一种与绵羊产羔数相关的SNP遗传标记及其应用

一种与绵羊产羔数相关的snp遗传标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种与绵羊产羔数相关的snp遗传标记及其应用。


背景技术：

2.随着分子生物学和生物信息学的发展，涌现出通过分子标记的方法来进行育种。dna分子标记的优越性：大多数分子标记具有共显性，对隐形性状的选择有利；分子标记的数量几乎是无限的；检测手段简单、迅速等优点。dna分子标记主要有限制性片断长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，rflps)标记、随机扩增多态性dna(randomamplifiedpolymorphicdna，rapds)标记、扩增片断长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphisms，aflps)、简单重复序列(simple sequence repeats，ssr)、单核苷酸多态性标记(singlenucleotidepolymorphism，snp)等。
3.单核苷酸多态性标记(singlenucleotidepolymorphism，snp)是指基于基因组水平上的由单个核苷酸引起的dna序列多态性。snp分型的方法主要有基于电泳的检测方法(pcr
‑
rflp、pcr
‑
sscp、as
‑
pcr)、基于荧光定量pcr的检测方法(taqman探针法、hrm)、直接测序法、其它检测方法(质谱分析、snapshot、ldr)。其中pcr
‑
rflp是snp筛查中最经典的方法之一，利用限制性内切酶作用于dna片段，如果存在snp位点，酶切产物的长度和数量则会出现差异，通过琼脂糖凝胶电泳就可以判断snp位点基因型，该方法检测迅速，价格低廉。
4.绵羊产羔数是重要的经济性状，东弗里升绵羊属于国外典型的高产绵羊品种，具有较高繁殖力。


技术实现要素：

5.本发明要求保护一种与绵羊产羔数相关的snp遗传标记及其应用。
6.第一方面，本发明要求保护一种用于检测绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a还是t还是a和t的物质在如下任一中的应用：
7.(a1)鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数性状；
8.(a2)制备用于鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数性状的产品；
9.(a3)鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数为多羔还是单羔；
10.(a4)制备用于鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数为多羔还是单羔的产品；
11.(a5)鉴定或者辅助鉴定绵羊产羔数多少；
12.(a6)制备用于鉴定或者辅助鉴定绵羊产羔数多少的产品。
13.其中，所述用于检测绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a还是t还是a和t的物质可为引物对或成套引物对或含有所述引物对或所述成套引物对的试剂或试剂盒。
14.所述引物对由上游引物和下游引物组成；所述上游引物可根据所述绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸的上游序列进行设计；所述下游引物可根据所述
绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。
15.在本发明中，所述引物对为引物对a；所述引物对a由seq id no.1所示的上游引物和seq id no.2所示的下游引物组成。
16.在本发明中，所述成套引物对由引物对b和引物对c组成；所述引物对b由seq id no.3所示的上游引物和seq id no.4所示的下游引物组成；所述引物对c由seq id no.5所示的上游引物和seq id no.6所示的下游引物组成。
17.进一步地，所述试剂盒中含有所述成套引物对，还含有限制性内切酶drai。
18.第二方面，本发明要求保护一种鉴定或辅助鉴定待测绵羊产羔数为多羔还是单羔的方法。
19.本发明要求保护的鉴定或辅助鉴定待测绵羊产羔数为多羔还是单羔的方法，可包括如下步骤：
20.(b1)检测待测绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a还是t还是a和t，然后按照如下确定基因型：
21.如果所述待测绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a的纯合体，则所述待测绵羊的基因型为a:a型；
22.如果所述待测绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体，则所述待测绵羊的基因型为t:t型；
