一种新型冠状病毒SARS-CoV-2突变体疫苗与应用的制作方法

一种新型冠状病毒sars-cov-2突变体疫苗与应用
技术领域
1.本公开属于生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒sars-cov-2突变体疫苗与应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒(2019-ncov，sars-cov-2)是一种β属的冠状病毒，是目前已知的第七种能感染人的冠状病毒，感染该病毒后可导致患者出现发热、干咳、乏力等症状；部分患者会产生严重的肺炎，进而发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等，甚至死亡。
3.新型冠状病毒由四种结构蛋白(棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白)以及rna 核酸链组成。其中棘突蛋白(spike glycoprotein，s蛋白)是一种糖蛋白，位于新冠病毒膜表面，主要作用于细胞粘附和细胞膜融合。s蛋白由s1和s2两个亚基组成，其中s1亚基中包含受体结合结构域(receptor binding domain,rbd)，其负责识别宿主细胞的受体ace2，是病毒和受体相互作用以及病毒入侵细胞的关键因素，也是疫苗设计的关键靶点。s2亚基含有膜融合过程所需的基本元件，能够促进病毒与宿主细胞膜的融合。
4.新型冠状病毒在不停地突变之中，许多流行的sars-cov-2突变体与病例数迅速增加有关，例如英国突变株b.1.1.7/501y.v1、南非突变株b.1.351/501y.v2，以及巴西突变株 p.1/501y.v3。上述新冠病毒突变体以及可能带有k417n/t、e484k和n501y突变的其他新冠病毒变体，可以降低疫苗诱导的血浆中和抗体的中和能力。
5.目前市售/在研新冠疫苗，大多采用野生型s蛋白或rbd设计，对野生型或早期新冠突变株病御能力较好，但对目前流行的变异株(主要为b.1.351/501y.v2南非突变株)已出现不同程度的保护力下降现象。因此，亟需开发新的针对新型冠状病毒，尤其是突变型新型冠状病毒的疫苗。


技术实现要素：

6.为了避免现有疫苗的局限，本公开提供了一种包含干扰素、新冠抗原和免疫球蛋白fc区的融合蛋白疫苗，所述疫苗能够通过融合表达的ifn提升突变型新冠抗原的免疫原性和中和抗体的滴度，保证高效产生中和抗体，可显著提升对突变株的防御能力。
7.在一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含：
8.(1)干扰素或其功能片段；
9.(2)新型冠状病毒sars-cov-2或其功能片段；和
10.(3)免疫球蛋白fc区。
11.在一方面，本公开提供了一种编码权利要求1-6任一项所述的融合蛋白的核酸。
12.在一方面，本公开提供了一种包含前述核酸的载体。
13.在一方面，本公开提供了一种表达前述融合蛋白、包含前述核酸和/或包含前述载体的宿主细胞。
14.在一方面，本公开提供了一种治疗和/或预防新型冠状病毒sars-cov-2感染或新型冠状病毒疾病covid-19的疫苗，其包含前述融合蛋白、核酸、载体和/或宿主细胞，以及任选地，药学上可接受的载体和/或赋形剂。
15.在一方面，本公开提供了一种前述融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞和/或疫苗在制备预防和/或治疗新型冠状病毒sars-cov-2感染和/或新型冠状病毒疾病covid-19的药物或产品中的应用。
16.在一方面，本公开提供了一种预防和/或治疗新型冠状病毒sars-cov-2感染或冠状病毒疾病covid-19的疫苗的制备方法，所述方法包括表达前述融合蛋白。
17.在一方面，本公开提供了一种预防和/或治疗新型冠状病毒sars-cov-2感染和/或新型冠状病毒疾病covid-19的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞和/或疫苗。
18.在一方面，本公开提供了一种诱导个体中和抗原特异性免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞和/或疫苗。
19.与已知的灭活、腺病毒以及mrna新冠病毒疫苗都不同，本公开的突变株疫苗使用的抗原是针对突变新冠毒株的抗原部分(特别是rbd部分)，并且与增强免疫激活能力的ifn以及 fc结构域形成融合蛋白。本公开为了延长半衰期，采用与fc片段融合的方式，提升了突变株疫苗的半衰期；通过ifn结构域提升新冠突变抗原的免疫原性和中和抗体的滴度，保证高效产生中和抗体；通过变异型rbd增加对突变株的防御能力；采用igg1型fc，下游纯化方法相对简单，利于产业化生产。这种突变株疫苗可在动物体内、人体内诱导更强的免疫应答。所以，本公开的冠突变株融合蛋白疫苗，对比传统单一抗原新冠疫苗，具有更长的半衰期、更高的免疫原性、更强的防御能力。本公开同时开发了适合较蛋白大分子瞬时表达的cho蛋白表达与制备方法，降低了早期制备的难度，同时可保证产品质量符合放大生产标准。综合以上所有创新设计和优化，本公开的突变株疫苗具有长效、有利于工业化生产、活性与普通 ifn相当、更高的免疫原性和中和抗体滴度、可增加对突变株的防御能力，可作为新一代突变株疫苗药物，用于抵御新冠疫情蔓延。
