一株利用1,4-丁二醇产单鼠李糖脂的基因工程菌及其应用

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株利用聚氨酯塑料解聚产物1,4-丁二醇产单鼠李糖脂的恶臭假单胞菌基因工程菌。

背景技术：

废塑料可以经化学或生物法解聚，将长链聚合物分解为低分子量的低聚物或单体。利用生物转化技术，这些低聚物或单体可以进一步同化为微生物细胞或代谢为二氧化碳。根据循环经济原理，这些解聚产物可通过特定的代谢途径用于高价值化学品的生物合成，这可被视为增值塑料废物的一种方法。pu塑料是由异氰酸酯、多元醇和扩链剂三种组分缩合而成的含有氨基甲酸酯键重复单元结构的聚合物。pu塑料广泛用于医疗，汽车和工业领域。截止2015年，pu的全球产量达到2700万吨，所产生的废塑料垃圾对环境也产生了巨大的破坏。目前，pu塑料可经过化学或生物法解聚为一些塑料单体，其中1,4-丁二醇是聚氨酯的主要解聚产物之一。

鼠李糖脂作为一种高效的生物表面活性，可以显著降低界面表面张力，乳化性能优异，已在化工，医药，化妆，石油后期采收和环境污染治理等行业中获得广泛的应用。铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)是研究的最多的鼠李糖脂产生菌，可以在疏水性底物例如植物油上生长，其鼠李糖脂生产机制明晰。但是，铜绿假单胞菌又名绿脓杆菌，是一种人体机会性致病菌，会带来一系列的安全问题，不能大规模工业化应用。当前，鼠李糖脂的生产主要利用植物油、葡萄糖等相对昂贵的物质作为底物，而1,4-丁二醇是废弃塑料聚氨酯的主要解聚产物之一，成本低廉。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供利用1,4-丁二醇产单鼠李糖脂的基因工程菌。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用1,4-丁二醇产单鼠李糖脂的基因工程菌，所述基因工程菌通过在宿主菌中表达铜绿假单胞菌来源的鼠李糖脂合成相关基因簇rhlirba获得；所述宿主菌分类命名为恶臭假单胞菌（pseudomonasputida）nb10，保藏号为cctccno：m2021482；所述基因簇rhlirba的核苷酸序列如seqidno：1所示。

进一步的，所述基因簇rhlirba构建在质粒pbbrmcs-5上。

本发明的另一目的在于提供上述基因工程菌的构建方法，包括：

（1）根据基因簇rhlirba序列设计引物，以铜绿假单胞菌基因组dna为模板，扩增出rhlirba全序列，酶切一步克隆方式插入质粒，获得表达质粒；

（2）制备宿主菌电转感受态，将表达质粒电转至宿主菌电转感受态细胞中，获得所述恶臭假单胞菌基因工程菌。

进一步的，所述基因簇rhlirba构建在质粒pbbrmcs-5上，酶切位点为saci和ecori；在正向引物f和反向引物r的5’分别引入26bp的同源臂：

f：5’-gactcactatagggcgaattggagctcccgtcctgtgaaatctggca-3’；

r：5’-cggtatcgataagcttgatatcgaattcgagcatgcggcaggagaagcg-3’。

本发明的再一目的在于提供上述基因工程菌在产单鼠李糖脂中的应用。

本发明所述基因工程菌能够以聚氨酯塑料解聚产物1,4-丁二醇为碳源发酵。

所述基因工程菌在添加庆大青霉素的种子培养基中进行种子培养。

进一步的，所述基因工程菌在180-200rpm、ph7.0-7.5、30℃条件下发酵培养。

进一步的，所述基因工程菌所产鼠李糖脂为单鼠李糖脂。

进一步的，所述基因工程菌发酵培养的培养基组分为：1,4-丁二醇5.4g/l，磷酸氢二钠6.78g/l,磷酸二氢钾3g/l，氯化钠0.5g/l，氯化铵1g/l，氯化钙100μm/l，硫酸镁2mm/l，硫酸铁40μm/l。

本发明对野生型恶臭假单胞菌kt2440经诱变筛选和培养基复筛获得了一株能在以1,4-丁二醇为唯一碳源的培养基中快速生长的菌株nb10，并在nb10中导入来自铜绿假单胞菌kt1115的rhlirba基因簇，获得了一株可以聚氨酯塑料解聚产物1,4-丁二醇为唯一碳源产生鼠李糖脂生物表面活性剂，且只产生单鼠李糖脂（rha-c10-c10），原始铜绿假单胞菌合成的是成分复杂的单双鼠李糖脂混合物。

本发明的有益效果在于：（1）获得了一株恶臭假单胞菌基因工程菌，实现了恶臭假单胞菌以聚氨酯塑料解聚产物1,4-丁二醇为底物生产鼠李糖脂，且产物均为单鼠李糖脂；（2）恶臭假单胞菌为安全菌株，所述恶臭假单胞菌突变菌株提高了塑料解聚产物高值转化为鼠李糖脂过程的安全性；同时，距离废弃聚氨酯塑料的生物高值化利用更进一步。

