明第一方面所述引物或本发明第二方面所述检测试剂或本发明第三方面所述试剂盒在检测mirna-bart10-3p中的应用。在本发明的一些实施方式中，所述mirna-bart10-3p为ebv编码的mirna-bart10-3p。本发明第一方面所述引物或本发明第二方面所述检测试剂或本发明第三方面所述试剂盒在制备鼻咽癌辅助诊断试剂中的应用。本发明还提供一种检测mirna-bart10-3p的方法，包含以下步骤：(1)提取待测样品中的总rna，逆转录成cdna；(2)以步骤(1)的dna为模板，利用本发明第一方面所述引物或本发明第二方面所述检测试剂或本发明第三方面所述试剂盒行微滴数字pcr检测。在本发明的一些实施方式中，步骤(2)所述微滴数字pcr扩增的条件为：50℃2min；95℃30min；95℃30s，62℃1min，45个循环；98℃10min。在本发明的一些实施方式中，步骤(2)所述微滴数字pcr扩增中升降温速率1.0℃/s。在本发明的一些实施方式中，步骤(2)所述微滴数字pcr的反应体系为：微滴式数字pcr用荧光染料法反应预混液10μl，上游引物和下游引物各0.5μl，模板5μl，水4μl。在本发明的一些实施方式中，所述mirna-bart10-3p为ebv编码的mirna-bart10-3p。在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述提取待测样品的rna具体为提取待测样品的外泌体中的rna。在本发明的一些实施方式中，所述待测样品为血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁或腹水。本发明的有益效果是：本发明设计筛选得到了用于检测外泌体中的mirna-bart10-3p的引物组，并且进一步的优化了引物浓度，找到了最适的反应体系，以提高数字pcr的扩增效率，本发明还提供了具有高灵敏度、特异性、准确度并且可以实现精确定量的微滴式数字pcr试剂盒，可直接定量，操作简便，结果可靠。对于对于鼻咽癌的早期预防、诊断都具有积极的指导意义和应用价值。本发明还提供了一种mirna-bart10-3p的特异性反转录引物。mirna茎环法逆转录无需增加mirna的长度，因此可以使用常规的mrna逆转录试剂盒，将大大的减少试剂的成本。而且通用的茎环结构，自身形成的茎环结构不仅能够有效地延长mirna的逆转录产物长度，同时它自身互补的构象可以避免与其他同源基因结合，减少了非特异性扩增的几率。可以更加经济高效特异的检测外泌体中的ebvmirna。附图说明图1为鼻咽癌与慢性鼻咽炎组织mirna表达微整列热图。图2为临床外周血血浆外泌体中的ebv病毒编码的mirna的表达谱。其中hp健康人对照(ebv-)，hp-ebv健康人对照(ebv+)，npc鼻咽癌患者。图3为ebv阴性的健康志愿者血浆外泌体中ebv-mir-bart-10-3p的表达水平。图4为ebv阳性的健康志愿者血浆外泌体中ebv-mir-bart-10-3p的表达水平。图5为鼻咽癌患者血浆外泌体中ebv-mir-bart-10-3p的表达水平。具体实施方式以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。材料、试剂及仪器：仪器名称厂家型号旋涡振荡仪海门市其林贝尔vortex-5移液枪rainin手掌离心机新庄医疗器械xk-400基因扩增仪东胜龙二代pcr仪etc811数字pcr样本制备仪永诺生物microdrop-100a数字pcr生物芯片阅读仪永诺生物microdrop-100b试剂名称供应商编号微滴式数字pcr用evagreen反应预混液永诺生物s0200020302样本制备通用试剂盒永诺生物s0100010101实施例1申请人此前与美国国立卫生研究院(nih)临床研究中心开展了一项前期研究。利用nih的in-house高通量mirna芯片对20对广东中山的鼻咽癌标本和非癌鼻咽上皮组织(慢性鼻咽炎)标本进行mirna差异表达谱分析比较，结果如图1所示，发现了7个eb病毒编码的bart-mirna(ebv-mir-bart1，3，5，7，8，9，10)和4个人宿主mirna(mir-651，205，660，581)在鼻咽癌中呈高度表达，在非癌鼻咽上皮组织中几乎不表达；这一结果初步提示这些在鼻咽癌与非癌组织之间的mirna的表达高度差异，完全有可能作为鼻咽癌的一种分子标记。然而，组织水平的mirna表达的检测给临床常规检测带来了极大的困难和不便。因此，外周血循环中能够找到特异的mirna标记物进行检测将更加具有应用前景。外泌体(exosomes)是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜，直径大约为30-150nm。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体，同时外泌体也广泛存在于体液中，包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水等。目前研究发现外泌体中富含核酸(microrna、lncrna、circrna、mrna、trna等)、蛋白、胆固醇等。外泌体的表面marker主要有cd63、cd81、cd9、tsg101、hsp27等。因此，血浆中的外泌体将有希望为提供特异性更高的更有诊断价值的分子标记。因此，进一步收集了临床体检ebvdna阴性的健康人和ebvdna阳性的健康人血浆各15例，鼻咽癌患者的血浆15例，分离血浆外泌体，并提取rna，进行了高通量的rna-seq，结果如图2所示，发现在鼻咽癌患者的血浆外泌体中存在ebv-mir-bart-10-3p(核酸序列为：uacauaaccauggaguuggcugu(seqidno：4))的特异性的高度富集。