附图说明
20.图1为亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)的分子结构示意图。
21.图2为亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)表达质粒图谱。其中，图2a为亲本株疫苗(v-01)图谱；图2b为英国株疫苗图谱；图2c为南非株疫苗图谱。
22.图3为亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)表达质粒酶鉴定结果。其中，m1：dl15000核酸分子标记；1.亲本株疫苗(v-01)hindiii单酶切；2.亲本株疫苗(v-01) hindiii/paci双酶切；3.英国株疫苗hindiii单酶切；4.英国株疫苗hindiii/paci双酶切；5.南非株疫苗hindiii单酶切；6.南非株疫苗hindiii/paci双酶切；m2.dl15000核酸分子标记。
23.图4为本公开采用瞬转方法与市售方法结果对比。其中，图4a为活细胞密度与细胞活率检测结果；图4b为表达量结果。
24.图5为本公开实施例1所表达亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)表达水平(图5a)与纯化后的电泳检测结果图(图5b)。其中，m1：180kda蛋白标记。
25.图6为基于spr法测定的亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)与ifnr/ace2 体外亲和力图。其中，图6a为亲本株(v-01)与ace2亲和力拟合曲线图；图6b为英国株疫苗与ace2亲和力拟合曲线图；图6c为南非株疫苗与ace2亲和力拟合曲线图；图6d为亲本株(v-01)与ifnar2亲和力拟合曲线图；图6e为英国株疫苗与ifnar2亲和力拟合曲线图；图6f为南非株疫苗与ifnar2亲和力拟合曲线图。
26.图7为基于指示细胞法测定的亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)与 ifnr生物学活性图。
27.图8为亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)小鼠体内效力评估。
28.图9为亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)对于三种假病毒的中和效价评估。其中，图9a为亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)对于三种假病毒的中和效价；图9b为亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)对假病毒的中和效价比较。
具体实施方式
29.i.定义
30.在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
31.如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。
32.如本文使用的和除非另作说明，术语“包含”，“包括”，“具有”，“含有”，包括其语法上的等同形式，通常应当理解为开放式且非限制性的，例如，不排除其他未列举的要素或步骤。
33.术语“融合蛋白”是指由一种或多种分子组成的天然或合成分子，其中具有不同特异性的两种或多种基于肽或蛋白质(包括糖蛋白)的分子任选的通过化学的或基于氨基酸的接头分子融合在一起。该连接可通过c-n融合或n-c融合(以5
′→3′
方向)，优选c-n融合而实现。
34.术语“干扰素”(interferon，ifn)指机体受到病毒感染或在其他干扰素诱生剂作用下，由细胞基因组控制产生的具有抗病毒、抗肿瘤和和免疫调节活性等多种生物学活性的一类细胞因子。干扰素可以根据它们的生物和物理性质分成三大类：i型、ii型和iii型干扰素。
35.i型干扰素构建了在结构上相关的家族(ifn-α(α)、ifn-β(β)、ifn-κ(κ)、ifn-δ(δ)、ifn-ε(ε)、 ifn-τ(τ)、ifn-ω(ω)和ifn-ζ(ζ))，其中ifn-δ和ifn-τ不会在人类中出现。人i型干扰素(ifn) 基因簇集在人染色体9p21上，而小鼠基因位于小鼠4号染色体上的保守的共线性区中。迄今为止，已在小鼠中鉴定出14种ifn-α基因和3种伪基因。在人类中，已经鉴定出13种ifn-α(或 ifna)基因(ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifna10、ifna13、 ifna14、ifna16、ifna17和ifna21)以及1个伪基因，其中两种人ifn-α基因
