组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的应用

组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的应用
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体涉及组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的应用。


背景技术：

2.严重无精症患者的睾丸和附睾内没有成熟精子或长形精子细胞，因此无法通过卵胞浆内单精子显微注射技术(intracytoplasmic sperm injection，icsi)得到遗传学后代。而圆形精子注射(round spermatid injection，rosi)技术是将圆形精子注射进卵母细胞，通过辅助激活使卵母细胞受精，从而帮助这部分无精症患者获得遗传学后代。尽管rosi技术在包括小鼠、兔、猴和人类在内的多种动物中均已应用，但仍存在诸如着床率低、流产率高、活产率低等问题。因此，改善rosi胚胎的发育潜能能够有力地推动这项技术在辅助生殖领域的临床应用。
3.组蛋白h3k79位点的甲基化修饰在基因的表达调控中起着重要作用，该位点的甲基化修饰通常和转录活化相关。h3k79位点唯一明确的组蛋白甲基化修饰酶是dot1l，其能催化h3k79位点单/双/三甲基化修饰，作为一个可以调控基因表达的组蛋白修饰酶。目前关于h3k79位点甲基化修饰功能的研究多集中于细胞分化、dna损伤修复、端粒沉默等方面，在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的作用还未见报道。


技术实现要素：

4.本发明第一方面的目的，在于提供组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的应用。
5.本发明第二方面的目的，在于提供一种组合物。
6.本发明第三方面的目的，在于提供第二方面的组合物在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的应用。
7.本发明第四方面的目的，在于提供组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂在制备提高动物圆形精子注射胚胎发育效率的产品中的应用。
8.本发明第五方面的目的，在于提供第二方面的组合物在制备提高动物圆形精子注射胚胎发育效率的产品中的应用。
9.本发明第六方面的目的，在于提供一种激活液。
10.本发明第七方面的目的，在于提供一种培养液。
11.本发明第八方面的目的，在于提供一种提高动物圆形精子注射胚胎发育效率的方法。
12.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
13.本发明的第一个方面，提供组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的应用。
14.优选地，所述组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂为组蛋白甲基转移酶dot1l抑制剂。
15.优选地，所述组蛋白甲基转移酶dot1l抑制剂为sgc0946。
16.所述sgc0946的分子式为c
28
h
40
brn7o4，cas号为1561178
‑
17
‑
3，化学结构式如式(i)所示。
[0017][0018]
优选地，所述组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂的终浓度为0.5～1.5μm；进一步为1～1.5μm。
[0019]
优选地，所述胚胎发育效率为囊胚发育率、着床率和活产率中的至少一种；进一步为囊胚发育率。
[0020]
优选地，所述动物为哺乳动物。
[0021]
本发明的第二个方面，提供一种组合物，包含组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂和组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂。
[0022]
优选地，所述组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂为组蛋白甲基转移酶dot1l抑制剂。
[0023]
优选地，所述组蛋白甲基转移酶dot1l抑制剂为sgc0946。
[0024]
所述sgc0946的分子式为c
28
h
40
brn7o4，cas号为1561178
‑
17
‑
3，化学结构式如式(i)所示。
[0025]
优选地，所述组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂为组蛋白甲基转移酶g9a抑制剂。
[0026]
优选地，所述组蛋白甲基转移酶g9a抑制剂为a366、bix
‑
01294和brd4770中的至少一种；进一步为a366和brd4770中的至少一种；更进一步为a366。
[0027]