实施例2为了验证临床血浆样本外泌体中ebv编码的mirna的表达，因此拟利用数字pcr进行检测。为了经济高效特异的pcr扩增检测外泌体中的ebvmirna，选择了mirna的茎环法逆转录及数字pcr。mirna茎环法逆转录无需增加mirna的长度，因此可以使用常规的mirna逆转录试剂盒，将大大的减少试剂的成本。但是需要注意的是，逆转录引物要使用特异的茎环引物，而不能使用随机引物和oligodt引物。通用的茎环结构，自身形成的茎环结构不仅能够有效地延长mirna的逆转录产物长度，同时它自身互补的构象可以避免与其他同源基因结合，减少了非特异性扩增的几率。选取了经典的颈环序列gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgac(seqidno：5)，设计了ebv-mir-bart-10-3p的特异性反转录引物，序列为：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacagcc(seqidno：3)，其中最后六位碱基序列为反转录引物的粘性序列。pcr扩增时，我们设计了上游引物碱基序列为：cgggctacataaccatggagtt(seqidno：1)；下游引物(通用引物)碱基序列为：atccagtgcagggtccgagg(seqidno：2)。利用永诺生物的ddpcr检测平台，进行数字pcr检测。1、rna逆转录成cdna2、数字pcr检测2.1反应体系的配制(荧光染料法)2.2制备微液滴①将微液滴生成芯片置于芯片卡座中，向油相孔加入40μl微液滴生成油，向样本孔中加入20μl已加入样本的pcr反应水相。待油相和水相加入完成后，盖上微液滴生成芯片密封垫，将微液滴生成芯片置于microdrop-100a样本制备仪中进行微液滴生成；②待微液滴生成后，依次小心将生成的微液滴(大约45～55μl)转移至96孔pcr反应板中；③待微液滴转移至96孔pcr反应板后，盖上96孔板可穿刺热封膜，置于预热好的热封仪上进行封膜(封膜机设置：175℃，4秒)；封好膜之后应于30分钟内进行pcr扩增，或者放于4℃冰箱4小时之内进行pcr扩增。2.3pcr扩增(evagreen荧光染料法)将反应板放入pcr扩增仪中进行扩增，按以下程序进行扩增反应。设置热盖温度105℃，样本体积50μl，升降温速率1.0℃/s。2.4微液滴检测和结果分析①pcr扩增完后，将96孔pcr反应板置于microdrop-100b生物芯片阅读仪中进行检测；②打开微滴检测仪，预热30分钟，然后打开电脑，启动quantdrop数据分析软件；③将pcr扩增后的96孔板放入微滴检测仪底座，然后将96孔板压板对齐并扣下两侧的扳手，以固定96孔板；④按下微滴检测仪面板上红色按钮打开微滴检测仪舱门，将板架放入微滴检测仪，按下按钮进行检测；⑤打开quantdrop数据分析软件，设置一个新的检测模块，点击单击“mode”，单击左侧边栏“setup”选项或者双击样本(孔号)后，编辑sample模块包括name、experiment选择“abs”、supermix选择“reagent1”；target1模块name编辑fam，type选择“ch1unknown”；target2模块name编辑vic，type选择“ch1unknown”。设置完成后点击“ok”；⑥模块设置完成后，点击“run”，选择“col”或者“row”进行微滴的检测；然后点击“是”确认运行；⑦检测完成后，打开微滴检测仪取出96孔pcr板；⑧使用quantdrop数据分析软件分析数据结果。检测结果见图3～5，其中图3为ebv阴性的健康志愿者血浆外泌体中ebv-mir-bart-10-3p的表达水平，图4为ebv阳性的健康志愿者血浆外泌体中ebv-mir-bart-10-3p的表达水平，图5为鼻咽癌患者血浆外泌体中ebv-mir-bart-10-3p的表达水平。可以看出，ddpcr扩增结果与二代测序的结果一致，即ebv-mir-bart-10-3p在鼻咽癌患者血浆外泌体中特异性的表达，而在ebv阳性和阴性的健康志愿者血浆外泌体中几乎不表达。上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属
技术领域：
普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。sequencelisting<110>南方医科大学第三附属医院<120>用于检测ebv-mirna-bart10-3p的引物、试剂盒及检测方法<130><160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1cgggctacataaccatggagtt22<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2atccagtgcagggtccgagg20<210>3<211>50<212>dna<213>人工序列<400>3gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacagcc50<210>4<211>23<212>rna<213>ebv-mir-bart-10-3p<400>4uacauaaccauggaguuggcugu23<210>5<211>44<212>dna<213>人工序列<400>5gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgac44当前第1页12