23.如果所述待测绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a和t的杂合体，则所述待测绵羊的基因型为a:t型；
24.(b2)按照如下确定所述待测绵羊产羔数为多羔还是单羔：如果所述待测绵羊的基因型为a:a型，则所述待测绵羊的产羔数为或候选为多羔；如果所述待测绵羊的基因型为t:t型或a:t型，则所述待测绵羊的产羔数为或候选为单羔。
25.第三方面，本发明要求保护一种鉴定或辅助鉴定待测绵羊产羔数多少的方法。
26.本发明要求保护的鉴定或辅助鉴定待测绵羊产羔数多少的方法，可包括如下步骤：
27.(c1)检测待测绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a还是t还是a和t，然后按照如下确定基因型：
28.如果所述待测绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a的纯合体，则所述待测绵羊的基因型为a:a型；
29.如果所述待测绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体，则所述待测绵羊的基因型为t:t型；
30.如果所述待测绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a和t的杂合体，则所述待测绵羊的基因型为a:t型；
31.(c2)按照如下确定所述待测绵羊产羔数多少：基因型为a:a型的所述待测绵羊的产羔数多于或候选多于基因型为t:t型或a:t型的所述待测绵羊的产羔数。
32.在步骤(b1)和(c1)中，可按照包括如下任一步骤的方法检测待测绵羊的基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a还是t还是a和t：
33.p1、以所述待测绵羊的基因组dna为模板，采用前文所述成套引物对进行嵌套式pcr扩增，得到扩增产物(即，先以所述待测绵羊的基因组dna为模板采用所述引物对b进行
第一轮pcr扩增，得到第一轮扩增产物；然后以所述第一轮扩增产物为模板采用所述引物对c进行第二轮pcr扩增，得到第二轮扩增产物，即为此处的所述“扩增产物”)；然后用限制性内切酶drai对所述扩增产物进行酶切，根据酶切结果按照如下确定所述待测绵羊的基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a还是t还是a和t：如果酶切产物含有106bp目的条带且不含76bp和30bp目的条带，则所述待测绵羊的基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a；如果酶切产物含有106bp目的条带以及76bp和30bp目的条带，则所述待测绵羊的基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a和t；如果酶切产物不含有106bp目的条带但含76bp和30bp目的条带，则所述待测绵羊的基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是t。
34.p2、以所述待测绵羊的基因组dna为模板，采用前文所述引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；然后将所述扩增产物进行测序，根据测序结果确定所述待测绵羊的基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a还是t还是a和t。
35.第四方面，本发明要求保护具有如下(a)或(b)或(c)所示功能的物质：
36.(a)鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数性状；
37.(b)鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数为多羔还是单羔；
38.(c)鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数多少。
39.本发明要求保护的物质具体为前文所述的用于检测绵羊基因组中2号染色体上第8283097位脱氧核糖核苷酸是a还是t还是a和t的物质。即，为前文所述引物对或前文所述成套引物对或前文所述试剂或前文所述试剂盒。
40.第五方面，本发明要求保护如下任一应用：
41.(d1)前文第三方面所述的物质在鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数性状，或制备用于鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数性状的产品中的应用；
