一种用于检测水稻细菌性穗枯病菌的引物探针组合及应用

本发明涉及分子生物学检测技术领域，特别是涉及一种用于检测水稻细菌性穗枯病菌的引物探针组合及应用。

背景技术：

水稻细菌性穗枯病(又名水稻细菌性谷枯病)是一种严重的种传病害，病原菌为颖壳伯克氏菌(burkholderiaglumae)，它的寄主范围很广，除了侵染水稻外，还可以引起番茄、辣椒、紫苏、芝麻等植株的枯萎，也可以寄生在狗尾草、稗草、牛尾草等杂草上进行二次侵染，防治较为困难。该病害最早被发现是在1956年的日本，目前已经蔓延到亚洲、非洲及美洲的水稻种植地，造成水稻田大幅度减产甚至绝收，我国的海南、广东、广西、湖南、湖北、江西、安徽、浙江、黑龙江、吉林、辽宁等省份的稻区也有调查发现，呈大面积普遍发生态势。该病原菌主要危害水稻的穗部与谷粒，发病轻时可引起减产15％-20％，严重时损失可高达75％，同时，病原菌产生的毒素还影响稻米品质，能引起人体的肺纤维化囊肿以及幼儿的慢性肉芽肿病，给我国水稻产业的健康发展带来了严重的威胁。

水稻细菌性穗枯病现有的检测技术主要包括育苗检测、分离检测和致病性测定等传统检测法以及血清学检测法和pcr检测法。传统检测方法操作复杂，鉴定周期长且只能在病害显症后进行鉴定，已经不能适应病害快速检测的需要。血清学检测法主要是依靠elisa，但由于不同菌株的抗体较难获得，且特异性低，容易发生免疫交叉反应，造成检测结果的假阴性和假阳性。pcr技术检测方便快捷、特异性高，目前针对水稻细菌性穗枯病已有常规pcr、免疫pcr和荧光定量等多种pcr检测方法，但是这些pcr检测方法灵敏度较低，易受种子和植物组织中含有的某些抑制物的影响，造成实验结果假阴性。

数字pcr(dpcr)技术是一种核酸分子绝对定量技术，能够直接计数dna分子，是对起始样品的绝对定量，无需校准物和绘制标准曲线即可实现对样品初始浓度的绝对定量，比传统qpcr具有更加出色的灵敏度、特异性和精确性，对于带菌率不高的水稻样品，可以实现快速精准的检测，避免检测结果的假阴性带来的严重损失，但目前还未有关于采用数字pcr检测对水稻细菌性穗枯病进行检测的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用数字pcr检测水稻细菌性穗枯病菌(burkholderiaglumae)的方法，实现对水稻细菌性穗枯病菌精准快速鉴别。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种用于检测水稻细菌性穗枯病的引物探针组合，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2所示；所述探针的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述探针修饰有荧光标记。

作为优选，所述探针核苷酸序列的5’端标记羧基荧光素(fam)，3’端标记bhq1。

本发明还提供了所述的引物探针组合在检测水稻细菌性穗枯病菌中的应用。

所述应用为利用dna引物扩增dna模板的方法，本领域技术人员可以采用本发明的引物对和探针选用适宜的pcr进行检测，如荧光定量pcr或数字pcr。检测的结果说明样品中是否含有特定的dna片段，检测的对象可以是提取纯化的dna、细菌菌体、含有细菌或细菌dna的样品(如植物组织、种子等)。

作为优选，所述应用包括：以待测样品dna为模板，利用所述的引物探针组合进行荧光定量pcr或数字pcr扩增反应，进而对扩增结果进行判断。

本发明还提供了所述的引物探针组合在制备用于检测水稻细菌性穗枯病菌的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种利用数字pcr检测水稻细菌性穗枯病菌的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组dna；

(2)以提取的基因组dna为模板，利用权利要求1或2所述的引物探针组合，进行数字pcr扩增反应；

(3)检测pcr扩增产物，利用阈值线来判定反应结果，低于阈值线的微滴判断为阴性，高于阈值线的微滴判定为阳性，存在阳性微滴则表明待测样品中携带水稻细菌性穗枯病菌，否则表明待测样品中不含水稻细菌性穗枯病菌。

步骤(2)中，首先配置pcr反应液，再与数字pcr液滴生成油在微滴生成板中制备成反应微滴体系，进而进行pcr扩增。

作为优选，以每20μl计，pcr反应液组成为：2×hqddpcrmastermixforprobe10μl，10μm的上、下游引物各1μl，10μm的探针0.5μl，基因组dna1μl，ddh2o补足。