附图说明

图1为恶臭假单胞菌工程菌nb10-pbbrmcs5-rhlirba以1,4-丁二醇（bdo）为唯一碳源发酵产鼠李糖脂（rls）结果图。

图2为铜绿假单胞菌kt1115、恶臭假单胞菌工程菌nb10-pbbrmcs5-rhlirba发酵产物薄层色谱（tlc）分析图。

本发明所述的生物材料，其分类命名为恶臭假单胞菌（pseudomonasputida）nb10，已于2021年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏号为cctccno：m2021482nb10，保藏地址：中国武汉。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明所提供的方法予以进一步的说明，但本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其它任何公知的改变。

实施例1

本实施例具体说明恶臭假单胞菌（pseudomonasputida）nb10的筛选方法。

artp诱变

在常温常压条件下，artp装置采用等离子体发生器，通过金属电极结构实现氦气的稳定辉光放电，产生的等离子体对受体菌的基因造成损伤并诱导其突变。

将恶臭假单胞菌kt2440在lb固体培养基上划线，30℃培养18h，挑取单菌接种于5ml液体lb试管中，30℃，200r/min振荡培养过夜。4℃，5000r/min离心10min，以无碳源的m9培养基重悬，按3%的接种量接种于50ml含有3.6g/l葡萄糖的m9液体摇瓶中，30℃，200r/min，振荡培养至对数期。

将上述菌液，用生理盐水（0.85%）稀释至od600=1，在无菌金属平板上将10μl菌液均匀涂布并用无菌风吹干，然后将金属板放入artp中，设定参数进行菌株诱变。

突变株初筛：经artp诱变之后，将金属平板浸入含生理盐水（0.85%）封闭管中，漩涡振荡3-5min后，将含有菌液的无菌生理盐水稀释并涂布于含有1.8g/l1,4-丁二醇的m9平板培养基，30℃，平板培养24h。将生长的菌株转点至新的含有1.8g/l1,4-丁二醇的m9平板培养基上，连续传代10次。

菌株复筛：挑取传代10次后的单菌落接种到50ml液体lb摇瓶中，30℃，200r/min，振荡培养12h。将菌液4℃，5000r/min离心10min，无碳源的m9液体培养基重悬，接种于250ml装有50ml含有1.8g/l1,4-丁二醇的m9培养基摇瓶，培养24h后，检测各个菌株的生长及1,4-丁二醇消耗性能，筛选最优菌株。

lb固体培养基配方为：酵母粉0.5g/l、蛋白胨1.0g/l、nacl1.0g/l、琼脂粉1.5g/l，加水补足体积；lb培养基配方为：酵母粉0.5g/l、蛋白胨1.0g/l、nacl1.0g/l，加水补足体积。121℃高压湿热灭菌15分钟。

m9发酵培养基配方为：磷酸氢二钠6.78g/l,磷酸二氢钾3g/l，氯化钠0.5g/l，氯化铵1g/l，氯化钙100μm/l，硫酸镁2mm/l，硫酸铁40μm/l。121℃高压湿热灭菌15分钟。

m9平板培养基配方为：磷酸氢二钠6.78g/l,磷酸二氢钾3g/l，氯化钠0.5g/l，氯化铵1g/l，氯化钙100μm/l，硫酸镁2mm/l，硫酸铁40μm/l，琼脂粉1.5g/l。121℃高压湿热灭菌15分钟。

实施例2恶臭假单胞菌工程菌构建方法

1、鼠李糖脂合成关键基因的克隆

根据鼠李糖脂合成相关的基因簇（rhlirba）序列设计引物，正向引物为5’-gactcactatagggcgaattggagctcccgtcctgtgaaatctggca-3’，引物5’端引入26bp同源臂（pbbrmcs-5中saci酶切位点上游，下划线标出）；5’-cggtatcgataagcttgatatcgaattcgagcatgcggcaggagaagcg-3’，引物5’端引入26bp同源臂（pbbrmcs-5中ecori酶切位点下游，下划线标出）。以铜绿假单胞菌p.aeruginosakt1115基因组dna为模板，扩增出鼠李糖脂合成相关的基因簇（rhlirba）全序列。rhlirba核昔酸序列如seqidno：1所示。

2、鼠李糖脂生产质粒的构建

所用表达质粒载体为pbbrmcs-5。将pbbrmcs-5质粒进行双酶切（ecori-hf，saci-hf，购自南京伟沃生物科技有限公司），使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司clonexpress®iionestepcloningkit非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒，将rhlirba连接到载体pbbrmcs5，将其转化到e.colidh5α感受态细胞中。e.colidh5α感受态细胞购自南京良纬生物科技有限公司。菌落pcr筛选阳性克隆，提质粒送至北京擎科生物科技有限公司测序，测序正确后即得到e.colidh5α-pbbrmcs5-rhlirba。

3、鼠李糖脂合成恶臭假单胞菌工程菌的构建

制备恶臭假单胞菌nb10电转感受态细胞：从-80℃冰箱里取出p.putidanb10菌种，在没有添加抗生素lb固体培养基上划线，30℃倒置培养16-20h，挑取单菌落至5mllb液体培养基于30℃，200r/min摇床过夜培养；以1：100转接至含50mllb液体培养基的摇瓶中，30℃，200r/min摇床培养至od600nm=0.6~0.75，立即冰浴20min。用4℃离心机以5000r/min、10min收集菌体，用300mmm蔗糖洗涤液洗涤菌体3次。菌体浓缩300倍每100μl分装并用于一次转化。