42.(d2)前文第三方面所述的物质在鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数为多羔还是单羔，或制备用于鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数为多羔还是单羔的产品中的应用；
43.(d3)前文第三方面所述的物质在鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数多少，或制备用于鉴定或辅助鉴定绵羊产羔数多少的产品中的应用；
44.(d4)前文第二方面所述方法或前文第三方面所述物质在绵羊育种中的应用。
45.在上述各方面中，所述待测绵羊可选自：东弗里升绵羊、小尾寒羊、湖羊、特克赛尔羊或黑萨福克羊。
46.在上述各方面中，所述多羔均是指产羔率大于等于180％。所述单羔均是指产羔率小于等于100％。
47.在本发明中，绵羊基因组上的物理位置是以ovis aries oar_v3.1版本为参考序列。
48.本发明基于全基因组重测序技术获取36只东弗里升绵羊的基因组信息，个体测序数据覆盖度平均可达7
×
，完成变异信息检出并质控后，采用全基因组关联分析方法筛选与绵羊产羔性状显著相关的snp标记，共筛选到3个达到全基因组建议显著水平阈值的遗传标记，分别为chr2：8283097，t
→
a突变(p＝6.462e
‑
06)、rs413468688，c
→
a突变(p＝2.599e
‑
05)、rs400952839，g
→
a突变(p＝4.945e
‑
05)，其中chr2:8283097是最显著的遗传标记。本发明找到了与绵羊产羔相关的最显著遗传标记chr2：8283097，并建立了该标记一种简便的
检测应用方法，从而提供一种在现实工作中快速、准确选育优良品种的方法。
附图说明
49.图1为东弗里升绵羊血液基因组dna原液吸光度值分布情况。
50.图2为东弗里升绵羊血液基因组dna原液1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。
51.图3为检测出的变异位点在东弗里升绵羊基因组上分布情况。
52.图4为34个绵羊个体的pca分析图。pc1:主成分1；pc2:主成分2。不同图形表示不同的绵羊个体。
53.图5为评价统计模型是否合理的q
‑
q plot图。
54.图6为产羔性状gwas结果的曼哈顿图，注：图中横坐标为绵羊染色体号，27代表x染色体；纵坐标为关联分析并校正后p值的
‑
log10的结果。直线表示5％全基因组显著水平阈值线，虚线表示全染色体显著水平阈值线(全基因组建议显著水平阈值线)。
55.图7为位点chr2:8283097所在序列的pcr产物。片段大小为755bp，不同泳道表示在不同绵羊个体的pcr扩增产物。
56.图8为位点chr2:8283097在高产羊和低产羊中测序所检测到的基因型。
57.图9为位点chr2:8283097基因型分型示意图。
58.图10为位点chr2:8283097遗传标记通过pcr
‑
rflp基因分型案例胶图。图中标记说明：aa基因型，106bp；at基因型，106bp，76bp，30bp；tt基因型，76bp，30bp。
具体实施方式
59.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
60.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
61.实施例1、全基因组关联分析获得绵羊产羔数新snp遗传标记
62.一、表型采集
63.本发明初步关联分析的群体选择北京市顺义奥鑫种羊场的36只纯种东弗里升绵羊，在这个具有连续两年以上产羔记录的群体中，繁殖力性状表型差异较为明显，本发明将产羔率大于或等于180％的记为多羔组(26只)；产羔率小于或等于100％的记为单羔组(10只)。其中，产羔率＝(出生羔羊数/产羔母羊数)
×
100％。
64.二、酚
‑
氯仿法提取动物血液基因组dna
65.1、将新鲜东弗里升绵羊血液混匀后用移液枪吸取800μl于2ml离心管内，加入相同体积的hanks或pbs，12000rpm离心10min，弃上清。
66.2、向上述离心管内加入800μl红细胞裂解液，涡旋振荡器上震荡使其充分混匀(管底没有沉淀，且没有大血块)。
67.3、向上述各管中加入800μl白细胞裂解液、30μl蛋白酶k，用移液枪混匀。
68.4、将上述溶液放置恒温水浴锅中，56℃恒温放置过夜。
69.5、将上述溶液取出后放置常温，分别加入600μl tris
‑
饱和酚，颠倒混匀10min，4℃，12000rpm离心10min。
70.6、将上述溶液上清液吸至新的2ml离心管内，注意不要吸到中间或者底层，可以少吸一点，后面取上清时同理。加入600μl体积比为1:1的酚/氯仿溶液，上下振摇混匀10min。10000rpm离心10min，吸取上层溶液约500μl左右，置于新的1.5ml离心管内。
71.7、重复步骤6并吸取上清。
72.8、加入等体积体积比为25:24:1的酚/氯仿/异戊醇混合液，颠倒混匀10min，4℃，12000rpm，离心10min，取上层水相至1.5ml的离心管。