作为优选，数字pcr扩增反应的程序为：1)60℃液滴稳定平铺5min；2)95℃预变性5min；3)94℃变性30s；63℃退火及延伸45s，共40个循环。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明设计和筛选针对水稻细菌性穗枯病菌burkholderiaglumae特异性的引物和探针，与洋葱伯克氏菌burkholderiacepacialmg1222、伯克氏菌burkholderiaseminalisr456、越南伯克氏菌burkholderiavietnamiensisos13、双向伯克氏菌burkholderiaambifariaos40，以及水稻上常发性的细菌病害水稻白叶枯菌xanthomonasoryzaepv.oryzaepxo99a^t、水稻细菌性条斑病菌xanthomonasoryzaepv.oryzicolars105^t、水稻细菌性褐条病菌acidovoraxoryzaecgmcc1.1728^t以及水稻细菌性基腐病菌dickeyazeae7均无交叉反应，具有良好的特异性，灵敏度高(在20μl的反应体系中，灵敏度可达12拷贝)。

(2)本发明通过对引物和探针以及反应体系和反应条件的优化，建立了可对水稻细菌性穗枯病菌实现准确定量的数字pcr检测方法，可应用于市售田间水稻种子的检测，尤其是针对带菌量低的水稻种子样品，该方法可以实现高效的绝对定量检测，具有重要的应用价值。

附图说明

图l为实施例3的特异性实验结果，其中1a为burkholderiaglumaeos48，1b为burkholderiaglumaeos12，1c为burkholderiaglumaeos15，1d为burkholderiacepacialmg1222，1e为burkholderiaseminalisr456，1f为burkholderiavietnamiensisos13，1g为burkholderiaambifariaos40，1h为xanthomonasoryzaepv.oryzicolars105^t，2a为xanthomonasoryzaepv.oryzaepxo99a^t，2b为acidovoraxoryzaecgmcc1.1728^t，2c为dickeyazeae7，2d为空白对照。

图2为实施例4的灵敏度实验结果，其中1a-1f通道代表的浓度分别为0.9ng/μl，0.09ng/μl，9pg/μl，0.9pg/μl，0.09pg/μl，9fg/μl，1g为空白对照。

图3为实施例5中检测水稻种子实验结果，其中1a为带菌水稻种子样品，1b为健康水稻种子样品，1c为空白对照。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中涉及的实验仪器及试剂：

细菌基因组dna提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；数字pcr相关反应试剂耗材和sniper数字反应系统(sniperdq-24)均为思纳福医疗科技(苏州)有限公司的产品，数字pcr反应所需的试剂耗材包括2×hqddpcrmastermixforprobe、专用移液枪头、专用4孔pcr板和液滴生成油；八连管购自爱思进生物技术(杭州)有限公司。

实施例1

特异性引物筛选及探针设计

通过文献搜集及pcr验证，找到一对水稻细菌穗枯病菌的引物bg1f/bg1r，利用integrateddnatechnologies的在线引物设计工具primerquesttool在水稻穗枯病菌rhs家族基因序列(genbank登录号237878396)上设计引物探针bg1f/r/p，特异性引物及探针组序列：

上游引物bg1f：5'-ccgcgctgttcatgagggataa-3'；

下游引物bg1r：5'-cgggcggaacgacggtaagt-3'；

特异性探针bg1p:5'-fam-acaacaaccctgagggcacttgcgga-bhq1-3’。

具体生产引物的公司为擎科生物技术(杭州)有限公司，生产探针的公司为生工生物工程(上海)股份有限公司。

实施例2

水稻细菌性穗枯病菌数字pcr检测方法的建立

1)用八连管配制反应体系20μl：10μl的2×hqddpcrmastermixforprobe，10μm的上、下游引物各1μl，10μm特异性探针0.5μl，1μl基因组dna，ddh2o补足至20μl。空白对照中的基因组dna用ddh2o代替。

2)放置数字pcr反应所需耗材：sniper-dq24数字pcr仪耗材主要有专用移液枪头、专用4孔pcr板和液滴生成油，具体操作顺序和步骤为：首先取出仪器中的样本架和耗材压盖，在仪器中放置专用4孔pcr板和配套的密封盖，接着放置枪头盒并在反应用油孔中倒入25ml的液滴生成油。

3)放置预混液：完成步骤2)后，去掉步骤1)中装有反应体系的八连管的密封盖，将配制好的反应体系转移到样本架上，进行pcr扩增反应。

4)设置反应程序：反应程序：60℃液滴稳定平铺5min；95℃预变性5min；94℃变性30s；63℃退火及延伸45s，共40个循环，反应运行时间1.5h-2h。

5)结果查看：仪器通过分析散点图确定荧光阈值限并自动确定阴性微滴和阳性微滴。然后进行如下判断：如果待测样品产生阳性微滴信号，则待测样品含有水稻细菌性穗枯病菌；如果待测样品不产生阳性微滴信号，则待测样品不含有水稻细菌性穗枯病菌。