所述a366的分子式为c
19
h
27
n3o2，cas号为1527503
‑
11
‑
2，化学结构式如式(ⅱ)所示。
[0028][0029]
所述bix
‑
01294的分子式为c
28
h
38
n6o2，cas号为935693
‑
62
‑
2，化学结构式如式(ⅲ)所示。
[0030][0031]
所述brd4770的化学式为c
25
h
23
n3o3，cas号为1374601
‑
40
‑
7，化学结构式如式(ⅳ)所示。
[0032][0033]
优选地，所述组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂的终浓度为0.5～1.5μm；进一步为1～1.5μm。
[0034]
优选地，所述组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂的终浓度为100～2500nm；进一步为150～1250nm；更进一步为150～300nm。
[0035]
本发明的第三个方面，提供第二方面的组合物在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的应用。
[0036]
优选地，所述胚胎发育效率为囊胚发育率、着床率和活产率中的至少一种。
[0037]
优选地，所述动物为哺乳动物。
[0038]
本发明的第四个方面，提供组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂在制备提高动物圆形精子注射胚胎发育效率的产品中的应用。
[0039]
优选地，所述组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂为组蛋白甲基转移酶dot1l抑制剂。
[0040]
优选地，所述组蛋白甲基转移酶dot1l抑制剂为sgc0946。
[0041]
所述sgc0946的分子式为c
28
h
40
brn7o4，cas号为1561178
‑
17
‑
3，化学结构式如式(i)所示。
[0042]
优选地，所述组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂的终浓度为0.5～1.5μm；进一步为1～1.5μm。
[0043]
优选地，所述胚胎发育效率为囊胚发育率、着床率和活产率中的至少一种；进一步为囊胚发育率。
[0044]
优选地，所述产品包括激活液和培养液。
[0045]
优选地，所述动物为哺乳动物。
[0046]
本发明的第五个方面，提供第二方面的组合物在制备提高动物圆形精子注射胚胎发育效率的产品中的应用。
[0047]
优选地，所述胚胎发育效率为囊胚发育率、着床率和活产率中的至少一种。
[0048]
优选地，所述产品包括激活液和培养液。
[0049]
优选地，所述动物为哺乳动物。
[0050]
本发明的第六个方面，提供一种激活液，包含：
[0051]
(1)卵母细胞激活液；和
[0052]
(2)组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂或本发明第二方面的组合物。
[0053]
优选地，所述卵母细胞激活液包括氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸氢钠、氯化锶、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、丙酮酸钠、谷氨酰胺、青霉素
‑
链霉素、乳酸钠。
[0054]
优选地，所述组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂为组蛋白甲基转移酶dot1l抑制剂。
[0055]
优选地，所述组蛋白甲基转移酶dot1l抑制剂为sgc0946。
[0056]
所述sgc0946的分子式为c
28
h
40
brn7o4，cas号为1561178
‑
17
‑
3，化学结构式如式(i)所示。
[0057]
优选地，所述组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂的终浓度为0.5～1.5μm；进一步为1～1.5μm。
[0058]
优选地，所述组合物中组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂的终浓度为0.5～1.5μm；进一步为1～1.5μm。
[0059]
优选地，所述组合物中组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂的终浓度为100～2500nm；进一步为150～1250nm；更进一步为150～300nm。
[0060]
本发明的第七个方面，提供一种培养液，包含：
[0061]
(1)胚胎培养液；和
[0062]
(2)组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂或本发明第二方面的组合物。
[0063]
优选地，所述胚胎培养液为卵裂胚培养液。
[0064]
优选地，所述卵裂胚培养液为ksom培养液、m16培养液、czb培养液、g
