一种重组新城疫溶瘤病毒及制备方法与应用与流程

本发明属于肿瘤治疗领域，尤其涉及一种重组新城疫溶瘤病毒及制备方法与应用。

背景技术：

mmp8又称为中性粒细胞胶原酶，是最早在中性粒细胞中发现的一种金属基质蛋白酶。随着研究的深入，人们发现内皮细胞、干细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等均表达mmp8。mmp8在多种细胞的增殖和迁移中起到重要作用。mmp8除裂解纤维胶原(ⅰ-ⅲ)外，还可分解或激活一些趋化因子(如lⅸ)、胞外基质蛋白、细胞粘附蛋白、蛋白酶抑制剂和生长因子等。目前实体肿瘤治疗疗效差的原因之一就是药物无法进入肿瘤内部。

基于溶瘤性新城疫病毒lasota株进行构建的重组新城疫病毒，该重组溶瘤病毒在不影响溶瘤特性的前提下，即在选择性对肿瘤细胞进行杀伤的同时表达mmp8；本发明能够高效表达mmp8，而且能分泌至肿瘤细胞外环境中，从而引发机体的免疫反应。

所以，通过构建重组mmp8基因的溶瘤性新城疫病毒，将其作用于肿瘤进行复制，并在肿瘤组织表达mmp8蛋白，降解细胞外基质，有利于药物在肿瘤局部扩散，更多的循环中的免疫细胞进入肿瘤组织，在肿瘤部位诱发强的免疫应答，发挥抗肿瘤作用。该重组病毒为溶瘤病毒治疗提供了一种新策略，具有良好的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种重组新城疫溶瘤病毒，该重组新城疫病毒包括如seqidno.1所示的核苷酸序列。

进一步的，所述重组新城疫病毒是基于溶瘤性新城疫病毒lasota株进行构建的。

进一步的，所述重组新城疫病毒还包括htert启动子。

更进一步的，所述重组新城疫病毒包括新城疫病毒的n基因、p基因和np基因。

本发明目的之二在于提供所述的重组新城疫病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步的，所述的肿瘤为肝癌肿瘤细胞。

进一步的，所述个肝癌肿瘤细胞为hepg2或mhcc97。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过构建重组mmp8基因的溶瘤性新城疫病毒，将其作用于肿瘤进行复制，并在肿瘤组织表达mmp8蛋白，降解细胞外基质，有利于药物在肿瘤局部扩散，更多的循环中的免疫细胞进入肿瘤组织，在肿瘤部位诱发强的免疫应答，发挥抗肿瘤作用。该重组病毒为溶瘤病毒治疗提供了一种新策略，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中mmp8基因扩增的凝胶电泳图。

图2为实施例1中pmei酶切lasota载体的凝胶电泳图。

图3为实施例1中重组新城疫病毒载体ndv-mmp8的凝胶电泳图。

图4为实施例2中rt-pcr验证重组新城疫病毒ndv-mmp8目的基因片段的凝胶电泳图。

图5a为实施例3中hepg2的活力检测结果。

图5b为实施例3中mhcc97的活力检测结果。

图6a为实施例3中小鼠hepg2移植肿瘤模型的肿瘤体积变化和kaplan–meier生存曲线图。

图6b为实施例3中小鼠移植肿瘤模型的kaplan–meier生存曲线图。

具体实施方式

实施例1携带mmp8基因的重组病毒基因组质粒的构建

1.携带ndv同源序列和htert启动子的mmp8片段的扩增

从ncbi找出mmp8蛋白的编码序列，即cds区，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并将其构建至pcdna3.1+克隆载体上。