(ifna1/ifn-α1 和ifna13/ifn-α13)针对相同的蛋白编码。所有的人i型干扰素结合至由两种跨膜蛋白 (ifnar-1和ifnar-2)组成的细胞表面受体(ifnα受体，ifnar)，该细胞表面受体引起 jak-stat活化、isgf3的形成和随后开始的基因表达。干扰素γ(ifn-γ)是唯一已知ii型干扰素，其主要涉及通过巨噬细胞刺激诱导抗菌和抗肿瘤机制。ifn-γ受体(ifngr)是由与两种信号转导ifngr2链相关联的两种配体结合ifngr1链组成的异质二聚体受体。iii型干扰素由三种亚型组成，并且还被称为ifnλ(ifnλ1或il-29、ifnλ2或il-28a和ifnλ3或il-28b)，且具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性。ifn-λ受体也是由唯一的配体结合链ifn-λr1(也被指定为il-28rα)以及与用于il-10相关细胞因子的受体共享的副链il-10r2组成的异质二聚体复合物。
36.术语“冠状病毒(coronavirus)”属于冠状病毒科，冠状病毒属，可以感染哺乳动物和禽类，引起呼吸系统、消化和中枢神经的各种疾病。根据基因组和血清学差异可以将冠状病毒分成四个不同的属：α、β、γ和δ，目前只有α和β属冠状病毒感染人类。截至目前已鉴定出来自两个属(α和β)的6种人冠状病毒(hcov)，α属冠状病毒包括nl63和229e，β属冠状病毒包括oc43、hku1、急性呼吸系统综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒 (mers-cov)和新型冠状肺炎病毒(sars-cov-2)。
37.术语“抗体”或“免疫球蛋白”有最广义的含义，特别包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少2个完整抗体构成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要其显示出具有所需的生物学活性即可。此术语一般包括由2个或多个具有不同结合特异性的抗体或抗体片段连接在一起构成的杂合抗体。
38.术语“fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的c端区，包括天然序列fc区和变体 fc区。尽管免疫球蛋白重链的fc区的边界可以变化，但人igg重链fc区通常定义为自位置 cys226，或自pro230处的氨基酸残基延伸至重链的羧基端。可以除去fc区的c端赖氨酸(依照eu编号系统的残基447)，例如在抗体的产生或纯化期间，或通过重组工程化改造编码抗体重链的核酸。因此，完整抗体的组合物可以包含已除去所有k447残基的抗体群体，未除去任何k447残基的抗体群体，和具有有和无k447残基的抗体混合物的抗体群体。
39.序列“相同性”或“同一性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(carrillo,h.&lipman,d.,siam j applied math 48:1073(1988))。
40.术语“th细胞辅助表位”是指使辅助t细胞活化的所有表位，包括padre。
41.padre为13个氨基酸的短肽序列，能人和多种动物不同dr分子结合，提呈于细胞表面，进而激活cd4+t辅助细胞，发挥免疫调节作用。padre诱导t细胞应答的能力是天然表位的1000倍以上，因此padre具备作为免疫佐剂的一些特征(pmid：7895164)。padre 肽段在体内可以免疫性激活辅助型t细胞(th1)以协助ctl的激活，并且可以激活辅助型t 细胞(th2)以协助b细胞分泌特异性抗体，进而进一步增强重组蛋白所引起的抗原免疫反应。
42.术语“治疗”是指在治疗或改善损伤、疾病、病变或病状方面的任何成功迹象，包括任何客观或主观参数，诸如减轻；缓解；减弱症状或使得损伤、病变或病状更可为患者耐受；减缓变性或衰退速率；使得变性终点的致虚弱性较小；改进患者的身体或精神健康状态。症
状的治疗或改善可基于客观或主观参数；包括身体检查、神经精神病学测验和/或精神病学评估的结果。
43.术语“有效量”是足以实现所陈述目的的量(例如实现它被施用来达成的作用，治疗疾病，降低酶活性，增加酶活性，降低蛋白质功能，减轻疾病或病状的一种或多种症状)。“有效量”的一实例是足以促进对疾病的一种或多种症状的治疗、预防或减轻的量，其也可被称为“治疗有效量”。
44.ii.融合蛋白及疫苗
45.在一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含：
46.(1)干扰素或其功能片段；
47.(2)新型冠状病毒sars-cov-2或其功能片段；和
48.(3)免疫球蛋白fc区。
49.在一些实施方案中，所述融合蛋白从n-末端至c-末端包含：干扰素或其功能片段、 sars-cov-2或其功能片段和免疫球蛋白fc区。
50.在一些实施方案中，所述融合蛋白从n-末端至c-末端包含：sars-cov-2或其功能片段、干扰素或其功能片段和免疫球蛋白fc区。
51.在一些实施方案中，所述干扰素选自i型干扰素、ii型干扰素和/或iii型干扰素。
52.在一些实施方案中，所述干扰素可来自人源或鼠源。
53.在一些实施方案中，所述i型干扰素选自ifn-α、ifn-β、ifn-κ、ifn-δ、ifn-ε、ifn-τ、 ifn-ω和ifn-ζ。
54.在一些实施方案中，所述ii型干扰素为干扰素γ。
55.在一些实施方案中，所述iii型干扰素选自ifn-λ1(il-29)、ifn-λ2(il-28a)和ifn-λ(il-28b)。
56.在一些实施方案中，所述干扰素选自人ifn-α1、ifn-α2、ifn-α4、ifn-α5、ifn-α6、ifn-α7、 ifn-α8、ifn-α10、ifn-α13、ifn-α14、ifn-α16、ifn-α17和ifn-α21。