73.9、加入2倍体积的预冷无水乙醇，慢慢旋转离心管直至出现肉眼可见的白色絮状沉淀。此时可提前于金属浴加热去核酸酶水到65℃。
74.10、将上述溶液，4℃，12000rpm，离心10min，弃上清液(直接倒)，获得沉淀。使用预冷的75％乙醇清洗1
‑
2次，13000rpm，离心10min，去上清液，如有残余液体则用移液枪吸出。置于超净台，最大风量放置5min。
75.11、检查酒精是否晾干，若晾干则从超净台取出，每管分别加入30μl预热的去核酸酶水，轻轻吹打使沉淀溶解，混匀后，使用微型核酸浓度测量仪检测浓度。
76.12、1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用maker 1。
77.采用酚
‑
氯仿法从36只东弗里升绵羊血液中提取基因组dna，测定dna原液浓度、吸光度值(a260/a230、a260/a280)，大部分样本浓度平均达到500ng/μl，从图1可见吸光度值大部分均在高水平范围内。取200ng dna与10
×
loading buffer混合后于1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果见图2，从图中可以看出各泳道条带位置、亮度一致，表明均一化效果较好，条带清晰无拖尾。结果表明提取的dna未发生降解，样品基本符合全基因组重测序建库及后续常规pcr等实验要求。
78.三、全基因组重测序
79.将提取的高质量dna送北京安诺优达公司进行建库，基于illumina hiseq2000测序平台对36只东弗里升绵羊完成全基因组重测序，有效测序深度平均可达到7
×
，每个个体平均可得到103,168,030个高质量的reads，q30平均可达90.79％，测序数据总量及测序质量满足下一步分析的基本要求。详情见表1。
80.表1、测序数据质量情况(列出部分)
81.样本编号rawreadscleanreadsrateofcleanreadscleanq30baserate178109,487,002106,937,69697.67％90.82％290107,839,054106,134,00098.42％90.97％300108,527,066106,369,79698.01％90.71％242108,591,370106,083,46897.69％89.85％b039104,569,300102,368,52097.89％90.45％
82.注：q30指测序碱基正确识别率为99.9％以上的碱基数占总碱基数的百分比。
83.四、snp变异检测
84.snp变异检测前需对下机测序文件进行质控，过滤条件如下：(1)剔除测序无法识别的碱基数高于10％的reads；(2)去除接头污染的reads；(3)剔除碱基质量低于40％的reads；(4)去除冗余。上述过程使用seqprep完成read的接头去除、合并、去冗余，使用
sickle软件剔除低质量reads，得到的clean data可用于下一步的变异检测。
85.1、bwa软件比对
86.bwa软件主要用于基因组数据的比对，能将二代测序所得reads回拼到参考基因组(ovis aries oar_v3.1)，完成比对。在比对前需对绵羊参考基因组建立索引，因绵羊基因组约3gb左右大小，本发明使用bwa v0.7.15版本的
‑
abwtsw参数建立索引后，使用默认参数完成比对。此处需要注意，最新版本的变异检测软件无法识别没有头文件的序列比对文件，需在此添加头文件，本发明使用picard
‑
tools v1.119的addorreadgroups工具来完成。
87.2、初步比对所得文件重新排序
88.查看上述比对所得sam文件可以发现，文件排序是随机的，而非按照chr1，chr2，chr3
…
染色体的顺序排列，这将导致后面用于变异检测的工具无法识别比对结果，因此需要对比对结果重新排序。本发明使用picard
‑
tools v1.119版本的sortsam.jar、reordersam.jar工具完成重排序。
89.3、比对文件压缩后再次排序
90.sam文件占资源较大，需转换为它的二进制bam文件。此过程使用sam tools v1.3.1完成。之后使用picard
‑
tools v1.119版本的sortsam.jar工具将bam文件按照同一染色体对应的条目以及坐标从小到大的顺序进行排序，到这里基本完成了对clean data的比对工作。
91.4、冗余剔除
92.原始数据质控时的去冗余，剔除的只是完全一致的序列，不能区分建库过程pcr过度扩增产生的冗余。这些测序冗余会和物种自身的reads一起比对到参考基因组的相同位置，导致该位置的测序深度统计结果不准确，基于冗余序列检测出的变异不具有生物学意义，导致变异检测可靠性降低。所以需要尽可能的剔除这些无关重复，本研究使用picard
‑
tools v1.119版本的markduplicates工具来完成去冗余。
93.5、插入/缺失区域二次比对