‑
1tm plus(vitrolife，10128)、sydney ivf cleavage medium(cook，k
‑
sicm)和quinn’s cleavage medium(sage，art
‑
1026)中的至少一种。
[0065]
优选地，所述ksom培养液包含氨基酸添加剂。
[0066]
优选地，所述氨基酸添加剂为glutamax
tm
添加剂和bme氨基酸溶液中的至少一种。
[0067]
优选地，所述组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂为组蛋白甲基转移酶dot1l抑制剂。
[0068]
优选地，所述组蛋白甲基转移酶dot1l抑制剂为sgc0946。
[0069]
所述sgc0946的分子式为c
28
h
40
brn7o4，cas号为1561178
‑
17
‑
3，化学结构式如式(i)所示。
[0070]
优选地，所述组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂的终浓度为0.5～1.5μm；进一步为1～1.5μm。
[0071]
优选地，所述组合物中组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂的终浓度为0.5～1.5μm；进一步为1～1.5μm。
[0072]
优选地，所述组合物中组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂的终浓度为100～2500nm；进
一步为150～1250nm；更进一步为150～300nm。
[0073]
本发明的第八个方面，提供一种提高动物圆形精子注射胚胎发育效率的方法，包括如下步骤：
[0074]
(1)将卵母细胞置于本发明第六方面的激活液中预激活，然后置于缓冲液中处理；
[0075]
(2)将圆形精子细胞置于缓冲液中处理；
[0076]
(3)将步骤(2)中的圆形精子细胞注入步骤(1)中的卵母细胞中，得到圆形精子注射胚胎；
[0077]
(4)将圆形精子注射胚胎置于本发明第六方面的激活液中激活，然后转入本发明第七方面的培养液中培养。
[0078]
优选地，步骤(1)中所述预激活的时间为5～15min。
[0079]
优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述处理的时间为3～8min。
[0080]
优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述缓冲液为m2培养基、g
‑
mops
tm
/g
‑
mops
tm
plus(vitrolife，10130)、icsi
tm
(vitrolife，10111)、quinn’s advatage medium with hepes without ca,mg(sage，art
‑
4100)和sydney ivf gamete buffer(cook，k
‑
sigb)中的至少一种。
[0081]
优选地，所述m2培养基、g
‑
mops
tm
/g
‑
mops
tm
plus(vitrolife，10130)、icsi
tm
(vitrolife，10111)、quinn’s advatage medium with hepes without ca,mg(sage，art
‑
4100)和sydney ivf gamete buffer(cook，k
‑
sigb)中含细胞松弛素b。
[0082]
优选地，步骤(4)中所述激活的时间为4～6h。
[0083]
优选地，步骤(4)中所述培养的时间为12～18h。
[0084]
优选地，所述动物为哺乳动物。
[0085]
优选地，所述胚胎发育效率为囊胚发育率、着床率和活产率中的至少一种；进一步为囊胚发育率。
[0086]
本发明的有益效果是：
[0087]
本发明首次公开了组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的应用，与现有的圆形精子注射技术相比，本发明在不引入转基因风险下，通过组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂可以显著提高圆形精子注射胚胎的囊胚发育率，建立了良好的圆形精子注射胚胎体外培养体系，提高圆形精子注射技术的可行性。
[0088]
本发明还提供了一种组合物，包含组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂和组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂，该组合物在提高动物圆形精子注射胚胎发育效率中的效果优于两种抑制剂单独使用的效果。与现有的圆形精子注射技术相比，本发明在不引入转基因风险下，通过该组合物可以显著提高动物圆形精子注射胚胎的囊胚发育率、着床率以及活产率；并且该组合物处理后的圆形精子注射活产f0代可正常繁育后代，建立了良好的圆形精子注射胚胎体外培养体系，提高圆形精子注射技术的可行性。
附图说明
[0089]