57.更在一些实施方案中，所述干扰素为ifn-α2a；优选地，所述ifn-α2a的氨基酸序列包含与seq id no 1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述ifn-α-2a的氨基酸序列如seq id no:1所示。
58.在一个实施方案中，ifn活性域优选地与突变型新冠rbd抗原(gly4ser)3接头序列后的 n-端相连接。在本公开中的一个优选方案中，使用了突变的ifn，其与野生型ifn相比，二者仅有一个氨基酸序列有差异，根据该突变ifn的突变位点在genbank(序列号：aap20099.1) 完整干扰素α-2b中的位置，将该突变命名为重组干扰素α-2b(q124r)。该突变的目的是实现人ifnα与异源的小鼠ifn受体的部分结合，从而利用小鼠模型，检测人ifnα的活性和功能。该突变已有文献证实不影响干扰素α-2b与人干扰素受体的亲和力，旨在提升与鼠源干扰素受体的结合活性，有利于小鼠体内进行体内药效评估。再将人源ifn-α2a胞外分泌序列融合于靶向性ifn双功能分子fc片段c-端，且未对其氨基酸序列进行更改。由ifn\新冠rbd结构域与fc的融合蛋白制成的亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)的结构见图 1。通过哺乳动物细胞表达后，融合蛋白会自行组装成二聚体形式。
59.在一些实施方案中，所述sars-cov-2为突变型sars-cov-2。
60.在一些实施方案中，所述突变型sars-cov-2为英国突变株b.1.1.7/501y.v1或南非突变株501y.v2(南非株b.1.351)。尤其针对南非株rbd突变，与野生型新冠毒株相比，含有3 个点突变，分别为k417n/t、e484k、n501y。上述3个点突变，不仅改变了rbd的构象，并且改变了rbd的抗原性，其中e484k已证实可增加突变株的免疫逃逸，n501y可显著增强与ace2的结合力，k417n影响盐桥的产生并增强e484k的逃逸机制。基于以上影响，采用突变株rbd结构域作为递程抗原，可弥补野生型新冠疫苗的不足。
61.在一些实施方案中，所述sars-cov-2的功能片段为其受体结合结构域rbd。
62.在一些实施方案中，所述rbd包含与seq id no 2所示的氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述rbd的氨基酸序列如seq id no:2所示。
63.在一些实施方案中，所述rbd包含与seq id no 3所示的氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述rbd的氨基酸序列如seq id no:3所示。
64.在一些实施方案中，所述免疫球蛋白fc区选自igg1、igg2、igg3和/或igg4的恒定区氨基酸序列。
65.在一些实施方案中，所述免疫球蛋白fc区为igg1的fc区；优选地，所述igg1 fc区包含与seq id no 4所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述igg1 fc区的氨基酸序列如seq id no 4所示。
66.在本公开的一种实施方案中，选用igg1 fc，其中，igg fc具有t250q/m428l突变(氨基酸按照eu命名法编号)，该突变增加了人fcrn亲和力，可延长体内半衰期。
67.在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含一个或多个th细胞辅助表位和/或连接片段。
68.在一些实施方案中，所述th细胞辅助表位为padre或其衍生物；所述padre或其衍生物的氨基酸序列选自seq id no 5、seq id no 6、seq id no 7、seq id no 8、seq id no9和seq id no 10。
69.在一些实施方案中，所述连接片段为柔多肽序列；优选地，所述柔性肽的氨基酸序列选自seq id no 11和seq id no 12。
70.接头连接序列可以是(gly4ser)x或(glyser)x接头的2-8个重复序列，具体长度依据实际融合蛋白分子大小而定，并且需考虑其空间位阻之间的差异而定。本公开所采用的接头连接序列为(gly4ser)3接头，序列信息如下：
71.glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser(seq id no 11)
72.glyser glyser glyser(seq id no 12)
73.在一些实施方案中，所述融合蛋白包含与选自seq id no 13、seq id no 14和seq idno 15所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列选自seq id no 13、seq id no 14和
seq idno 15所示的氨基酸序列；更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为seq id no 14或seq idno 15；更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为seq id no 15。