94.此过程将对indels(插入/缺失)区域进行局部二次比对，降低全局比对因这些特殊序列导致的错误率。执行全局比对时，indel区域附近会出现大量的碱基错配，若该区域获得足够多的reads回拼，加之比对软件不能同时罗列多条reads与参考基因组比对来实现纠错，这就导致错配的碱基会被误判为变异位点。本发明使用gatk v3.6.0版本realignertargetcreator工具寻找需要二次比对的区域，使用indelrealigner工具完成二次比对。
95.6、变异检测
96.正式开始变异检测之前，使用gatk的bqsr(碱基质量分数校正)完成校正，之后采用gatk工具包中的genotypegvcfs过程，分别对每个个体单独进行变异检测之后，再合并变异文件完成最后的检测。
97.7、变异检测结果的过滤
98.硬过滤(varianthard
‑
filiter)直接对变异检测位点的源质量分数进行过滤。本发明由于样本量低于40，故而采用硬过滤法，设置参数为:(
‑
filterexpression“qd<2.0”|
‑
filterexpression“fs<60.0”|
‑
filterexpression“mq<40.0”|
‑
filte rexpression“mqranksum<12.5”|
‑
filterexpression“readposranksum<8.0”|)。至此，遗传变异检测完
成。
99.经bwa比对后，本发明使用gatk进行突变位点基因型分型，在36个个体中初步检测到20,169,142个snp位点，约2,800,000个indels。由于gwas主要针对snp变异，所以将变异文件中的snps信息单独提出进行下一步过滤。使用ucsc(http://genome.ucsc.edu/)提供的variantannotationintegrator工具将检测到的变异位点在绵羊染色体上进行可视化，结果见图3，从图中可以看出，变异位点基本完全覆盖绵羊基因组，有利于进行后续的全基因组关联分析。
100.五、变异数据质控
101.上述检测到的高质量snps并非所有都满足后续分析的要求，需要对这些snps做进一步过滤。使用plink软件在群体水平过滤上述snp位点，2个个体由于基因型分型率小于70％被剔除；19,423,030个snp由于call rate值低于85％而被排除；463,601个snp因最小等位基因频率(maf)未达到标准被剔除，在本发明群体中maf最小值为1/72，按照经验值设置阈值为0.01；0个snp由于显著偏离哈代
‑
温伯格平衡(p<10
‑6)而被过滤掉，最终获得34个个体在282,511个snp位点上的高质量基因型分型数据。
102.六、群体主成分分析
103.为消除非因果连锁不平衡对个体间遗传相关估计的偏差，本发明选用常染色体上独立的snps，进行主成分分析。通过vcftools软件将检出的变异文件转化成plink二进制文件，然后使用gcta程序挑选位于常染色体上的变异信息进行主成分分析，得到pc1、pc2、pc3各自的分组信息。将这些信息读入r中则可完成结果的可视化，结果如图4所示。34个个体分别用不同的几何图形表示，从图中可见并未出现明显的聚集块，表明群体遗传背景相对较为均一，基本不存在群体分层现象，这可能由于试验用关联群体大部分来源于较小的同一个地区，遗传背景很接近。有利于进行后续的全基因组关联分析。
104.七、变异位点
‑
产羔性状间的全基因组关联分析
105.本试验根据绵羊产羔性状的特点做单因素case
‑
control设计，分别使用卡方检验和logistic模型对变异位点和绵羊产羔性状进行gwas。将变异检测文件转换为plink软件可识别的格式，然后运用plinkv1.9.0的logistic模型进行绵羊产羔性状的全基因组关联分析。
106.首先对分析结果进行q
‑
qplot(图5)展示来评价统计模型是否合理。如图所示，图中大部分散点均位于45
°
对角线上(期望值)，但总的来说受限于样本量和可代入模型计算的变量较少，观测值还是偏低于期望值，模型构建大致符合要求。另外考虑到绵羊产羔性状本身的特点决定其表型趋势更接近二项分布，而非正态分布，因此q
‑
qplot结果只能作为参考。q
‑
qplot结果一方面表明确实不存在群体分层(期望值与观测值基本拟合)，另一方面也可看出，在本试验中很少有观测值高于期望值的点，即达到全基因组显著相关水平的点很少。
107.在分析模型构建合理的基础上，本发明对gwas结果用曼哈顿图进行更直观的展示，见图6。
108.为降低重复检验的假阳性率，使用连锁不平衡修正的bonferroni校正法对全基因组关联分析所得p值进行校正(进行全基因组ld分块修正多重检验次数)，修正后实际相当于162819个独立的snps用于gwas，据此得到bonferroni校正的达5％全基因组显著水平的p
值为3.07e
‑
6，全染色体水平(全基因组建议显著水平)显著的p值为6.14e
‑
5。从图6中可以发现，达到全基因组显著水平的snps总共为0个；达到全基因组建议显著水平的snps共3个(详见表2)。图6显示，达到全基因组建议显著水平(p<6.14e