mmp8(seqidno.1)：

atgcaacaaatacctcaagagaagtcaattaatgactacctggaaaagttctaccaattaccaagcaaccagtatcagtctacaaggaagaatggcactaatgtgatcgttgaaaagcttaaagaaatgcagcgattttttgggttgaatgtgacggggaagccaaatgaggaaactctggacatgatgaaaaagcctcgctgtggagtgcctgacagtggtggttttatgttaaccccaggaaaccccaagtgggaacgcactaacttgacctacaggattcgaaactataccccacagctgtcagaggctgaggtagaaagagctatcaaggatgcctttgaactctggagtgttgcatcacctctcatcttcaccaggatctcacagggagaggcagatatcaacattgctttttaccaaagagatcacggtgacaattctccatttgatggacccaatggaatccttgctcatgcctttcagccaggccaaggtattggaggagatgctcattttgatgccgaagaaacatggaccaacacctccgcaaattacaacttgtttcttgttgctgctcatgaatttggccattctttggggctcgctcactcctctgaccctggtgccttgatgtatcccaactatgctttcagggaaaccagcaactactcactccctcaagatgacatcgatggcattcaggccatctatggactttcaagcaaccctatccaacctactggaccaagcacacccaaaccctgtgaccccagtttgacatttgatgctatcaccacactccgtggagaaatacttttctttaaagacaggtacttctggagaaggcatcctcagctacaaagagtcgaaatgaattttatttctctattctggccatcccttccaactggtatacaggctgcttatgaagattttgacagagacctcattttcctatttaaaggcaaccaatactgggctctgagtggctatgatattctgcaaggttatcccaaggatatatcaaactatggcttccccagcagcgtccaagcaattgacgcagctgttttctacagaagtaaaacatacttctttgtaaatgaccaattctggagatatgataaccaaagacaattcatggagccaggttatcccaaaagcatatcaggtgcctttccaggaatagagagtaaagttgatgcagttttccagcaagaacatttcttccatgtcttcagtggaccaagatattacgcatttgatcttattgctcagagagttaccagagttgcaagaggcaataaatggcttaactgtagatatggctaa

上游引物(seqidno.2)：

5’-ccaaggtccaactctgtttaaacttagaaaaaatacgggtagaagtgccaccgacccccgggtccg-3’；

下游引物(seqidno.3)：

5’-attgccgcttgggtttaaacttattacttgtacagctc-3’。

pcr采用vazyme公司的maxmastermix高保真dna聚合酶完成对片段扩增，pcr体系如表1所示：

表1

pcr扩增程序如表2所示：

表2

2.扩增片段的回收

利用omega公司gelextractionkit凝胶回收试剂盒对pcr产物进行胶回收，结果如图1所示，凝胶回收方法详见相关说明书，最终用30μl无菌无酶水洗脱回收目的片段。

3.pmeⅰ酶切新城疫病毒弱毒株lasota载体(ndv载体的线性化)

酶切采用newenglandbiolabs(neb)公司的pmeⅰ限制性内切酶，反应温度为37℃，反应时间为2h，酶切体系如表3所示：

表3

4.酶切ndv载体片段的回收

利用omega公司gelextractionkit凝胶回收试剂盒对pcr产物进行胶回收，pmei酶切lasota载体的凝胶电泳结果如图1所示，凝胶回收方法详见相关说明书，最终用30μl无菌无酶水洗脱回收线性化的ndv片段。

5.目的片段与线性化ndv载体的同源重组

同源重组采用vazyme公司的clonexpressiionestepcloningkit单片段快速克隆试剂盒，反应温度37℃，反应时间0.5h，反应体系如表4所示：

表4

6.同源重组产物转化感受态细胞

转化所用的感受态细胞为transgenbiotech公司的transstbl3chemicallycompetentcell，转化方法详见说明书。

7.连接产物的提取与鉴定

挑取平板的菌落并在在含有amp(+)lb培养基中放于摇床上，30℃，180rpm进行摇菌培养12h，采用omega公司dnaplasmidminikiti质粒小量提取试剂盒i型对大肠杆菌进行质粒提取，具体方法详见说明书，最终用30μl无菌无酶水洗脱回收质粒并进行凝胶电泳验证，结果如图3所示。

利用在目的片段上/下游的ndv载体上的碱基重新设计引物对完整的插入片段进行质粒pcr后的凝胶电泳验证和pcr产物送样至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证目的片段。

ndv载体上游引物(seqidno.4)：

5’-gttagatgcagccgggtcg-3’；

ndv载体下游引物(seqidno.5)：

5’-aatgggcagaatcaaagta-3’。

pcr体系如表5所示：

表5

pcr扩增程序如表6所示：

表6

实施例2重组新城疫病毒的拯救

1.目的质粒与辅助质粒的准备

将含有目的片段、n片段、p片段、np片段的质粒的菌液进行摇菌大量扩增，并使用vazyme公司的fastpureendofreeplasmidmaxikit进行对质粒的大量提取，具体方法详见说明书。