74.在一方面，本公开提供了一种编码前述融合蛋白的核酸。
75.在一些实施方案中，所述核酸包含选自与seq id no:16、seq id no:17和seq id no: 18所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；优选地，所述核酸选自seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18所示的核酸；更优选地，所述核酸为seq id no:17或seq id no:18所示的核酸；更优选地，所述核酸为seqid no:18所示的核酸。
76.在一方面，本公开提供了一种前述核酸的载体。
77.在一方面，本公开提供了一种表达前述融合蛋白、包含前述核酸和/或包含前述载体的宿主细胞。
78.在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
79.在一些实施方案中，所述原核细胞是细菌细胞。在一些具体实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
80.在一些实施方案中，所述真核细胞选自酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞选自cho、hek293、sp2/0、bhk、c127等。在一些具体实施方案中，所述真核细胞为cho细胞。
81.在一方面，本公开提供了一种治疗和/或预防新型冠状病毒sars-cov-2感染或新型冠状病毒疾病covid-19的疫苗，其包含前述融合蛋白、核酸、载体和/或宿主细胞，以及任选地，药学上可接受的载体和/或赋形剂。
82.所述药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。
83.在一些实施方案中，所述的疫苗形式为重组蛋白亚单位疫苗、重组蛋白mrna疫苗或重组蛋白腺病毒载体疫苗。
84.在一些实施方案中，可以将所述的疫苗制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂、冻干粉剂；优选地为注射剂。
85.在一方面，本公开提供了一种预防和/或治疗新型冠状病毒sars-cov-2感染或冠状病毒疾病covid-19的疫苗的制备方法，所述方法包括表达前述融合蛋白。
86.iii.治疗方法
87.在一方面，本公开提供了一种前述融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞和/或疫苗在制备预防和/或治疗新型冠状病毒sars-cov-2感染和/或新型冠状病毒疾病covid-19的药物或产品中的用途。
88.在一方面，本公开提供了一种预防和/或治疗新型冠状病毒sars-cov-2感染和/或新型冠状病毒疾病covid-19的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞和/或疫苗。
89.在一方面，本公开提供了一种诱导个体中和抗原特异性免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞和/或疫苗。
90.在一些实施方案中，所述疫苗通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射或静脉注射的方式进行接种。
91.在一些实施方案中，所述疫苗通过注射进行施用。
92.为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本公开的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。
93.实施例
94.实施例1：融合蛋白的制备
95.1.1表达质粒构建
96.突变株疫苗是ifn\新冠rbd结构域与fc的融合蛋白。其包含通过遗传学方式，将ifn的 c-端经柔性(gly4ser)3接头与rbd-fc融合(图1)。为了对比活性功能，同时构建突变株疫苗(南非株、英国株)与亲本株疫苗(v-01)，区别在于rbd抗原不同的点突变。本公开涉及的所有基因都是通过全基因合成，然后通过双酶切连接到哺乳细胞表达载体pcgs3(购自：sigma
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aldrich)进行表达。图2示出了亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)图谱。图3示出了酶切鉴定电泳图结果，酶切鉴定正确。用omega的去内毒质粒大提试剂盒(货号： d6926-03b；购自omega bio-tek)提取质粒，-80℃保存。
97.其中，亲本株疫苗(v-01)的氨基酸序列如seq id no 13所示，其编码核酸序列如seq idno 16所示；英国株疫苗的氨基酸序列如seq id no 14所示，其编码核酸序列如seq id no 17 所示；南非株疫苗的氨基酸序列如seq id no 15所示，其编码核酸序列如seq id no 18所示。
98.1.2蛋白质表达