图1是本发明中不同处理的圆形精子注射卵母细胞94h后圆形精子胚胎发育白光图：其中，a是dmso处理下圆形精子注射卵母细胞94h后圆形精子胚胎发育白光图；b是组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946处理下圆形精子注射卵母细胞94h后圆形精子胚胎发育
白光图；c是组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946与组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366处理下圆形精子注射卵母细胞94h后圆形精子胚胎发育白光图。
[0090]
图2是本发明实施例2中不同浓度的组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946处理下圆形精子注射胚胎囊胚发育率图：***表示p＜0.001。
[0091]
图3是本发明实施例2中不同组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946处理圆形精子胚胎的时间下圆形精子注射胚胎囊胚发育率图：**表示p＜0.01。
[0092]
图4是本发明实施例3中不同组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂处理下圆形精子注射胚胎囊胚发育率图：*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
[0093]
图5是不同浓度的组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366处理下圆形精子注射胚胎囊胚发育率图：***表示p＜0.001。
[0094]
图6是不同组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366处理圆形精子胚胎的时间下圆形精子注射胚胎囊胚发育率图：**表示p＜0.01。
[0095]
图7是不同组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂处理下圆形精子注射胚胎囊胚发育率图：*表示p＜0.05。
[0096]
图8是本发明实施例6中圆形精子胚胎移植19天出生小鼠白光图：其中，a是dmso处理下圆形精子胚胎移植19天出生小鼠白光图；b是组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946与组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366处理下圆形精子胚胎移植19天出生小鼠白光图。
[0097]
图9是本发明实施例6中圆形精子胚胎移植19天出生小鼠的出生体重和胎盘重量图：其中，a是圆形精子胚胎移植19天出生小鼠的出生体重图；b是圆形精子胚胎移植19天出生小鼠的胎盘重量图。
[0098]
图10是本发明实施例6中圆形精子注射活产小鼠f0代繁育的后代图。
具体实施方式
[0099]
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
[0100]
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0101]
本实施例中使用的试剂如表1所示。
[0102]
表1试剂
[0103]
[0104][0105]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
[0106]
实施例1组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂对圆形精子注射胚胎发育效率的提升效果
[0107]
1.卵母细胞收集
[0108]
(1)提前准备卵子保存皿：用直径为3.5cm进口eppendorf胚胎培养皿，每个皿用m16培养基做8个30μl的培养滴，添加2.5ml石蜡油，没过培养液，放入培养箱(37℃、5％co2)预平衡3h。
[0109]
(2)挑选发情间期的10周龄b6d2f1雌鼠(由dba/2n雄鼠与c57bl/6n雌鼠交配得到的f1子代，c57bl/6n，dba/2n购买自维通利华)，体重大约18～25g。按照体重计算注射激素的单位，每20g体重注射8u；当日晚上7点半左右腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,pmsg)，并在pmsg启动48h后再注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hcg)以诱导超数排卵；hcg注射后13.5h取卵。
[0110]
(3)取卵前，提前将m2培养基、透明质酸酶溶液预热到37℃，在无菌培养皿中放入100μl m2培养基，备用；对小鼠进行颈椎脱位安乐死，腹面朝上，75％酒精消毒后延腹中下部剪开皮肤，向头和尾部撕开，移去消化道，暴露子宫卵巢输卵管。超排成功的输卵管可肉眼见到膨大部，呈透明囊泡状，用眼科镊夹住输卵管与子宫连接处，贴近卵巢用眼科剪剪断卵巢和输卵管的连接处，贴近眼科镊剪断输卵管与子宫连接处，最后将输卵管转至m2培养基中。