2.bsr细胞的准备

bsr细胞在含有0.5mg/mlg418的完全dmem培养基(10％胎牛血清、1％青霉素链霉素溶液)培养并筛选三代后，接种于6孔板内，待细胞长至70％。

3.目的质粒与辅助质粒的共转染

首先，使用不完全dmem培养基1：100稀释稳定表达t7rna聚合酶的痘病毒，每孔加入200ul含有痘病毒的培养基对细胞进行侵染1h后，吸去含有痘病毒的培养基，加入pbs洗2遍。另外，vazyme公司的exfect2000transfectionreagent转染试剂和目的片段质粒、n片段、p片段、np片段的四种质粒分别使用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的opti-mem进行配制为a液和b液并分别混匀孵育后5min，再将a液和b液混匀成混合液孵育5min。每孔加入250μl混合液和1750μl不完全dmem进行转染，培养箱孵育6h。每3孔所需的a液和b液试剂配制的如下：

a液：转染试剂30μl、opti-mem375μl

b液：目的质粒(430ng/μl)15.6μl、n片段质粒(880ng/μl)3.9μl、np片段质粒(520ng/μl)6.6μl、l片段质粒(550ng/μl)3.1μl、opti-mem375μl。

6h后，吸去培养基,每孔加入10μl阿糖胞苷和1990μl含有5％胎牛血清的dmem培养基2ml，孵育24h。24h后，吸去培养基，每孔加入10μl阿糖胞苷和1988μlopti-mem。观察细胞死亡情况，待细胞数量低于20％(约24h)可收集细胞培养液。

4.重组新城疫病毒ndv-mmp8的鸡胚尿囊腔培养及拯救

使用广州洁特生物过滤股份有限公司的0.22μm孔径的syringefilter对收集的细胞培养液进行过滤后，400μl过滤的培养液接种于spf种蛋，继续于孵蛋箱孵育。接毒24h后，丢弃死亡的鸡胚。接毒120h后，将鸡蛋从孵箱中取出，放于4℃冰箱过夜。然后，敲去鸡蛋气室，收集鸡胚尿囊液。

5.重组新城疫病毒ndv-mmp8的血凝试验及其rt-pcr验证及其测序

将分别将鸡胚尿囊液与pbs按1：20至1：212倍比稀释为50μl体积，并将其与50μl含有1％的鸡红细胞的pbs混匀孵育15min，观察血凝效价，并挑选血凝效价阳性的尿囊液进行rt-pcr验证。尿囊液的rna提取试剂盒采用qiagen公司的rneasyminikit，rt-pcr采用transgenbiotech公司的one-steprt-pcrsupermix进行，rt-pcr产物进行凝胶电泳验证(参见图4)和送样至广州华大基因进行测序验证目的片段。尿囊液中的病毒rna提取步骤详见说明书，rt-pcr体系如表7所示：

表7

扩增程序如表8所示：

表8

实施例3重组新城疫病毒的抗肿瘤作用

1.重组新城疫病毒对hepg2的体外杀伤作用

hepg2、mhcc97细胞分别在含有完全dmem培养基(10％胎牛血清、1％青霉素链霉素溶液)10⁴个细胞/孔接种到96孔板中。当细胞密度达到70-80％时，将不同moi值的病毒加入96孔板中。分别在感染后24、48、72、96小时向每孔加入cck8试剂，并在37℃和5％co2下孵育2小时。最后，使用酶标仪在450nm处测量吸光度值，参见图5a和图5b，其中图5a为hepg2的活力检测结果，图5b为mhcc97的活力检测结果，数据均以平均值±标准差表示。

2.重组新城疫病毒的体内抗癌效果

免疫重建scid/beige鼠(hu-pbmc-scid)和人肝癌hepg2模型实验动物随机分为5组，当小鼠肿瘤平均体积达到150mm³时每隔一天进行200ulpbs、10⁷pfundv、10⁷pfundv-mmp8瘤内注射，共治疗5次。观察小鼠肿瘤生长情况，探究重组病毒对肿瘤的治疗效果，结果如图6所示，其中图6a为小鼠hepg2移植肿瘤模型的肿瘤体积变化和kaplan–meier生存曲线；图6b为小鼠移植肿瘤模型的kaplan–meier生存曲线，使用测径仪测量肿瘤大小。数据以平均值±标准差表示，使用单因素方差分析比较第30天的肿瘤体积。(*p＜0.05，***p＜0.001)。从图6可以看出，小鼠分别经过pbs、ndv、ndv-mmp8治疗后，随时间的延长，pbs组肿瘤体积不断增加，无治疗或抑制肿瘤的效果，重组病毒治疗组肿瘤体积均增长缓慢。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

sequencelisting

<110>广西医科大学

<120>一种重组新城疫溶瘤病毒及制备方法与应用

<130>2021.05.18

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