99.对于亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)的表达，本公开采用expicho 表达系统对蛋白进行表达，其用生物反应器放大了表达规模(15l)，即采用大体积瞬时转染的方案进行表达，从而对市售的expicho表达系统进行了改进。
100.(1)在转染之前24小时，调整expi-cho细胞的密度至1.5
×
10
6-3
×
106个细胞/ml，打入15l 规模生物反应器并培养过夜。控制参数设定与后期200l或以上规模的反应器一致，可使表达产物的质量与商业化规模尽可能一致。
101.(2)转染前1小时，测定活细胞密度和活率，活细胞密度应该达到6
×
10
6-10
×
106个细胞 /ml，细胞活率应为不低于95％。
102.(3)先用opti-mem分别稀释表达质粒和转染试剂，质粒稀释液需过滤除菌，再将稀释后的转染试剂慢慢滴加至质粒中，混和均匀，室温孵育5分钟。然后将该混合物匀速加入至细胞培养物中。市售方法为手动倒入添加，按照市售expicho表达系统(购自：lifetechnologies，货号：a29133)操作说明书进行，反应规模为1l摇瓶生产。本公开转染混合物制备，采用市售说明书相同比例进行配置。混合物制备完成后，本公开采用生物反应器补液装置匀速添加。生物反应器控制在37℃，5％co2，ph7.0，溶氧40％，转速150rpm，空气深层恒通20ml/min的培养参数条件下进行培养。
103.(4)转染24小时后，降温至31℃，并添加适量的丁酸钠；转染后第一、三、五天，分别添加5％的补料(feed)，糖浓度控制在3-6g/l范围。
104.(5)转染后细胞活率低于80％，或第6天，收集上清液进行蛋白定量与下一步纯化。
105.按照上述所示步骤，使用亲本株疫苗(v-01)表达载体进行了转染混合物的制备后，采用市售手动直接添加与本公开反应器补液装置添加的方式，分别进行了瞬时转染。表达培养过程中细胞活率与活细胞密度的变化趋势相当，始终能保持较高的细胞活率与细胞密度(图 4a)。本公开采用的生物反应器添加模式下，亲本株疫苗(v-01)表达量显著提升，对比传统市售模式可提升产量近2倍以上(图4b)。本公开提供的生物反应器瞬时表达，生产细胞能持续保持较高活率与表达产率，相比传统市售转染工艺，可显著提升瞬转表达量。本公开采用的瞬时表达系统适合于较大分子的瞬时表达生产，减少了早期样品制备的难度。通过生物反应器精密控制反应条件，基本与后期商业化规模生产控制一致，使瞬转产物质量更具代表性。
106.通过本公开提供的大体积瞬时表达系统，对亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)进行了瞬转表达。采用相同表达工艺、相同信号肽与表达载体条件下，亲本株疫苗表达量最高，随后依次为英国株疫苗与南非株疫苗(图5a)，表达量差异可能为不同点突变所致，尤其南非株疫苗增加了k417t与e484k突变，表达水平下降明显。
107.1.3蛋白纯化
108.亲和层析捕获
109.细胞培养液经澄清后的样品直接上protein a亲和层析柱进行捕获，获得纯化的融合蛋白。经还原sds-page检定分析，结果如图5b所示，亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)纯度均大于95％。
110.实施例2：亲和力测定
111.使用分子相互作用仪(spr法)对亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株) 的亲和力进行检测，包括rbd结构域与ace2受体的亲和力、以及ifnα结构域对ifnar2受体的亲和力。具体如下：
112.2.1与ace2亲和力测定
113.研究方法：使用hbs-ep+(货号br100826，购自ge healthcare)作为实验缓冲液，每个循环包括捕获不同疫苗、不同浓度ace2蛋白的进样及再生。将实施例1制备的突变株(南非、英国)、亲本株(v-01)疫苗分别稀释至1μg/ml后，以10μl/min的流速注入2通道40s，使其通过protein a捕获在此通道上，1通道作为空白参考通道。使用high performance模型，将ace2 (200、100、50、20、12.5、0nm)按浓度梯度依次以30μl/min的流速注入芯片1、2通道，结合时间150s，解离时间300s。将10mm甘氨酸(ph1.5)以10μl/min的流速分别注入30s，对芯片进行再生。仪器设定温度为25℃。使用biacore t200分析软件(version:1.0,general electriccompany)对数据进行分析，1通道作为空白参考通道，扣除背景信号后分析各样品的结合，分析所用的模型为1:1binding。
114.结果与结论：结果见表1和图6a-6c，亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)均可与ace2结合，亲和力分别为1.05e-08m、1.65e-08m和7.41e-09m，与ace2的亲和力基本一致。
115.表1亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)与ace2亲和力结果
116.[0117][0118]
2.2与ifnar2亲和力测定
[0119]