[0111]
(4)体视镜下用1ml注射器针头划开输卵管壶腹部，从壶腹部分离卵母细胞复合物(cocs)。
[0112]
(5)将卵母细胞复合物(cocs)转移到200μl含1mg/ml透明质酸酶的m2培养基中，在
在提前预热好的37℃体视镜热台上消化1分钟，期间用200μl含1mg/ml透明质酸酶的m2培养基中消化1分钟，以200μl微量移液枪辅助吹吸(注意不要吹出气泡)；1分钟后见卵母细胞周围的颗粒细胞大部分脱离；镜下用口吸管快速挑选卵母细胞，在三个新的100ul m2培养基胚胎操作液滴里分别清洗三次，每次将卵母细胞在液体上部画圈吹开，因为卵母细胞与颗粒细胞的沉降速率不同，在卵母细胞沉降而颗粒细胞漂浮时，快速挑选卵母细胞，以尽快中和、去除透明质酸酶、去除颗粒细胞。
[0113]
(6)将边缘折光明显，胞质均质透亮，极体明显，透明带宽度适宜的优质mii卵母细胞(成熟的卵母细胞)全部转移到步骤(1)制备的添加石蜡油的m16培养基中短暂培养，用于后续显微注射。
[0114]
2.圆形精子收集
[0115]
(1)取10周b6d2f1雄鼠(由dba/2n雄鼠与c57bl/6n雌鼠交配得到的f1子代，c57bl/6n，dba/2n购买自维通利华)分离睾丸，体重20～25g，对小鼠进行颈椎脱位安乐死，腹部向上将小鼠放在手术盘中，75％乙醇喷洒在小鼠腹部进行消毒。先用剪刀在下肢上端水平线位置剪开皮肤，做一个1.5cm左右的横切口，再在腹壁肌肉层做一小切口，用剪刀钝性分离肌层，暴露出腹腔。钝镊子轻轻夹住一侧睾丸脂肪垫，连带睾丸、附睾和输精管一同拉出切口，分离睾丸，剥去睾丸白膜后用pbs洗2遍。
[0116]
(2)将睾丸转移至无菌生物安全柜，弃去液体，用眼科剪将组织剪碎成匀浆状，加入1ml0.25％胰酶，37℃培养箱消化7分钟，镜下见大部分细胞从管腔中分离，加入4ml的小鼠成纤维细胞培养基(dmem(12800017，life technologies)+10％fbs(se200
‑
es,vistech))终止消化。
[0117]
(3)组织悬浊液经40μm细胞筛(falcon，352340)滤后转至15ml离心管，离心力348g，离心3分钟后弃上清，加入4ml小鼠成纤维细胞培养基(dmem(12800017，life technologies)+10％fbs(se200
‑
es,vistech))重悬细胞沉淀，加入hoechst 33342(终浓度2.5μg/l)，37℃水浴锅中避光放置，染色15分钟，期间颠倒混匀3次防止细胞粘连。
[0118]
(4)再次离心(离心力348g下离心3分钟)后用1ml流式分选细胞保存液(pbs+4％fbs(se200
‑
es，vistech)重悬，40μm细胞筛滤至流式管，以去除悬液中的粘连细胞，保证上样前为单细胞悬液。
[0119]
(5)利用流式细胞分选仪，分选睾丸细胞中的单倍体，即圆形精子。
[0120]
3.圆形精子注射
[0121]
(1)配制小分子浓储：sgc0946粉末(购置于target mol公司，cas：1561178
‑
17
‑
3，产品编号：t3082)溶于dmso，终浓度10mm，小体积分装，保存于
‑
80℃，避免反复冻融，短期存放4℃，使用时配置sgc0946终浓度为1μm的卵母细胞激活液或ksom培养液(对照组为加入等量dmso的激活液或ksom培养液)，卵母细胞激活液的组分如下：氯化钠4.77g/l、氯化钾0.36g/l、磷酸二氢钾0.16g/l、七水硫酸镁0.29g/l、碳酸氢钠2.11g/l、六水氯化锶2.666g/l、牛血清白蛋白3.00g/l、乙二胺四乙酸二钠0.041g/l、丙酮酸钠0.03g/l、谷氨酰胺0.5％(v/v)、青霉素
‑
链霉素1％(v/v)、乳酸钠0.45％(v/v)；ksom培养液中包含1％(v/v)glutamax
tm
添加剂、2％(v/v)bme氨基酸溶液；现配现用。
[0122]
(2)注射前15分钟，将第1步收集的卵母细胞放入添加了sgc0946的卵母细胞激活液中进行预激活，注射前五分钟放入含有细胞松弛素b(终浓度5μg/ml)的m2培养基，改善胞
膜韧性。
[0123]
(3)注射前5分钟将流式分选得到的圆形精子细胞放入含有细胞松弛素b(终浓度5μg/ml)的m2培养基中自由沉降。
[0124]
(4)用固定针拨动卵母细胞使其极体处在11点～13点的位置，用压电破膜仪(piezo)大脉冲辅助注射针破卵母细胞透明带，用注射针吸入圆形精子细胞，吸破胞膜，只留下圆形精子核，再次用压电破膜仪(piezo)小脉冲破卵母细胞胞膜，用注射针将圆形精子核注射入mii期卵母细胞胞质后，退出并吸少量胞质，将卵母细胞破口封起来。
[0125]
(5)注射完成后，用步骤(1)配制的sgc0946终浓度为1μm的卵母细胞激活液清洗三次，以去除细胞松弛素b，并继续激活5小时，再转入添加了sgc0946的ksom培养液中共培养15h(37℃，5％co2)，并观察胚胎发育情况。
[0126]