将50ng上述1所得鼠李糖脂生产质粒加至恶臭假单胞菌nb10感受态细胞中，轻轻混匀，转移至预先遇冷的1mm内径的电转杯中，以1.2kv、200ω、25μf的条件电击转化。将900μl的soc混匀后加至1.5ml聚丙烯离心管，以30℃，200r/min摇床培养1h.菌体以10^-3倍稀释涂布在庆大霉素的终浓度为30mg/l的lb固体培养基上，30℃倒置过夜培养。

得到合成鼠李糖脂的恶臭假单胞菌基因工程菌株nb10-pbbrmcs5-rhlirba。

实施例3产鼠李糖脂恶臭假单胞菌工程菌发酵验证

1、发酵过程控制

将菌株在含30mg/l庆大青霉素的lb固体培养基上划线，30℃培养18h。挑取恶臭假单胞菌工程菌nb10-pbbrmcs5-rhlirba单菌接种于5ml含30mg/l庆大青霉素的液体lb试管中，30℃，200r/min振荡培养过夜后，按1%的接种量接种于50ml含30mg/l庆大青霉素的液体lb摇瓶中，30℃，200r/min，振荡培养至对数期。

lb固体培养基配方为：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l、琼脂粉15g/l，加水补足体积；lb培养基配方为：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l，加水补足体积。

将上述培养好的菌种按体积比5%的接种量接种入500ml装有100ml发酵培养基的摇瓶中，并添加庆大青霉素（30mg/l），30℃，200r/min振荡培养92-96h，得到发酵液。

发酵培养基配方为：1,4-丁二醇5.4g/l，磷酸氢二钠6.78g/l,磷酸二氢钾3g/l，氯化钠0.5g/l，氯化铵1g/l，氯化钙100μm/l，硫酸镁2mm/l，硫酸铁40μm/l。

以上摇瓶发酵均设一式三份进行实验。

2、发酵液中鼠李糖脂的提取

将上述步骤1中收集的发酵液于低温高速离心机4℃，10000r/min离心20min，取上清液，用hc1溶液调节上清液ph至1.0-2.0，静置于4℃冰箱过夜；低温高速离心机4℃，10000r/min离心20min，取沉淀，并用ph2.0的盐酸溶液洗涤沉淀3次，用3ml氯仿：乙醇（2:1，v/v）萃取3次，合并收集有机相，干燥后得到粉末为发酵产物的粗提物，用于tlc和lc-ms测定。

3、发酵液中鼠李糖脂的定性（tlc和lc-ms）

薄层色谱（tlc）初步确定发酵产物：上述3提取所得干燥的鼠李糖脂产物溶于乙酸乙酯，将5μl该溶液点在硅胶tlc板上。对照组为铜绿假单胞菌发酵液中提取的单双鼠李糖脂混合物，展开剂为氯仿：甲醇：乙酸（65：15：2），显色剂为80%（体积分数）的浓硫酸。将干燥的板在80℃下孵育30分钟，结果图2所示。

液质联用（lc-ms）确定发酵产物：流动相由a相(甲酸：甲醇=1:1000)和b相(甲酸：乙腈=1:1000)组成，流速：0.3ml/min；柱温：30℃，进样量0.3ul。梯度洗脱程序：0min，10%b；3min，10%b；33min，90%b；65min，90%b。hplc/q-t0f-ms系统使用esi离子源，在正离子模式下采集数据。离子采集范围：0-1000m/z。

结果表明，本发明中产鼠李糖脂的表达质粒能够实现在恶臭假单胞菌利用聚氨酯塑料解聚产物1,4-丁二醇产鼠李糖脂，所产鼠李糖脂为单鼠李糖脂。

4、鼠李糖脂的定量检测

采用蔥酮-硫酸法检测发酵液中鼠李糖脂的浓度，具体操作如下：精确称取0.20g蒽酮溶于100ml体积分数为80%的浓硫酸中，得蒽酮-硫酸溶液（避光，现配现用）。取0.5ml适当稀释后的样品待测液在冰浴中加入2ml蒽酮-硫酸溶液，充分混合，再沸水浴10min后，取出放入冰水浴冷却至室温。控制紫外吸收波长为620nm，利用酶标仪测试反映液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，空白组用蒸馏水做对照。

发酵液中鼠李糖脂含量为：1.12g/l。

结果表明，恶臭假单胞菌工程菌nb10-pbbrmcs5-rhlirba可利用氨酯塑料解聚产物1,4-丁二醇生产鼠李糖脂。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>南京工业大学

<120>一株利用1,4-丁二醇产单鼠李糖脂的基因工程菌及其应用

<130>xb21051902

<141>2021-05-19

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4206

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agcggcgtgctgcgcgtcgccaccactggcgactacaagcccttcagctaccgcacggaa60

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