‑
5)的snps包括：2个位于绵羊2号染色体的snps，1个位于16号染色体的snp。其中chr2：8283097是绵羊产羔相关的最显著遗传标记。
109.表2、产羔数bonferroni校正的全基因组建议显著水平的snps位点信息
110.标记染色体染色体上位置*基因型最近基因p
‑
adjust2:828309728283097t/atnc6.462e
‑
06rs413468688274430325c/akdm4c2.599e
‑
05rs4009528391610136771g/anaip4.945e
‑
05
111.注：*位置参考ovis aries oar_v3.1版本。
112.实施例2、遗传标记扩群验证并做关联分析
113.以上述关联分析试验所得显著遗传标记为基础，使用primer6.0软件设计引物在20只东弗里升绵羊，31只小尾寒羊、16只湖羊为代表的高产(经验证产羔率大于等于180％)绵羊品种以及24只特克赛尔羊、17只黑萨福克羊为代表的低产(经验证产羔率小于等于100％)绵羊品种中扩增最显著遗传标记chr2：8283097所在序列并进行sanger测序完成基因型分型，分析其遗传指标并做基于列联表的卡方检验来分析与产羔性状的相关性。
114.一、样本dna提取
115.参照天根血液基因组提取试剂盒提供的操作说明书。
116.二、引物设计
117.本发明根据待检测遗传标记chr2：8283097在绵羊基因组上的位置选取包含该位点的1000bp序列进行引物设计。引物序列列于表3，引物由北京金唯智公司和上海生物工程有限公司合成。使用ddh2o稀释到10μm，于
‑
20℃保存。
118.表3、突变位点测序引物的序列
[0119][0120]
三、pcr扩增并测序
[0121]
以上述提取的各个绵羊品种的dna为模板，分别以表3中引物进行pcr扩增，凝胶电泳结果显示条带大小正确后送北京金唯智公司测序。
[0122]
pcr扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为25μl，其各种成分分别为：dna模板1μl，10μmol/l引物各0.75μl，2mmol/l dntp 2.5μl，kod
‑
plus
‑
neo 0.5μl，10
×
pcr buffer 2.5μl，25mmol/l mgso
4 1.5μl，用灭菌去离子水补齐至25μl。
[0123]
pcr反应程序为：94℃预变性2min，98℃变性10s，退火30s，68℃延伸35s(35个循环)，最后68℃延伸5min。
[0124]
(1)位点chr2:8283097所在序列pcr扩增结果
[0125]
取1μl pcr产物用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳结果如图7所示，产物条带清楚，没有引物二聚体的存在，特异性良好，对目标片段进行切胶回收后送公司测序。
[0126]
(2)pcr扩增产物测序结果
[0127]
使用snapgene软件查看chr2:8283097位点附近的碱基序列和峰图，结果显示该位点在东弗里升绵羊、小尾寒羊以及湖羊高产绵羊群体和特克赛尔羊和黑萨福克羊低产绵羊群体中检测到了三种基因型(野生纯合t/t，杂合a/t和突变纯合a/a)，结果如图8所示，红色倒三角处为标记所在位置。
[0128]
四、位点chr2:8283097群体遗传学分析
[0129]
以东弗里升绵羊、小尾寒羊和湖羊为代表的高产羊(产羔率大于等于180％)和以特克赛尔羊和黑萨福克羊为代表的低产羊(产羔率小于等于100％)中检测全基因组关联分析所得潜在显著相关的遗传标记chr2:8283097，统计该位点在上述群体中的频率和基因型分型的频率。结果如表4所示。
[0130]
表4、chr2:8283097在高产及低产绵羊品种中的等位基因频率和基因型频率
[0131][0132]
注：括号中为样本数。
[0133]
上述结果首先验证了前期基于重测序数据的变异位点基因型分型的准确性，在不同羊种中都测到最显著变异位点chr2:8283097的频率，该位点所在序列的碱基标签图如图9所示。位点chr2:8283097在群体中的等位变异为t(野生型)和a(突变型)，表4显示，t(野生型)在所检测的高产群体中频率为0.149，在检测的低产群体中频率为0.610；a(突变型)在检测的高产群体中的频率为0.851，在检测的低产群体中的频率为0.390。设计高产
‑
低产与个体基因型间的单因素case
‑
control试验，基于自由度为1的列联表(表5，表6)进行卡方检验，验证两者是否存在相关关系。检验结果χ2＝27.3，p<0.01(表5)，χ2＝41.3，p<0.01(表6)，结果均极显著，推翻原假设(两者不相关)，即产羔率的高低与个体基因型之间显著相关。群体验证结果再次表明潜在最显著位点chr2:8283097可能为导致性状差异的致因突变或者因与附近功能基因存在连锁不平衡而成为与性状相关联的重要标记。