(6)小分子作用撤除：共培养20小时后，更换新的已平衡二氧化碳浓度3h以上的ksom培养液，在胚胎发育到4细胞晚期，更换到新的已平衡二氧化碳浓度3h以上的ksom培养液中培养至囊胚。
[0127]
(7)观察囊胚发育率：注射后94h，计算囊胚发育率。
[0128]
结果如表2及图1所示：小分子化合物sgc0946对圆形精子注射胚胎的囊胚发育率有提升效果：囊胚发育率由33.70％提升至53.26％。
[0129]
表2 sgc0946对圆形精子注射胚胎发育率的影响
[0130][0131]
注：a：p value<0.05，b6d2f1x b6d2f1品系中，添加sgc0946组囊胚发育率显著高于dmso组。
[0132]
实施例2组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂的浓度和作用时间对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的影响
[0133]
1.组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂的浓度对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的影响
[0134]
本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：
[0135]
(1)本试验过程第3步激活液和ksom培养液中组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946的浓度分别为500nm、1μm、2μm，各处理重复3次。
[0136]
结果如图2所示：浓度为1μm的组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的促进效果优于浓度为500nm、2μm的组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946及对照组(dmso)，1μm的组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946处理后，圆形精子注射胚胎囊胚发育率为50.59％。
[0137]
2.组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂处理圆形精子胚胎的时间对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的影响
[0138]
本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：
[0139]
(1)本试验过程第3步(5)中含组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂的卵母细胞激活液
和ksom培养液处理的时间总和不同：图3中“sgc0946 0
‑
10h”表示注射后用含sgc0946的卵母细胞激活液激活5小时，然后用ksom培养液共培养5h；“sgc0946 0
‑
20h”表示注射后用含sgc0946的卵母细胞激活液激活5小时，然后用ksom培养液共培养15h；“sgc09460
‑
44h”表示注射后用含sgc0946的卵母细胞激活液激活5小时，然后用ksom培养液共培养39h；“dmso”表示对照：注射后用只含相同体积比的溶剂dmso的卵母细胞激活液激活5小时，然后用只含相同体积比的溶剂dmso的ksom培养液共培养15h，各处理重复3次。
[0140]
结果如图3所示：组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946在注射圆形精子的卵母细胞激活后0～20h内处理，圆形精子注射胚胎囊胚发育率最佳。
[0141]
实施例3组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的提升效果
[0142]
本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：
[0143]
(1)本试验过程中含组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂的化学激活液和ksom培养液中dna甲基转移酶的种类和浓度不同：图4中：“rosi”表示未经任何处理；“+dmso”表示加入等量dmso；“sgc0946
‑
1μm”表示浓度为1μm的sgc0946；“epz0047777
‑
1μm”表示浓度为1μm的epz0047777(cas号：1338466
‑
77
‑
5)；“epz5676
‑
1μm”表示浓度为1μm的epz5676(cas号：1380288
‑
87
‑
8)。
[0144]
结果如图4所示：组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946能显著提高圆形精子注射胚胎囊胚发育率。
[0145]