研究方法：使用hbs-ep+作为实验缓冲液，每个循环包括捕获疫苗、不同浓度ifnar2 蛋白的进样及再生。将实施例1制备的突变株(南非、英国)、亲本株(v-01)疫苗分别稀释至 4μg/ml后，以10μl/min的流速注入4通道40s，使其通过protein a捕获在此通道上，3通道作为空白参考通道。使用high performance模型，将ifnar2(100、50、20、12.5、6.25、3.125、 0nm)按浓度梯度依次以30μl/min的流速注入芯片3,4通道，结合时间100s，解离时间150s。将10mm甘氨酸(ph1.5)以30μl/min的流速分别注入30s，对芯片进行再生。仪器设定温度为25℃。使用biacore t200分析软件(version:1.0,general electric company)对数据进行分析， 3通道作为空白参考通道，扣除背景信号后分析各样品的结合，分析所用的模型为1:1binding。
[0120]
结果与结论：结果见表2和图6d-6f，亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)均可与ifnar2蛋白结合，亲和力分别为1.03e-07m、8.64e-08m和2.95e-07m，与ifnar2 的亲和力基本一致。
[0121]
表2亲本株(v-01)疫苗、突变株疫苗(英国株、南非株)与ifnar2亲和力结果
[0122]
样品ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)亲本株疫苗(v-01)1.61e+051.65e-021.03e-07英国株疫苗2.26e+051.96e-028.64e-08南非株疫苗6.14e+041.81e-022.95e-07
[0123]
实施例3：亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)的生物学活性
[0124]
亲本株疫苗(v-01)与突变株疫苗(英国株、南非株)结构中的ifnα-2b与细胞膜上内源受体ifnar2和ifnar1结合后，可以通过信号转导激活干扰素刺激反应元件，启动萤光素酶的表达，表达量与干扰素的生物学活性成正相关，加入细胞裂解液和萤光素酶底物后，测定其发光强度，以此测定其生物学活性。因此，使用干扰素重组细胞(报告基因法)对实施例1 制备的突变株(南非、英国)疫苗与亲本株疫苗(v-01)结构中ifnα结构域的细胞活性进行检测。具体如下：
[0125]
研究方法：用测定培养液(含1％glutamax，10％fbs的dmem)将亲本株疫苗(v-01) 与突变株疫苗(英国株、南非株)稀释至12μg/ml(2
×
，终浓度为6μg/ml)，加至稀释板第2列作为起始浓度，按照第3-7列约3.5倍、8-12列约6倍梯度稀释至第11个浓度梯度。浓度依次为12、3.43、0.98、0.28、0.080、0.023、0.0065、0.0011、0.00018、0.000030、0.0000050 μg/ml。收集hek-lucia
tm null重组细胞(货号：hkl-null，购自：invivogen)，用测定培养液调整细胞密度至8
×
105个/ml，按50μl/孔加入到96孔全白细胞板中，即细胞4
×
104个/孔，然后以50μl/孔分别加入各稀释梯度的样品，各设3复孔。设置不加药阴性对照(nc)和测定培养液空白对照(blank)。于37℃、5％co2培养箱培养18h～24h。反应结束后取出培养板平衡至室温，以100μl/孔加入bio-glo萤光素酶试剂，200～500rpm室温震荡避光反应10 min～30min。酶标仪检测化学发光单位rlu值，利用softmax软件进行四参数拟合分析。并计算ec
50
。
[0126]
结果与结论：结果见表3和图7，亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株) 的ifnα结构域均能够激活ifnα信号通路，具备预期细胞生物学活性，三者的ec
50
分别为15.1 ng/ml、12.4ng/ml和12.8ng/ml。
[0127]
表3亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)ifnα结构域的生物学活性
[0128]
样品ec
50
(ng/ml)亲本株疫苗(v-01)15.1英国株疫苗12.4南非株疫苗12.8
[0129]
实施例4：小鼠体内效力评估-滴度
[0130]
疫苗的动物体内效力评估至关重要，可以直接体现疫苗产生的免疫原性，与其产生的保护力直接相关。因此，采用c57bl/6小鼠对亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)的体内效力进行评估。
[0131]
研究方法：将实施例1制备的亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)疫苗免疫6～8周龄c57bl/6小鼠，疫苗浓度10μg/ml，每只小鼠每次大腿肌肉注射0.1ml，10只/组，每只小鼠共免疫2次(第0天与第14天各一次)，初免28天(即2免14天)后眼眶采血取血清，血液室温静置待凝固后，4000rpm，2～8℃，离心10min，取上清。
[0132]