[0134]
表5、卡方检验分组情况(杂合与突变纯合)
[0135]
分组单羔多羔合计多羔率杂合(+－)2418420.43突变纯合(－－)448520.92合计2866940.70
[0136]
表6、卡方检验分组情况(野生纯合与突变纯合)
[0137][0138][0139]
实施例3、位点chr2:8283097遗传标记多态性检测方法的建立
[0140]
一、扩增位点chr2:8283097片段
[0141]
提取绵羊基因组dna，并且检测其浓度和质量后置于
‑
20℃下保存备用。chr2:8283097位点附近序列如下(seq id no.7)：
[0142]
gtttcatggatatgctgatttgcactgtattttagagtctgcgtataagcgatcagtgtaatactcccagaagagaatactgagcacagttccctgcgctgcacaggaagccattattagttatgtgtacatctcaagcccaatctcccagcgtctctctccatccaccccttctctctgggcagccataagtttgttttctacatctgcaactctatttctgttttgaaaataagctcatttgtaccatttttt(或a)aaaaaatattccacatgtaaaagatatcatatttgtccttcatctgacttacttcactcagtatgacaatctctagatccatccatgttgctgaaaatg
[0143]
根据chr2:8283097位点附近序列设计以下引物对(表7)。
[0144]
表7、扩增位点chr2:8283097序列引物对
[0145][0146]
注：引物对2中下划线处的c是人为设置的错配碱基，这样，若待测绵羊chr2:8283097位点为t，则形成drai识别序列(tttaaa)，若该位点为a则不能形成drai识别序列。
[0147]
将提取好的绵羊基因组，稀释50ng/μl～100ng/μl，取1μl作为模板。扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μl，使用引物对1扩增，其各种成分分别为：dna模板1μl，10μmol/l引物各1μl，easytaqmix(北京全式金生物技术有限公司)25μl，用灭菌去离子水补齐至50μl；pcr反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，62.8℃退火30s，72℃延伸25s(33个循环)，最后72℃延伸7min。
[0148]
将第一步的pcr产物稀释10倍，取1μl作为模板。扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μl，使用引物对2扩增，其各种成分分别为：dna模板1μl，10μmol/l引物各1μl，easytaqmix(北京全式金生物技术有限公司)25μl，用灭菌去离子水补齐至50μl；pcr反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58.2℃退火30s，72℃延伸15s(34个循环)，最后72℃延伸7min。
[0149]
二、drai酶切并电泳检测
[0150]
取上一步pcr产物，配制酶切体系如下：扩增产物4μl，cutsmart 1μl，ddh2o 4.5μl，drai(美国neb公司)0.5μl。37℃水浴30min后，加入2μl loading buffer，通过3％琼脂糖
凝胶进行电泳分析，在凝胶成像系统观察并记录酶切分型结果。当chr2:8283097的位置为都为a时drai不识别该位点，记为aa基因型(106bp)，当突变位点碱基都为t时drai识别该位点，记为tt基因型(76bp+30bp)，当a和t都存在时记为at基因型(106bp+76bp+30bp)。
[0151]
三、位点chr2:8283097遗传标记多态性检测方法实际应用案例
[0152]
通过实施例2中的引物s1扩增包含chr2:8283097位点的目的片段，并将其进行测序，选择其中的aa基因型(湖羊)、at基因型(特克赛尔羊)、tt基因型(特克赛尔羊)绵羊个体基因组进行本实施例中一、二等步骤，结果如图10所示，当chr2:8283097的位点为aa基因型，drai不识别该位点，酶切后仅有106bp大小条带；当该突变位点碱基为tt基因型，drai识别该位点，酶切后有76bp和30bp大小的目的条带；当该突变位点碱基为at基因型，drai识别含t位点，酶切后有106bp、76bp和30bp大小目的条带(由于核酸含量太少，因此at基因型的30bp条带较弱，但不影响分型)。最终结果证明通过使用引物对2和引物对3进行扩增而获得到的目的产物通过drai酶切，可以完成位点chr2:8283097遗传标记的分型。
[0153]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。