实施例4组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366的浓度和作用时间对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的影响
[0146]
1.组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366的浓度对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的影响本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：
[0147]
(1)本试验过程第3步激活液和ksom培养液中组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366的浓度分别为150nm、300nm、600nm，各处理重复3次。
[0148]
结果如图5所示：浓度为150nm、300nm的组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的促进效果优于浓度为600nm的组蛋白甲基转移酶抑制；尤其浓度为300nm的组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366处理后，圆形精子注射胚胎囊胚发育率接近60％。
[0149]
2.组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366处理圆形精子胚胎的时间对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的影响
[0150]
本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：
[0151]
(1)本试验过程第3步(5)中含组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366的卵母细胞激活液和ksom培养液处理的时间总和不同：图5中：“dmso”表示对照：注射后用只含相同体积比的溶剂dmso的卵母细胞激活液激活5小时，然后用只含相同体积比的溶剂dmso的ksom培养液共培养15h；“a366 0
‑
10h”表示注射后用含a366的卵母细胞激活液激活5小时，然后用ksom培养液共培养5h；“a366 0
‑
20h”表示注射后用含a366的卵母细胞激活液激活5小时，然后用ksom培养液共培养15h；“a366 0
‑
44h”表示注射后用含a366的卵母细胞激活液激活5小时，然后用ksom培养液共培养39h；各处理重复3次。
[0152]
结果如图6所示：组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366在注射圆形精子的卵母细胞
激活后0～20h内处理，圆形精子注射胚胎囊胚发育率最佳。
[0153]
实施例5组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366对圆形精子注射胚胎囊胚发育率的提升效果
[0154]
本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：
[0155]
(1)本试验过程中含组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂的化学激活液和ksom培养液中组蛋白甲基转移酶的种类和浓度不同：图7中：“dmso”表示用等量dmso处理；“a366
‑
300nm”表示浓度为300nm的a366；“a366
‑
150nm”表示浓度为150nm的a366；“bix01294
‑
200nm”表示浓度为200nm的bix
‑
01294(cas号：935693
‑
62
‑
2)；“bix01294
‑
100nm”表示浓度为100nm的bix
‑
01294；“brd4770
‑
2.5μm”表示浓度为2.5μm的brd4770；“brd4770
‑
1.25μm”表示浓度为1.25μm的brd4770；“unc0631
‑
80nm”表示浓度为80nm的unc0631(cas号：1320288
‑
19
‑
4)；“unc0631
‑
40nm”表示浓度为40nm的unc0631。
[0156]
结果如图7所示：组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366、浓度为200nm的bix
‑
01294、brd4770均能提高圆形精子注射胚胎囊胚发育率。
[0157]
实施例6联合使用组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂和组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂对圆形精子注射胚胎发育潜能的提升效果
[0158]
本试验过程与实施例1中第1、2、3步相同，区别仅在于：
[0159]
(1)本实验过程中还包括采用dba/2n雄鼠与c57bl/6n雌鼠，dba/2n雄鼠与c57bl/6n雌鼠均购自北京维通利华。