采用酶联免疫吸附法测定抗rbd抗体几何平均滴度(gmt)：使用pbs将各疫苗对应的 rbd蛋白(包括野生型rbd、南非突变rbd、英国突变rbd)稀释至1μg/ml，100μl/孔，过夜包被，pbst洗涤2次后，再使用1％脱脂奶粉或bsa封闭。使用pbst将血清稀释1000倍，再使用96孔板进行2倍梯度稀释，共12个梯度。将稀释好的血清样品加入提前完成rbd蛋白包被和封闭的酶标板中，100μl/孔，200rpm震荡孵育2h。pbst洗涤4次后，加入约1:20000的hrp 标记的羊抗鼠igg二抗，200rpm震荡孵育1h。pbst洗涤4次后，加入100μl/孔的tmb显色液显色10min。使用0.2m h2so4终止后，读取450nm和620nm处吸光值。免疫血清样本的滴度为信号值大于cutoff值的最大稀释倍数，并计算结合效价的几何平均滴度。
[0133]
结果与结论：结果见表4和图8，亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株) 均能引起较强的免疫原性，且亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)的平均滴度相当。
[0134]
表4亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)小鼠体内效力
[0135]
样品野生型rbd英国突变rbd南非突变rbd亲本株疫苗(v-01)406375322540237024英国株疫苗406375512000203187南非株疫苗376252298631348362
[0136]
实施例5：假病毒中和效价-保护力评估
[0137]
疫苗免疫动物后产生特异性的抗体，但该抗体是否能够保护机体不被病毒攻击，还需要进行免疫后血清对于病毒攻击的保护力进行评估。由于新冠病毒的危险性，用真病毒进行攻毒评估非常困难。因此，采用重组的新冠病毒s蛋白、以vsv g为骨架构建包装、并且携带萤光素酶报告基因的假病毒对实施例1制备的亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)的假病毒保护力进行评估。
[0138]
研究方法：血清样本提前采用56℃水浴灭活30min。取抗rbd小鼠中和抗体，先用检
测培养液(10％fbs dmem)稀释至25μg/ml，作为阳性质控品(pc)。取待测血清样本，在96 孔全白细胞板中稀释至首孔浓度为5％(即1:20)，然后与阳性质控品一起按照1:3进行倍比稀释，共8个稀释梯度，各稀释梯度的血清样本为100μl/孔。提前在4℃融化假病毒，用检测培养液将各疫苗对应的假病毒(包括野生型假病毒、南非突变假病毒、英国突变假病毒)稀释至20000tcid
50
/ml，在血清稀释板中加入50μl/孔假病毒稀释液，假病毒量即为1000tcid
50
/ 孔，血清初始稀释度即为1:30。同时设置假病毒对照(vc，不含血清)以及细胞对照(cc，不含血清和假病毒)，然后将全白细胞板置于37℃、5％co2培养箱孵育1～2h。收集 hek293t-ace2细胞，用检测培养液重悬计数，并调整细胞浓度至2.5
×
105个/ml，按照100μl/ 孔加入细胞，即每孔细胞为2.5
×
104个。将全白细胞板置于37℃，5％co2培养箱培养20～28h。检测前先吸弃150μl/孔上清，然后按100μl/孔加入萤光素酶检测试剂，并用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸6～8次，室温避光反应5min。酶标仪读取化学发光单位rlu值，按照如下公式进行抑制率计算：抑制率(％)＝[1－(样品组rlu值－细胞对照cc均值)/(假病毒对照vc均值－细胞对照cc均值)]
×
100％。
[0139]
将抑制率数据结果导入软件，横坐标为倍比稀释倍数的对数值(log titer)，纵坐标为抑制率百分比(％inhibition)，进行四参数拟合分析，软件自动计算pnt
50
值，取整即为假病毒中和效价。
[0140]
结果与结论：结果见表5和图9，亲本株疫苗(v-01)免疫后血清能够中和野生型假病毒、英国突变假病毒和南非突变假病毒，其pnt
50
分别为1977、1131和418，相比较野生型假病毒来说，其对英国突变假病毒和南非突变假病毒的中和效果分别下降1.7倍和4.7倍，对南非突变假病毒的中和效果有大幅降低，差异显著。
[0141]
英国株疫苗免疫后血清亦能够中和野生型假病毒、英国突变假病毒和南非突变假病毒，其pnt
50
分别为846、1535、217，其对野生型假病毒和英国突变假病毒的中和效果好于南非突变假病毒。相比亲本株疫苗(v-01)，英国株疫苗的设计，可以提高其对于英国突变的保护力约1.8倍，且有显著差异，但对南非突变的保护力略差。
[0142]
南非株疫苗免疫后血清能够中和野生型假病毒、英国突变假病毒和南非突变假病毒，其 pnt
50
分别为279、496、1136，其对南非突变假病毒的中和效果明显高于亲本株疫苗(v-01)，提高约4.1倍，且差异极显著。因此南非株疫苗的设计，大幅提高了对于南非突变的保护力。
[0143]
表5亲本株疫苗(v-01)、突变株疫苗(英国株、南非株)假病毒中和效价
[0144]
样品野生型假病毒英国突变假病毒南非突变假病毒亲本株疫苗(v-01)19771131418英国株疫苗8461535217南非株疫苗2794961136