实施例3

水稻细菌性穗枯病菌数字pcr检测的特异性验证

供试菌株：颖壳伯克氏菌burkholderiaglumae的目标菌株3株，分别为：burkholderiaglumaeos48，burkholderiaglumaeos12，burkholderiaglumaeos15均由本实验室保存；

对照菌株8株，分别为：洋葱伯克氏菌burkholderiacepacialmg1222，伯克氏菌burkholderiaseminalisr456，越南伯克氏菌burkholderiavietnamiensisos13和双向伯克氏菌burkholderiaambifariaos40均由本实验室保存，水稻细菌性条斑病菌xanthomonasoryzaepv.oryzicolars105^t由上海出入境检验检疫局赠送，水稻白叶枯菌xanthomonasoryzaepv.oryzaepxo99a^t由南京农业大学赠送，水稻细菌性褐条病菌acidovoraxoryzaecgmcc1.1728^t购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，水稻细菌性基腐病菌dickeyazeae7由上海出入境检验检疫局赠送。

1)制备模板：选取3株burkholderiaglumae的目标菌株和8株对照菌株，在固体丰富培养基上培养细菌，挑取测试菌株长成的单菌落，用10μl无菌纯水悬浮菌体，取1μl菌悬液作为pcr反应的模板。或在液体丰富培养基中培养细菌，从菌体中提取细菌基因组dna，用紫外分光光度计检测dna在260nm和280nm处的吸收值，评价所提取dna的质量，计算dna的浓度，储存在-20℃备用。

2)数字pcr扩增：按照实施例2方法进行特异性检测。实验结果见图1(1a为burkholderiaglumaeos48，1b为burkholderiaglumaeos12，1c为burkholderiaglumaeos15，1d为b.cepacialmg1222，1e为b.seminalisr456，1f为burkholderiavietnamiensisos13，1g为burkholderiaambifariaos40，1h为xanthomonasoryzaepv.oryzicolars105^t，2a为xanthomonasoryzaepv.oryzaepxo99a^t，2b为acidovoraxoryzaecgmcc1.1728^t，2c为dickeyazeae7，2d为空白对照)。

结果表明，仅burkholderiaglumae的菌株产生阳性微滴，其它菌株和空白对照均不产生阳性微滴(此时作为判定的阈值为13361，低于阀值的微滴仪器判断为阴性，高于阀值的微滴仪器判断为阳性)，表明该引物探针组的特异性好，适用于水稻细菌性穗枯病菌的检测。

实施例4

水稻细菌性穗枯病菌数字pcr检测的灵敏度验证

将浓度为9ng/μl的burkholderiaglumaeos48基因组dna用无菌去离子水以10倍系列稀释6个稀释度，从0.9ng/μl开始，各取1μldna溶液为模板进行数字pcr扩增反应，扩增体系及程序如实施例2。

结果见图2(1a-1f通道代表的浓度分别为0.9ng/μl，0.09ng/μl，9pg/μl，0.9pg/μl，0.09pg/μl，9fg/μl，1g为空白对照)，表明1a-1e通道随着dna浓度逐级递减，阳性微滴的数量也逐级递减，检测下限为0.09pg/μl，dna稀释液1f和空白对照1g均不产生阳性微滴(此时作为判定的阈值线为23000，低于阈值线的微滴仪器判断为阴性，高于阈值线的微滴仪器判断为阳性)。根据数值分析，20μl反应体系中的灵敏度可达到12拷贝。

实施例5

人工模拟水稻种子数字pcr检测

将水稻细菌性穗枯病菌在na培养基上划线培养，挑取单菌落于na液体培养基中，30℃、220rpm/min条件下过夜震荡培养，利用分光光度计测定菌液od600＝0.8时，菌悬液的浓度为10⁸cfu/ml(连续平板稀释法测定)，用浓度为10⁸cfu/ml的菌悬液浸泡健康水稻种子2h，倒掉菌悬液后，将带菌种子室温风干，用无菌水浸泡研磨，以健康水稻种子的浸出液为对照，各取1μl，按照实施例2方法进行水稻种子检测，实验结果见图3(1a为带菌水稻种子样品，1b为健康水稻种子样品，1c为空白对照)。

结果表明，仅1a带菌水稻种子样品产生阳性微滴，健康水稻种子样品和空白对照均不产生阳性微滴(此时作为判定的阈值线为29000，低于阈值线的微滴仪器判断为阴性，高于阈值线的微滴仪器判断为阳性)。表明上述检测水稻细菌性穗枯病的引物探针组特异性高，适用于水稻种子样品的检测。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种用于检测水稻细菌性穗枯病菌的引物探针组合及应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccgcgctgttcatgagggataa22

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cgggcggaacgacggtaagt20

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

acaacaaccctgagggcacttgcgga26