[0160]
(2)本试验过程第3步激活液和ksom培养液中：1)同时含有组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366和组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946：终浓度分别为300nm、1μm；2)仅含有组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366，终浓度为300nm。
[0161]
结果如图1及表3所示：联合使用组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂和组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂可以显著提高囊胚发育率(66.67％，b6d2f1品系；41.18％，dbaxc57品系)，较单用组蛋白h3k9甲基转移酶抑制剂a366(58.93％)和单用组蛋白h3k79甲基转移酶抑制剂sgc0946(53.26％)效果更好(b6d2f1品系)。
[0162]
表3.sgc0946与a366联合应用对圆形精子注射胚胎的囊胚发育率的影响
[0163][0164][0165]
注：a：p value<0.05，b6d2f1xb6d2f1品系中，添加a366组囊胚率显著高于dmso组；bb:p value<0.01，b6d2f1xb6d2f1品系中，添加sgc0946+a366组囊胚率显著高于dmso组；ccc:p value<0.001,dbaxc57品系中添加sgc0946+a366组囊胚率显著高于dmso组。
[0166]
(3)将品系c57xdba圆形精子注射的二细胞胚胎移植，步骤如下：
[0167]
雄鼠结扎：取4～5周龄昆明雄鼠，体重25～35g，购买自广东省实验动物中心；称重
并用1％戊巴比妥钠(0.8mg/kg)经腹内注射使其麻醉，腹部向上将小鼠放在手术盘中，75％乙醇喷洒在小鼠腹部进行消毒；先用剪刀在下肢上端水平线位置剪开皮肤，做一个1.5cm左右的横切口，再在腹壁肌肉层做一小切口，用剪刀钝性分离肌层，暴露用下腹腔。钝镊子轻轻夹住一侧睾丸脂肪垫，连带睾丸、附睾和输精管一同拉出切口。输精管伴行有血管，小心钝性分离其周边筋膜以避免损伤周边血管，一把镊子撑开输精管，两端手术线结扎后，高温镊子将中段输精管烧烙掉，见输精管变白变硬。术后将肌肉层提起，让睾丸组织自然滑落至腹腔，重复上述步骤处理另一侧输精管。使用医用真丝缝合线分别缝合腹肌层及皮肤；输精管切除术后两周取发情雌鼠与其交配，以母鼠是否能怀孕，检测雄鼠是否已丧失生育能力。
[0168]
准备假孕母鼠：假孕小鼠采用icr雌鼠，8周龄，体重25～35g，购买自广东省实验动物中心；移植前一天取发情期icr雌鼠与结扎公鼠交配，次日早上8点前检栓，如果雌鼠阴道口检查出有白栓块，视为假孕0.5天。
[0169]
2细胞期胚胎输卵管移植：称重并用1％戊巴比妥钠(0.8mg/kg)经腹内注射使其麻醉，小鼠左侧卧位，在背中央右侧旁开1cm出，大腿上方1cm处剪开皮肤，透过肌层能隐约看到脂肪垫，肌层钝性分离出0.5cm小口，夹住脂肪垫将卵巢拉出腹腔，脂肪夹固定，暴露壶腹部，在体式镜下，用1ml注射器在壶腹部上方开一小口恰好放入口径100μm的口吸管，口吸管吸取四段液体，中间吸入三段空气，在第三段液体中吸入胚胎，插入小口，向壶腹部方向吹入胚胎，移植顺利能看到三个小气泡聚集在输卵管壶腹部，每只受体老鼠单侧输卵管移植14个胚胎(上述获得的c57xdba品系胚胎)，缝合肌层和皮肤，注意不要夹伤输卵管卵巢子宫，尽量夹脂肪垫以固定输卵管，移植19.5天后，对受体雌鼠进行剖宫产，将胎儿，胎盘取出，称重、拍照记录；结果如图8及表4所示：联用sgc0946和a366可以显著提高圆形精子注射胚胎着床率和活产率。
[0170]
表4.sgc0946与a366联合应用对圆形精子注射胚胎着床率和活产率的影响
[0171][0172][0173]
注：a:p<0.05，dbaxc57品系中，添加sgc0946与a366联合孵育的圆形精子注射胚胎着床率显著高于dmso组；b:p<0.05，dbaxc57品系中，添加sgc0946与a366联合孵育的圆形精子注射胚胎着床率显著高于dmso组。
[0174]
统计出生体重与胎盘体重，结果如图9所示：图9中：“rosi+dmso”表示添加dmso；“rosi+as”表示添加sgc0946和a366；n表示重复数；添加sgc0946和a366的圆形精子注射活产小鼠与dmso组相比，出生体重和胎盘体重无明显差别。
[0175]
以剖宫产前0～5天自然生产的icr母鼠作为代养母鼠，代为哺乳，养育剖宫产活产的胎儿，继续观察后代是否可育，结果如图10所示：添加sgc0946和a366的圆形精子注射活产小鼠f01代可正常繁育后代。
[0176]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的
限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。